Synthese von Natrium-Wolframat und Natrium Molybdat Mikrokapseln über bakterielle mineralischen Ausscheidung

Zusammenfassung

Dieses Werk stellt ein Protokoll zur Herstellung Natrium Wolframat und Natrium-Molybdat-Mikrokapseln über Bakterien und ihre entsprechenden Nanopartikel.

Zusammenfassung

Präsentieren wir Ihnen eine Methode, die bakterielle mineralischen Ausscheidung (BME), zur Synthese von zwei Arten von Mikrokapseln, Natrium Wolframat und Natrium Molybdat und zwei Metalloxide entsprechende Nanopartikel – das ehemalige sein so klein wie 22 nm und die letzteren 15 nm. Wir fütterten zwei Bakterienstämme, Shewanella Algen und Pandoraea SP., mit verschiedenen Konzentrationen von Wolframat oder Molybdat-Ionen. Die Konzentrationen von Wolframat und Molybdat wurden angepasst, um Mikrokapseln von unterschiedlicher Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis machen. Wir fanden, dass je höheren den Konzentration, desto kleiner wurden die Nanopartikel. Die Nanopartikel kam mit drei Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis: 10:1, 3:1 und 1:1, die durch die Fütterung der Bakterien bzw. mit einer niedrigen Konzentration, eine mittlere Konzentration und eine hohe Konzentration erreicht wurden. Die Bilder der hohlen Mikrokapseln wurden per scanning Electron Mikrosphären (SEM). Ihre Kristallstrukturen wurden verifiziert durch Röntgendiffraktometrie (XRD) — die Kristallstruktur von Molybdat Mikrokapseln ist Na₂MoO₄ und das Wolframat Mikrokapseln sind Na₂WO₄ mit Na₂W₂O₇. Alle diese Synthesen wurden unter einer in der Nähe von Umgebungsbedingungen durchgeführt.

Einleitung

Metall-Oxid-Nanopartikel sind für Drug Delivery¹, Bau künstlicher Knochen², heterogene Katalyse³, Feldemission^4,5, Solarzellen⁶, Gas-Sensoren⁷, ausgebeutet und Lithium Batterien⁸. Für praktische Anwendungen die mechanische Festigkeit von Nanokristallen und ihre Mikrostruktur sind entscheidend. Hohlen Schalenstrukturen ist unter die Mikrostrukturen lässt sich leicht, mechanisch robusten Materialien⁹erstellen. Unter hohlen Schalenstrukturen ist eine Kugelform bekannt, mehr als ein Ellipsoid Form steif sein; Letzteres hat eine größeren Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis als die ehemaligen^10,11. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Synthese von sphärischer Mikrokapseln über Bakterien mit eine ungiftige Methode unter einer ambient-Bedingung mit der alternative Methoden kontrastiert, einschließlich der Vorlage Synthese Methode¹², Ultraschall-Spray-gestützte Synthese Methode¹³ und hydrothermale Verfahren¹⁴. Einige der alternativen Methoden erfordern Vorlagen¹², einige einer Temperatur so hoch wie 500 ° C¹³, und einige ein hohen Druck¹⁴. Für die resultierende Struktur die Vorlage-Synthese-Methode unter Verwendung der Hefe-Vorlage bringt eine Kern-Schale-Struktur¹⁵, anstatt mit einer einzelnen Wand und derjenige unter Verwendung der E. Coli-Vorlage produziert eine Struktur mit Verhältnis von Länge zu Durchmesser von 1.7:0.8, und ist nicht kugelförmig. ¹⁶.

In dieser Arbeit haben wir Metall-Oxid-Mikrokapseln mit einer einzelnen Wand und der Kugelform unter eine Umgebungsbedingung gemacht, durch die Ausnutzung von bakteriellen Stoffwechsel. In bakterielle Glykolyse, ein chemischer Prozess, der Kohlenstoffquellen wie Glukose und Laktose verstoffwechselt Kohlenstoffquellen gelten die Herkunft des reduzierenden darin erzeugten Stroms. Wir manipuliert bakteriellen Stoffwechsel durch Anpassung der Konzentration von Kohlenstoffquellen gewünschte Ziele zu erreichen. Diese Methode ist umweltfreundlich, ungiftig Agenten und verbrauchen viel weniger Strom. Zu guter Letzt ermöglicht diese Methode die Massenproduktion von Mikrokapseln einfach durch Erhöhung des Volumens der Brühe.

Vor der Methode wurden ein weiteres zwei Methoden, die Verwendung von bakteriellen Stoffwechsel um Mineralien machen: biologisch induzierte Mineralisierung (BIM)¹⁷ und biologisch kontrollierten Mineralisierung (BCM)¹⁸. BIM weder BCM kann verwendet werden, für die Herstellung von Natrium Wolframat und Molybdat Wolframat Mikrokapseln wie unser Prozess, der als die bakterielle mineralischen Ausscheidung (BME)¹⁹bezeichnet wird. In diesem Experiment kann die Form von Mikrokapseln kontrolliert werden, um ein Verhältnis von Länge zu Durchmesser von 10:1 bis 1:1 haben, und die Größe der Nanopartikel Körner, bilden die Schalen ist einstellbar von 15 nm bis 110 nm.

Protokoll

Achtung: Latex-Handschuhe, schützende Brillen und einen Laborkittel für die Durchführung des Experiments. Wenn das Biosafety-Kabinett zu benutzen, schalten Sie den Schaltschrank Lüfter und halten Sie die Schranktür halb geschlossen.

1. Vorbereitung von Glasperlen

1. 100 Glasperlen mit 3 mm Durchmesser in einer Flasche 100 mL Labor, und dann cap sie fest.
2. Autoklaven der Inhalt bei 120 ° C für 10 Minuten.
3. Lassen Sie die Flasche, um auf Raumtemperatur abkühlen, dann legen Sie sie in die Biosicherheit Kabinett.

2. Vorbereitung des Lysogeny Brühe (LB)

1. 8 g Pulver LB-Lennox Brühe in einen 500-mL-Labor-Flasche mit 400 mL Wasser auflösen.
2. Rühren Sie den Inhalt mit einer PTFE magnetischen Rührstab für 20 min und dann Kappe es fest.
3. Autoklaven der Inhalt bei 120 ° C für 10 Minuten.
4. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und legen Sie sie in die Biosicherheit Kabinett.
5. Mit Hilfe einer Pipette, aliquoten die Brühe in acht 15-mL-Zentrifuge Röhren in der Biosicherheit Kabinett (12,5 mL).
6. Aliquoten die restliche Brühe in drei 100 mL Laborflaschen im Kabinett der Biosicherheit (100 mL). Verschließen Sie die drei Flaschen fest. Bewahren sie die Biosicherheit Kabinett.

3. Kultur Shewanella Algen

1. Verwenden Sie die tiefgefrorene kryokonservierte Belastung.
2. Herausgreifen Sie in der Biosicherheit Kabinett 1 mL des gefrorenen Materials aus dem gefrorenen Rohr mit einem Spatel aus rostfreiem Stahl, und legen Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen in Schritt 3.5 vorbereitet.
3. Inkubieren Sie die Kulturen für 24 h in einem Inkubator 37 ° C.

4. Vorbereitung der LB-Lennox (Brühe mit Agar) Petrischalen

1. Zwei Tabletten von LB-Lennox (Brühe mit Agar) in ein Labor 100-mL-Flasche mit 100 mL Wasser auflösen.
2. Rühren Sie den Inhalt mit einer PTFE magnetischen Rührstab für 20 min und dann Kappe es fest.
3. Autoklaven der Inhalt bei 120 ° C für 10 Minuten.
4. In der Biosicherheit Kabinett Aliquote von Hand 100 mL Lösung in 4 Petrischalen, jede Gewährleistung erhalten ~ 25 mL. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen lassen.

5. Vorbereitung des monoklonalen Bakterien

1. Beschriften Sie in der Biosicherheit Kabinett die drei Flaschen im Schritt 2.6, #1, #2 und #3, bzw. vorbereitet.
2. Die resultierende Bakteriensuspension in Schritt 3.3 in #1 Flasche 0,1 mL Pipette. Verschließen Sie die Flasche und schwingen Sie es eigenhändig für 1 min um eine homogene Lösung zu erhalten.
3. Die daraus resultierende bakterielle Flüssigkeit im Schritt 5.2 in Flasche #2 0,1 mL Pipette. Verschließen Sie die Flasche und schwingen Sie es eigenhändig für 1 min um eine homogene Lösung zu erhalten.
4. Pipette 0,1 mL der resultierenden bakterielle Flüssigkeit im Schritt 5.3 in Flasche #3. Verschließen Sie die Flasche und schütteln Sie sie von hand für 1 min um eine homogene Lösung zu erhalten.
5. Die Flüssigkeit in der Flasche #3 in den 4 Petrischalen vorbereitet in Schritt 4.4, mit einem Volumen von 0,02 mL Pipette.
6. Setzen Sie die Glasperlen in Schritt 1.3 in den 4 Petrischalen verwendet, 4 Perlen in jedes Gericht zubereitet.
7. Schließen Sie die Abdeckungen der Petrischalen und schütteln Sie sie von hand für 1 min.
8. Die Petrischalen umdrehen und in einem Inkubator 37 ° C für 24 h inkubieren.

6. Multiplikation von monoklonalen Bakterien

1. 7 Rohre in Schritt 2.5 vorbereitet zu holen.
2. Wählen Sie die resultierenden monoklonalen Bakterien aus den 4 Petrischalen vorbereitet in Schritt 5.8 mit einem Edelstahl-Spatel, und steckte sie in 7 Röhren getrennt.
3. Verlassen Sie die 7 Rohre in einem Inkubator 37 ° C für 24 h.
4. Wählen Sie diejenige mit der größten Lichtstreuung mit der visuellen farbmetrischen Methode.

7. Vorbereitung der LB-Lennox Brühe mit Traubenzucker und Salz

1. Eine Flasche von 500 mL Labor LB-Lennox Brühe 10 g, 10 g NaCl und 10 g Glukose umgesetzt. Fügen Sie Wasser hinzu, bis das Volumen 450 mL erreicht.
2. Rühren Sie den Inhalt mit einer PTFE magnetischen Rührstab für 20 min.
3. Autoklaven der Inhalt bei 120 ° C für 10 Minuten.

8. Vorbereitung der Natrium-Wolframat

1. Setzen Sie 16,5 g Natrium Wolframat Na₂WO₄.2h₂O in eine Flasche 100 mL Labor mit einem Spatel aus rostfreiem Stahl. Fügen Sie Wasser hinzu, bis das Volumen 50 mL erreicht.
2. Rühren Sie den Inhalt mit einer PTFE magnetischen Rührstab für 20 min.
3. Autoklaven der Inhalt bei 120 ° C für 10 Minuten.
4. Erhalten Sie in der Biosicherheit Kabinett Filtrat über einen Vakuum Glasfaser-Filter mit Poren von 1 µm.

9. Vorbereitung der LB mit Glukose, Salz und Natrium Wolframat

1. Gießen Sie in der Biosicherheit Kabinett das Filtrat erlangte Schritt 8,4 von hand in die Lösung mit Traubenzucker und Salz im Schritt 7.3 vorbereitet.
2. Im Kabinett Biosicherheit, aliquoten mit einer Pipette die 500 mL resultierende Lösung im Schritt 9.1 in 10 x 50 mL Zentrifuge Röhren.

10. die Kultur von Bakterien

1. Holen Sie in der Biosicherheit Kabinett die Flüssigkeit vorbereitet im Schritt 6,4 und aliquoten es mit einer Pipette in die 10 Reagenzgläser im Schritt 9.2, mit jeder empfangen von 0,05 mL Tube vorbereitet.
2. Inkubieren Sie die 10 Röhren in einem 37 ° C Inkubator für 120 h.

11. die Ernte der BME Mineralien

1. Ultrasonicate jedes der 10 Rohre im Schritt 9.2 bei 20 KHz mit 150 W für 1 h.
2. Zentrifugieren Sie Schläuche am 2.025 x g für 1 h.
3. Die klare Flüssigkeit in den Rohren mit einer Pipette entfernen, Wasser hinzufügen und dann wiederholen Sie die Schritte 11.1 und 11.2 noch einmal.
4. Die klare Flüssigkeit in den Rohren mit einer Pipette zu entfernen, fügen Sie Alkohol und dann ultrasonicate sie bei 20 KHz mit 150 W für 1 h.
5. Zentrifugieren Sie Schläuche am 2.025 x g für 1 h.
6. Wiederholen Sie die Schritte 11.4 und 11.5 noch einmal
7. Ernte BME Mineralien durch die klare Flüssigkeit in den Rohren mit einer Pipette entfernen; danach sofort Kappe die Rohre ohne jede Trocknungsprozess.

12. oszillierende Temperatur mit Pandoraea SP. und Molybdat

1. Kultur Pandoraea SP. auf die gleiche Weise wie in den Schritten 2, 3, 4, 5 und 6 für Shewanella Algen. Das Ergebnis dieses Schrittes entspricht derjenigen Schritt 6.4.
2. LB-Bouillon mit Traubenzucker und Salz auf die gleiche Weise wie in den Schritten 7, 8 und 9, zu machen, außer dass die 16,5 g Natrium Wolframat in Schritt 7.1 mit 12 g Natrium Molybdat, Na₂MoO₄ · ersetzt wird 2H₂O. Das Ergebnis dieses Schrittes entspricht derjenigen Schritt 9.2.
3. In der Biosicherheit Kabinett Fetch bereitete die Flüssigkeit im Schritt 12.1 und aliquoten es mit einer Pipette in die 10 Röhren in 12.2, mit jedem Schritt vorbereitet empfangenden 0,05 mL tube.
4. Inkubieren Sie 10 Röhren im Schritt 12.3 unter oszillierende Temperaturen für 120 h in ein gegenseitiges Bad, oszillierende mit jeder Temperatur 12 h lang die Temperatur zwischen 25 ° C und 37 ° C, 5 Mal schütteln.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt echte sphärische Mikrokapseln. Sowohl die beiden Stämme des Bakteriums Shewanella Algen und Pandoraea sp., ursprünglich haben eine Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis von 3:1. Für die Erreichung der Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis von 1:1, eine hohe Konzentration (> 100 mM) Metall Oxyanions erforderlich ist. Eine niedrige Konzentration (< 5 mM) des Oxyanions führt in einer Länge, Durchmesser-Verhältnis von 10:1, als, dass in Abbildung 2, die vor dem Zustrom von Oxyanions, blockieren die binäre Spaltung von Bakterien führen kann. Zu guter Letzt wird zur Erreichung einer Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis von 3:1, wie die in Abbildung 3, eine mittlere Konzentration (~ 20 mM) von Oxyanions benötigt. Die Bildung von Kugelschalen, mit einem Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis von 1:1, kann durch bakterielle Antriebe herbeigeführt werden, aus denen sich ihre Fläche um die Einnahme von Oxyanions zu balancieren, während Oxyanions durch die Zellmembran diffundieren zu schrumpfen. Die drei Zahlen zeigen zusammen, dass die Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis von 10:1 bis 1:1 abgestimmt werden kann einfach durch Anpassung der Konzentration der Oxyanions.

Abbildung 4 und Abbildung 5 zeigen die Nanopartikel Körner Natrium Molybdat in verschiedenen Größen: kleiner als 15 nm und die größeren ein 110 nm. Beachten Sie, dass in Abbildung 5, auf die nicht-shattered Schalen, Partikel von 110 nm kann verkettet werden miteinander, poröse Schalen bilden. Größeren wurde durch die Temperatur der Kultivierung Brühe 5 Mal zwischen 25 ° C und 37 ° C, bei jeder Temperatur 12 h lang oszillierende gewonnen. Während die Temperatur-Oszillation, Körner in verschiedenen Größen können nicht nur produziert, sondern auch pflegen die Mikro-kugelförmige Struktur, das heißt, wir machen Mikrokapseln mit verschiedenen Korngrößen von 15 nm bis 110 nm, nur durch die Brühe Temperaturregelung .

Abbildung 6 zeigt die gebrochene Wand mit größeren Körnern bleiben neben der Öffnung der Mauer. Die Wandstärke beträgt etwa 22 nm und das größere Korn ist etwa 40-60 nm. Der Unterschied in der Größe kann aus verschiedenen metabolischen Prozessen führen, die noch nicht identifiziert sind.

Abbildung 1: der REM-Aufnahme der hohle Kugelschalen mit einem Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis von 1:1. Diese Struktur wurde Natrium-Wolframat durch Shewanella Algen mit Glukose als die Kohlenstoffquelle ausgeschieden. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von ECS J. Solid State Sci und techn., 6 Abs. 3, N3113 (2017). Copyright 2017, die elektrochemische Gesellschaft. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: der REM-Aufnahme der hohlen lange Filament Schalen mit einem Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis von 10:1. Diese Struktur wurde Natrium Molybdat durch Pandoraea SP. mit Glukose als die Kohlenstoffquelle ausgeschieden. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von ECS J. Solid State Sci und techn., 6 Abs. 3, N3113 (2017). Copyright 2017, die elektrochemische Gesellschaft. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: der REM-Aufnahme der kaputte hohlen stabförmigen Muscheln mit einem Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis von 3:1. Diese Struktur wurde Natrium-Wolframat durch Shewanella Algen mit Glukose als die Kohlenstoffquelle ausgeschieden. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von ECS J. Solid State Sci und techn., 6 Abs. 3, N3113 (2017). Copyright 2017, die elektrochemische Gesellschaft. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: der REM-Aufnahme von zerschmetterten Natrium Molybdat Muscheln mit einer Korngröße der Partikel von 15 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: The SEM Bild des zerstörten und nicht zerschlagen Natrium Molybdat Schalen mit einer Korngröße der Partikel von 110 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: der REM-Aufnahme der kaputte hohle Muscheln mit einem Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis von 1:1. Diese Struktur wurde Natrium-Wolframat durch Shewanella Algen mit Glukose als die Kohlenstoffquelle ausgeschieden. Granulat mit einer Größe über 40-60 nm hängen außerhalb der Schale direkt neben an ein großes Loch, während die Shell selbst besteht aus Granulat mit einer Größe von ca. 22 nm. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von ECS J. Solid State Sci und techn., 6 Abs. 3, N3113 (2017). Copyright 2017, die elektrochemische Gesellschaft. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Bezüglich der selbst-Konsistenz der Versuchsergebnisse sind die Vorbereitung und die Vermehrung von monoklonalen Bakterien entscheidend. Dieses Experiment, anders als die Vorlage Synthese Experimente^15,16, beschäftigt bioaktive Gram-negativen Bakterien. Um eine einzelne Wand zu erhalten, wählten wir prokaryotische Bakterien statt eukaryotischen Bakterien wie Hefe¹⁵. Um eine Kugelform mit einem Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis von 1:1, statt ein größeres Verhältnis von Länge zu Durchmesser¹⁶zu erreichen, gefüttert, wir Bakterien mit einer viel höheren Konzentration von Oxyanions um in eine Kugelform schrumpfen manipulieren Mikrokapseln machen eine einzelne, Runde und dünne Wand (< 30 nm).

Da der BME stützt sich hauptsächlich auf Anpassung der Konzentration der Oxyanions, den Stoffwechsel der Bakterien zu kontrollieren, verfügt es über zwei Einschränkungen. Erstens ist die Konzentration der Oxyanions durch die Löslichkeit begrenzt, obwohl die Konzentration so hoch wie möglich sein sollte. Zweitens die meisten bakteriellen Stoffwechsel stoppt bei einer Temperatur über 45 ° C oder unter 5 ° C, bzw. der oberen und unteren Grenzen unseres Experiments.

Trotz dieser zwei Einschränkungen hat der BME großes Potenzial für die Herstellung von Metall-Oxid-Materialien von praktischem Interesse. Um diese Behauptung zu untermauern, werden wir versuchen, diese Methode um Zirkon Mikrokapseln und Eisen Mikrokapseln machen — das ehemalige sein ein guter Kandidat, Material für künstliche Knochen, und die letzteren für Drug-Delivery.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB(Lennox)broth with agar tablets	Sigma-Aldrich	L7075	1 tablet for 50 mL broth with agar
LB (Lennox) broth	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) powder 1 kg
Dextrose anhydrous	Nihon Shiyaku Reagent	PL 78695	glucose
Sodium Tungstate	Nihon Shiyaku Reagent	PL 76050	Na2WO4 · 2H2O
Sodium Molybdate	Nihon Shiyaku Reagent	PL103564	Na2MoO4 · 2H2O
Sodium Chloride	Nihon Shiyaku Reagent	PL 68131	NaCl
Ethanol 99.5%	Acros organics	AC615090040	CH3CH2OH
Water	Made in our university		de-ionlized water
Autoclave	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipei City, Taiwan, ROC	TM-329	heat to 120 °C for 10 min
Centrifuge	Digit System Laboratory System, New Taipei City, Taiwan, ROC	DSC302SD	centrifuge at 2025 x g
-80 °C Refrigerator	Panasonic	MDF-U3386S	Use to deep-freeze cryopreserve strain
Ultrasonic Homogenizer Sonicator Processor Cell Disruptor	Lenox	UPS-150	frequency 20 KHz power 150 W
Incubator	Customer made	custom made	heat to 40 °C or cool to 18 °C with time cotrol
Reciprocal shaking baths	Kingtech Scientific Co., Ltd	WBS-L
Digital Stirring Hot Plate	Corning	#6797-620D	use with PTFE magnetic stirring bar
Biosafety cabinet	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	All bacteria related process are done here
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-6500F	SEM Images
50 mL centrifudge tube	Falcon	14-432-22
15 mL centrifudge tube	Falcon	14-959-53A
Laboratory bottle 100 mL	Duran	21 801 24 5
Laboratory bottle 500 mL	Duran	21 801 44 5
Stainless steel spatula	Chemglass	CG-1981-10
PTFE Disposable Stir Bars	Fisher	S68066
Plastic Petri Dishes	Fisher	S33580A
Shewanella algae	Courtesy of author #3	Courtesy of author #3
Pandoraea sp.	Courtesy of author #3	Courtesy of author #3