סינתזה Tungstate נתרן, סודיום Molybdate מהמיקרו קפסולות באמצעות חיידקים הפרשה מינרלי

Summary

עבודה זו מציגה פרוטוקול לייצור סודיום tungstate, סודיום molybdate פרצת דרך חיידקים, חלקיקים המתאימים שלהם.

Abstract

אנו מציגים שיטה, הפרשה מינרלים חיידקי (BME), עבור סינתזה שני סוגים של מהמיקרו קפסולות, tungstate נתרן, סודיום molybdate חלקיקים של תחמוצות מתכת שני המתאימים — הראשון קטן כמו 22 ננומטר, ה-15 האחרון ננומטר. האכלנו שני זנים של חיידקים, אצות Shewanella , Pandoraea sp., עם ריכוזים שונים של יונים tungstate או molybdate. ריכוזי tungstate molybdate הותאמו כדי להפוך מהמיקרו קפסולות של יחס קוטר אורך שונה. מצאנו את זה גבוה יותר ריכוז היו חלקיקים קטן יותר חלקיקים הגיע עם שלושה יחס אורך קוטר: 10:1, 3:1 ו- 1:1, אשר הושגו על ידי האכלת את החיידקים בהתאמה עם ריכוז נמוך, בינוני ריכוז, ריכוז גבוה. התמונות של מהמיקרו קפסולות חלול צולמו דרך הסריקה אלקטרון ננו-ספירה (SEM). מבנים קריסטל שלהם אומתו על ידי רנטגן עקיפה (XRD) – מבנה הגביש מהמיקרו קפסולות molybdate נה₂MoO₄ וזה של tungstate מהמיקרו קפסולות נה₂WO₄ עם נה₂W₂O₇. כל אלה syntheses היו נעשה בתנאי הסביבה ליד.

Introduction

חלקיקי תחמוצת מתכת מנוצלים עבור משלוח סמים¹, בניית עצמות מלאכותיות², זרז הטרוגנית³, פליטת שדה^4,5, תאים סולריים⁶, גז חיישנים⁷, ו סוללות ליתיום⁸. עבור יישומים מעשיים, חוזק מכני רב, nanocrystals והן שלהם מיקרו מכריעים בין מזערים, מעטפת חלולה מבנים יכול לשמש ליצירת חומרים קלים, חזקים מכנית⁹. בין מבני מעטפת חלולה, צורה כדורית ידוע להיות נוקשה יותר מאשר צורת אליפסואידי; לאחרון יש יחס אורך קוטר גדול יותר מאשר לשעבר^10,11. עבודה זו מתארת עבור סינתזה מהמיקרו קפסולות כדורית באמצעות חיידקים עם שיטה רעיל תחת תנאי הסביבה, אשר בניגוד שיטות אלטרנטיביות, כולל את התבנית סינתזה שיטת¹², פרוטוקול שיטת סינתזה אולטראסוניות ספריי-בסיוע¹³ , שיטת הידרותרמי¹⁴. חלק שיטות אלטרנטיביות דורשים תבניות¹², קצת חום כמו גבוה כמו 500 ° C¹³, ובעתיד גבוה לחץ¹⁴. לגבי המבנה שנוצר, שיטת סינתזה תבנית ניצול התבנית שמרים מביא על מבנה ליבה-קליפה¹⁵, במקום אחד עם קיר בודד, זה ניצול התבנית e. coli מייצר מבנה עם היחס בין אורך קוטר 1.7:0.8, אינה כדורית. ¹⁶.

בעבודה זאת, עשינו מהמיקרו קפסולות של תחמוצת מתכת עם קיר בודד ועל צורה כדורית תחת תנאי הסביבה על ידי ניצול חיידקי חילוף החומרים. בחיידקיים גליקוליזה, תהליך כימי מעכל מקורות פחמן, כמו גלוקוז ללקטוז, מקורות פחמן נחשבים להיות המקור של הפחתת הכוח שנוצר בו. אנחנו מניפולציות חיידקי חילוף החומרים על-ידי התאמת את הריכוז של פחמן מקורות כדי להשיג את הקצוות הרצוי. שיטה זו היא ידידותיים לסביבה, באמצעות סוכנים רעיל וצורכים הרבה פחות חשמל חשמל. לבסוף, שיטה זו מאפשרת ייצור המוני של מהמיקרו קפסולות פשוט על ידי הגדלת הנפח של מרק בשר.

לפני השיטה, היו עוד שתי שיטות ניצול חיידקי חילוף החומרים כדי להפוך מינרלים: ביולוגית הנגרמת מינרליזציה (בים בם)¹⁷ ו ביולוגית מבוקרת מינרליזציה (BCM)¹⁸. לא בים ולא BCM יכול לשמש להכנת נתרן מהמיקרו קפסולות tungstate tungstate ו- molybdate כמו התהליך שלנו, אשר מיועדת כמו חיידקים הפרשה מינרלי (BME)¹⁹. בניסוי זה, צורת מהמיקרו קפסולות יכול להיות נשלט לקיים יחס אורך קוטר של 10:1 ל- 1:1, ואת הגודל של ננו-חלקיק grains המהווים הקליפות יכול להיות מותאם הנע בין 15 ננומטר עד 110 ננומטר.

Protocol

התראה: השתמש כפפות גומי, מגן משקפיים, מעיל מעבדה לביצוע הניסוי. בכל פעם שאתה משתמש הקבינט אבטחה, תדליק את המאוורר ארון ולשמור את. דלת הארון עצומות למחצה.

1. הכנת חרוזי זכוכית

1. מקום 100 חרוזי זכוכית של 3 מ מ קוטר בקבוק 100-mL מעבדה ולאחר מכן מכסה אותה בחוזקה.
2. אוטוקלב התכנים ב 120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
3. . תשאיר את הבקבוק כדי להתקרר לטמפרטורת החדר, ואז למקם אותו אבטחה בארון

2. הכנת מרק Lysogeny (ליברות)

1. להמיס 8 גרם אבקת מרק LB-לנוקס בבקבוק 500-mL מעבדה עם 400 מ ל מים.
2. מערבבים את התוכן עם פס מגנטי PTFE מלהיב למשך 20 דקות ולאחר מכן מכסה אותה בחוזקה.
3. אוטוקלב התכנים ב 120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. להשאיר את פתרון להתקרר לטמפרטורת החדר ולמקם אותו אבטחה בארון.
5. באמצעות פיפטה, aliquot המרק לתוך צינורות 15-mL צנטריפוגה שמונה באבטחה ארון (12.5 מ ל כל אחד).
6. Aliquot מרק הנותרים לתוך שלושה בקבוקי מעבדה 100-מ באבטחה ארון (100 מ ל כל אחד). שווי הבקבוקים שלושה בחוזקה. תשמרו על אבטחה הקבינט.

3. תרבות של אצות Shewanella

1. השתמש המתח cryopreserved deep-frozen.
2. ב אבטחה הקבינט, לבחור 1 מ"ל של החומר קפואים קפואים ברכבת התחתית עם מרית פלדת ומקם אותה לתוך שפופרת צנטרפוגה מוכן בשלב 3.5.
3. דגירה התרבויות במשך 24 שעות ביממה בחממה 37 ° C.

4. הכנת צלחות פטרי LB-לנוקס (מרק עם אגר)

1. להמיס שתי טבליות של LB-לנוקס (מרק עם אגר) לתוך בקבוק 100-mL מעבדה עם 100 מ ל מים.
2. מערבבים את התוכן עם פס מגנטי PTFE מלהיב במשך 20 דקות, ואז מכסה אותה בחוזקה.
3. אוטוקלב התכנים ב 120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. אבטחה הקבינט, aliquot ביד 100 מ של פתרון 4 פטרי, הבטחת כל אחד לקבל ~ 25 מ. להשאיר את הפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר.

5. הכנת Monoclonal חיידקים

1. ב אבטחה הקבינט, תווית הבקבוקים שלוש מוכן בשלב 2.6, #1, #2 ו #3, בהתאמה.
2. פיפטה 0.1 מ"ל של ההשעיה חיידקי תוצאות בשלב 3.3 לתוך הבקבוק #1. שווי הבקבוק, לנדנד אותה בעבודת יד 1 דקות לקבל פתרון הומוגני.
3. פיפטה 0.1 מ"ל של הנוזל חיידקי תוצאות בשלב 5.2 לתוך הבקבוק #2. שווי הבקבוק, לנדנד אותה בעבודת יד 1 דקות לקבל פתרון הומוגני.
4. פיפטה 0.1 מ"ל של הנוזל חיידקי תוצאות בשלב 5.3 לתוך הבקבוק #3. שווי הבקבוק ולנער אותו באופן ידני עבור 1 דקות לקבל פתרון הומוגני.
5. Pipette את הנוזל בבקבוק #3 4 פטרי מוכן בשלב 4.4, באמצעות אמצעי אחסון של 0.02 נקודות מ ל כל אחד.
6. לשים את חרוזי זכוכית שהוכנו בשלב 1.3 4 פטרי בשימוש, 4 חרוזים בכל מנה.
7. סגור את המכסים של צלחות פטרי, לנער אותם בעבודת יד 1 דקות.
8. הפוך את צלחות פטרי, דגירה ב חממה 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.

6. כפל של חיידקים Monoclonal

1. תביא צינורות 7 מוכן בשלב 2.5.
2. בחרי את החיידקים monoclonal הנובעת מן פטרי 4 מוכן בשלב 5.8 עם פלדת אל-חלד-מרית, ולשים אותם לתוך צינורות 7 בנפרד.
3. השאירו את צינורות 7 חממה 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
4. לבחור עם פיזור האור הגדול בשיטה visual ערכי צבע מוחלטים.

7. הכנת מרק LB-לנוקס עם גלוקוזה ומלח

1. לשים 10 גר' מרק LB-לנוקס, 10 גרם של NaCl ו 10 גרם של גלוקוז לתוך בקבוק 500-mL מעבדה. מוסיפים מים עד האחסון מגיע 450 מ.
2. מערבבים את התוכן עם פס מגנטי PTFE מלהיב כעשרים דקות.
3. אוטוקלב התכנים ב 120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

8. הכנת נתרן Tungstate

1. שים 16.5 גר' נתרן Na Tungstate₂WO₄.2H₂O לתוך בקבוק 100-mL מעבדה עם מרית פלדת. מוסיפים מים עד האחסון מגיע 50 מ.
2. מערבבים את התוכן עם פס מגנטי PTFE מלהיב כעשרים דקות.
3. אוטוקלב התכנים ב 120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. אבטחה הקבינט, מקבלים פילטרט של דרך מסנן ואקום פיברגלס עם נקבוביות 1 מיקרומטר.

9. הכנת ליברות עם גלוקוז, מלח נתרן Tungstate

1. ב אבטחה הקבינט, שופכים את פילטרט של צבר בשלב 8.4 בעבודת יד בתוך תמיסת גלוקוז, מלח מוכן בשלב 7.3.
2. בארון אבטחה, aliquot עם פיפטה הפתרון הנובעת 500 מ"ל בשלב 9.1 לתוך צינורות צנטריפוגה 10 x 50 מ"ל.

10. התרבות של חיידקים

1. ב אבטחה הקבינט, תביא את הנוזל המוכנים בשלב 6.4, aliquot זה פיפטה לתוך צינורות הבדיקה 10 מוכן בשלב 9.2, עם כל שפופרת קבלת 0.05 mL.
2. דגירה הצינורות 10 ב חממה 37 ° C עבור 120 h.

11. הקציר של מינרלים BME

1. Ultrasonicate כל אחד הצינורות 10 בשלב 9.2 ב-20 קילו-הרץ עם 150 W עבור 1 h.
2. Centrifuge הצינורות ב g x 2,025 לשעה.
3. להסיר את נוזל שקוף את החצוצרות שלה עם פיפטה, להוסיף מים ולאחר מכן חזור על שלבים 11.1 ו- 11.2 עוד פעם אחת.
4. להסיר את נוזל שקוף את החצוצרות שלה עם פיפטה, להוסיף אלכוהול, ואז ultrasonicate אותם ב-20 קילו-הרץ עם 150 W עבור 1 h.
5. Centrifuge הצינורות ב g x 2,025 לשעה.
6. חזור על שלבים 11.4 ו 11.5 עוד פעם אחת
7. קציר BME מינרלים על-ידי הסרת נוזל נקה את החצוצרות שלה עם פיפטה; לאחר מכן, מיד קאפ הצינורות מבלי להפעיל כל תהליך הייבוש.

12. נדנוד טמפרטורה עם Pandoraea sp. , Molybdate

1. תרבות Pandoraea sp. באותו אופן כמו שלבים 2, 3, 4, 5 ו 6 עבור אצות Shewanella. התוצאה של שלב זה מקביל לזה של שלב 6.4.
2. למרק ליברות עם גלוקוזה ומלח באותו אופן כמו שלבים 7, 8 ו- 9, פרט לכך 16.5 גר' נתרן tungstate בשלב 7.1 מוחלף 12 גר' נתרן molybdate, נה₂MoO₄ · 2H₂O. התוצאה של שלב זה מקביל לזה של שלב 9.2.
3. ב אבטחה הקבינט, להביא הנוזל המבושלות צעד 12.1, aliquot אותו עם פיפטה לתוך הצינורות 10 מוכן בשלב 12.2, עם כל צינור mL 0.05 המקבל.
4. דגירה הצינורות 10 בשלב 12.3 בטמפרטורה נדנוד עבור 120 ש ח בחודש הדדיים רועד אמבט, נדנוד הטמפרטורה 5 פעמים בין 25 ° C ל- 37 מעלות צלזיוס, עם כל חום שנמשך 12 שעות.

תוצאות

איור 1 מראה מקורי מהמיקרו קפסולות כדורית. שני שני זנים של החיידק, אצות Shewanella ו- Pandoraea sp., במקור יש יחס אורך קוטר של 3:1. להשגת יחס אורך קוטר של 1:1, ריכוז גבוה (> 100 מ מ) של מתכת oxyanions נדרשת. ריכוז נמוך (< 5 מ מ) של oxyanions יכול לגרום אורך של יחס קוטר של 10:1, כמו כי איור 2, אשר עלולים להיגרם כתוצאה זרם של oxyanions, חסימת ביקוע בינארי של חיידקים. לבסוף, להשגת יחס אורך קוטר של 3:1, ככה איור 3, נדרש ריכוז בינונית (~ 20 מ מ) של oxyanions. היווצרות של פגזים כדורית, עם יחס אורך קוטר של 1:1, ייתכן הביא על ידי כונני חיידקי לגרום לעצמם לכווץ שלהם שטח כדי לאזן את הצריכה של oxyanions תוך כדי לשדר oxyanions דרך קרום התא. שלושת נתוני מצביעים יחד על שהיחס בין אורך קוטר יכול לכוונן אותו בין 10:1 ל- 1:1 פשוט על-ידי התאמת את הריכוז של oxyanions.

איור 4 איור 5 מראים nanoparticle גרגרי נתרן molybdate בגדלים שונים: אחד קטן להיות 15 ננומטר ולאחר את nm 110 אחד גדול. שימו לב כי איור 5, על הפגזים שאינם נופצו, חלקיקים של 110 nm יכולים עדיין להיות כבולה אחד לשני, ויוצרים כדורים נקבובי. . השמן שהושג דרך נדנוד הטמפרטורה של מרק culturing 5 פעמים בין 25 ° C ל- 37 מעלות צלזיוס, עם כל חום שנמשך 12 שעות. במהלך תנודה טמפרטורה, גרגרים בגדלים שונים לא רק ניתן להפיק אבל גם לתחזק את מבנה מיקרו-כדורית, שבו אנחנו יכולים להכין מהמיקרו קפסולות עם גדלים תבואה שונים, מ-15 ננומטר עד 110 nm, רק על ידי שליטה הטמפרטורה מרק .

איור 6 מראה על הקיר שבור עם גרגרים גדולים יותר להישאר ליד הפתח של הקיר. עובי הקיר הוא 22 ננומטר, תבואה גדול הוא על 40-60 ננומטר. ההבדל בגודל אולי תוצאה של תהליכים מטבוליים שונים, אשר עדיין לא מזוהים.

איור 1: SEM התמונה של פגזים ככדור חלול עם יחס אורך קוטר של 1:1. מבנה זה היה עשוי tungstate נתרן מופרש על ידי אצות Shewanella עם גלוקוז כמקור פחמן. הודפס מחדש באישור מ ECS ג' של הפוליטיקה מצב מוצק, טכניים, 6(3), N3113 (2017). זכויות יוצרים 2017, האגודה אלקטרוכימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: תמונת SEM פגזי חלול פילמנט ארוך עם יחס אורך קוטר של 10:1. מבנה זה היה עשוי molybdate נתרן מופרש על-ידי Pandoraea sp. עם גלוקוז כמקור פחמן. הודפס מחדש באישור מ ECS ג' של הפוליטיקה מצב מוצק, טכניים, 6(3), N3113 (2017). זכויות יוצרים 2017, האגודה אלקטרוכימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: SEM תמונה שבורה פגזי חלול בצורת מוט עם יחס אורך קוטר של 3:1. מבנה זה היה עשוי tungstate נתרן מופרש על ידי אצות Shewanella עם גלוקוז כמקור פחמן. הודפס מחדש באישור מ ECS ג' של הפוליטיקה מצב מוצק, טכניים, 6(3), N3113 (2017). זכויות יוצרים 2017, האגודה אלקטרוכימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: SEM התמונה של נתרן נופצו molybdate פגזים עם תבואה חלקיקים בגודל של 15 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5: SEM התמונה של פגזים molybdate נופצו וניפצו הלא נתרן עם תבואה חלקיקים בגודל של 110 nm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6: תמונת SEM פגזי חלול שבור עם יחס אורך קוטר של 1:1. מבנה זה היה עשוי tungstate נתרן מופרש על ידי אצות Shewanella עם גלוקוז כמקור פחמן. גרגירים עם גודל על 40-60 ננומטר שמור מחוץ לשריון ליד חור גדול, בעוד המעטפת עצמו עשוי גרגירים עם גודל 22 ננומטר. הודפס מחדש באישור מ ECS ג' של הפוליטיקה מצב מוצק, טכניים, 6(3), N3113 (2017). זכויות יוצרים 2017, האגודה אלקטרוכימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

בנוגע העצמי-העקביות בתוצאות הניסוי, הכנה של כפל של חיידקים monoclonal הם קריטיים. את הניסוי הזה, שונה מן התבנית סינתזה ניסויים^15,16, מועסקים ביואקטיביות חיידקים גראם שליליים. כדי לקבל את קיר בודד, בחרנו prokaryotic חיידקים במקום האיקריוטים חיידקים כמו שמרים¹⁵. כדי להשיג עגול עם יחס אורך קוטר של 1:1, במקום גדול יותר יחס אורך קוטר¹⁶, האכלנו חיידקים עם ריכוז גבוה יותר של oxyanions לטפל בהם כדי לכווץ לתוך צורה כדורית, ביצוע מהמיקרו קפסולות עם קיר בודד, עגול, דק (< 30 ננומטר).

מאז BME מסתמך בעיקר על התאמת את הריכוז של oxyanions כדי לשלוט על חילוף החומרים של חיידקים, כולל שתי מגבלות. ראשית, הריכוז של oxyanions הוא מוגבל על ידי, המסיסות למרות הריכוז צריך להיות גבוה ככל האפשר. שיטות ההזנה השנייה, חיידקי ביותר יפסיקו בטמפרטורה מעל 45 מעלות צלזיוס או מתחת לגיל 5 ° C, בהתאמה הגבול העליון והגבול התחתון של הניסוי שלנו.

למרות מגבלות אלו שני, BME יש פוטנציאל גדול להכנת תחמוצת מתכת חומרים עניין פרקטי. לביסוס טענה זו, אנחנו הולכים לנסות בשיטה זו כדי להפוך זירקוניום מהמיקרו קפסולות של ברזל מהמיקרו קפסולות — לשעבר להיות מועמד טוב חומר מלאכותי העצמות ואת האחרון למשלוח סמים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB(Lennox)broth with agar tablets	Sigma-Aldrich	L7075	1 tablet for 50 mL broth with agar
LB (Lennox) broth	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) powder 1 kg
Dextrose anhydrous	Nihon Shiyaku Reagent	PL 78695	glucose
Sodium Tungstate	Nihon Shiyaku Reagent	PL 76050	Na2WO4 · 2H2O
Sodium Molybdate	Nihon Shiyaku Reagent	PL103564	Na2MoO4 · 2H2O
Sodium Chloride	Nihon Shiyaku Reagent	PL 68131	NaCl
Ethanol 99.5%	Acros organics	AC615090040	CH3CH2OH
Water	Made in our university		de-ionlized water
Autoclave	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipei City, Taiwan, ROC	TM-329	heat to 120 °C for 10 min
Centrifuge	Digit System Laboratory System, New Taipei City, Taiwan, ROC	DSC302SD	centrifuge at 2025 x g
-80 °C Refrigerator	Panasonic	MDF-U3386S	Use to deep-freeze cryopreserve strain
Ultrasonic Homogenizer Sonicator Processor Cell Disruptor	Lenox	UPS-150	frequency 20 KHz power 150 W
Incubator	Customer made	custom made	heat to 40 °C or cool to 18 °C with time cotrol
Reciprocal shaking baths	Kingtech Scientific Co., Ltd	WBS-L
Digital Stirring Hot Plate	Corning	#6797-620D	use with PTFE magnetic stirring bar
Biosafety cabinet	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	All bacteria related process are done here
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-6500F	SEM Images
50 mL centrifudge tube	Falcon	14-432-22
15 mL centrifudge tube	Falcon	14-959-53A
Laboratory bottle 100 mL	Duran	21 801 24 5
Laboratory bottle 500 mL	Duran	21 801 44 5
Stainless steel spatula	Chemglass	CG-1981-10
PTFE Disposable Stir Bars	Fisher	S68066
Plastic Petri Dishes	Fisher	S33580A
Shewanella algae	Courtesy of author #3	Courtesy of author #3
Pandoraea sp.	Courtesy of author #3	Courtesy of author #3