Sintetizando o tungstato de sódio e microcápsulas de molibdato de sódio através da excreção bacteriana de minerais

Resumo

Este trabalho apresenta um protocolo para fabricação de microcápsulas de molibdato tungstato e de sódio de sódio através de bactérias e seus correspondentes nanopartículas.

Resumo

Apresentamos um método, a excreção de minerais bacteriana (BME), para a síntese de dois tipos de microcápsulas, tungstato de sódio e molibdato de sódio e nanopartículas correspondentes dos dois óxidos de metal — o primeiro sendo tão pequeno quanto 22 nm e o último 15 nm. Nós alimentados duas estirpes de bactérias, algas Shewanella e Pandoraea SP., com várias concentrações de íons tungstato ou molibdato. As concentrações de tungstato e molibdato foram ajustadas para fazer microcápsulas de diferentes proporções de comprimento-diâmetro. Descobrimos que quanto maior a concentração menor as nanopartículas foram. As nanopartículas veio com três relações de comprimento-diâmetro: 10:1, 3:1 e 1:1, que foram atingidos pelo alimentando as bactérias respectivamente com uma baixa concentração, uma concentração média e alta concentração. As imagens das ocas microcápsulas foram tiradas através da digitalização microesfera de elétron (SEM). Verificaram-se suas estruturas cristalinas por difração de raios x (XRD) — a estrutura de cristal de microcápsulas de molibdato Na₂MoO₄ e de microcápsulas de tungstato é at₂WO₄ com at₂W₂O₇. Todas estas sínteses foram realizados sob uma condição ambiente próxima.

Introdução

Nanopartículas de óxido de metal são exploradas para entrega de drogas¹, construção artificial ossos², catálise heterogênea³, emissão de campo^4,5, células solares⁶, sensores de gás⁷, e baterias de lítio⁸. Para aplicações práticas, a resistência mecânica de nanocristais e sua microestrutura são cruciais. Entre as microestruturas, estruturas de invólucro vazio podem ser usadas para criar materiais de pouco peso, mecanicamente robusto⁹. Entre as estruturas de invólucro vazio, uma forma esférica é conhecida por ser mais rígida do que uma forma elipsoidal; o último tem uma relação comprimento-diâmetro maior do que o antigo^10,11. Este trabalho descreve um protocolo para a síntese de microcápsulas esféricas através de bactérias com um método não-tóxico sob uma condição ambiental, o que contrasta com os métodos alternativos, incluindo o modelo síntese método¹², pulverizador Ultrassônico-assistida síntese método¹³ e método hidrotérmico¹⁴. Alguns dos métodos alternativos requerem modelos¹², alguns uma temperatura tão alta como a 500 ° C¹³e alguns uma alta pressão¹⁴. Quanto a estrutura resultante, o método de síntese de modelo utilizando o modelo de levedura ocasiona uma estrutura casca-núcleo¹⁵, em vez de um com uma única parede, e o único utilizando o modelo de e. coli produz uma estrutura com relação comprimento-diâmetro de 1.7:0.8 e não é esférica. ¹⁶.

Neste trabalho, nós fizemos microcápsulas de óxido de metal com uma parede única e de forma esférica sob uma condição ambiente explorando o metabolismo bacteriano. Na glicólise bacteriana, um processo químico que metaboliza as fontes de carbono, como glicose e lactose, fontes de carbono são consideradas ser a origem do poder redutor gerado nele. Estamos manipulados metabolismo bacteriano, ajustando a concentração de fontes de carbono para atingir os fins desejados. Este método é favorável ao meio ambiente, usando agentes tóxicos e consumindo menos energia de eletricidade. Por último, este método permite a produção em massa de microcápsulas simplesmente aumentando o volume do caldo.

Antes do método, há outro dois métodos, utilizando o metabolismo bacteriano para tornar minerais: biologicamente induzido mineralização (BIM)¹⁷ e mineralização biologicamente controlado (BCM)¹⁸. BCM nem BIM pode ser usado para fazer de sódio microcápsulas de tungstato de tungstato e molibdato como nosso processo, que é designado como a excreção de minerais bacteriana (BME)¹⁹. Neste experimento, a forma de microcápsulas pode ser controlada para ter uma relação comprimento-diâmetro de 10:1 a 1:1, e o tamanho das nanopartículas grãos que formam as conchas podem ser ajustadas variando de 15 nm até 110 nm.

Protocolo

Atenção: Use luvas de látex, óculos de protecção e um casaco de laboratório para realizar o experimento. Sempre que usar o gabinete de segurança biológica, liga a ventoinha do gabinete e manter a porta do armário semi-cerrados.

1. preparação dos grânulos de vidro

1. Coloque 100 grânulos de vidro de 3 mm de diâmetro em um frasco de 100 mL de laboratório e depois tampá-lo firmemente.
2. Autoclave o conteúdo a 120 ° C por 10 min.
3. Deixe a garrafa esfriar a temperatura ambiente e, em seguida, coloque-o na biossegurança do armário.

2. preparação do caldo lisogenia (LB)

1. Dissolva 8 g de pó de caldo LB-Lennox em uma garrafa de 500 mL laboratório com 400 mL de água.
2. Mexa o conteúdo com uma barra de agitação magnética PTFE por 20 min e depois tampá-lo firmemente.
3. Autoclave o conteúdo a 120 ° C por 10 min.
4. A solução para arrefecer a temperatura ambiente e colocá-lo na biossegurança sair do armário.
5. Utilizando uma pipeta, alíquota o caldo em oito tubos de centrífuga de 15 mL na biossegurança do armário (12,5 mL cada uma).
6. Alíquota o caldo restante em três frascos de 100 mL laboratório no armário a Biossegurança (100 mL cada uma). As três garrafas Cap firmemente. Mantê-los na biossegurança do armário.

3. cultura de algas Shewanella

1. Use a estirpe criopreservada ultracongelada.
2. Na biossegurança do armário, escolher 1 mL do material congelado do tubo congelado com uma espátula de aço inoxidável e colocá-lo em um tubo de centrífuga preparado no passo 3.5.
3. Incube as culturas por 24 h em uma incubadora de 37 ° C.

4. preparação de pratos de Petri LB-Lennox (caldo com ágar-ágar)

1. Dissolva os dois comprimidos de LB-Lennox (caldo com ágar-ágar) em um frasco de 100 mL laboratório com 100 mL de água.
2. Mexa o conteúdo com uma barra de agitação magnética PTFE por 20 min e depois tampá-lo firmemente.
3. Autoclave o conteúdo a 120 ° C por 10 min.
4. A biossegurança do armário, alíquota por mão de 100 mL de solução em 4 placas de Petri, garantindo que cada um receber ~ 25 mL. Deixe a solução arrefecer à temperatura ambiente.

5. preparação de bactérias Monoclonal

1. Na biossegurança do armário, rotule as três garrafas preparadas na etapa 2.6, #1, #2 e #3, respectivamente.
2. Pipete 0,1 mL da suspensão bacteriana resultante na etapa 3.3 em garrafa #1. Tampe a garrafa e balançá-lo com a mão por 1 min obter uma solução homogénea.
3. Pipete 0,1 mL do líquido resultante bacteriano na etapa 5.2 em garrafa #2. Tampe a garrafa e balançá-lo com a mão por 1 min obter uma solução homogénea.
4. Pipete 0,1 mL do líquido resultante bacteriano na etapa 5.3 em garrafa #3. Tampar o frasco e agitá-lo com a mão por 1 min obter uma solução homogénea.
5. Pipete o líquido na garrafa #3 para a 4 placas de Petri preparada na etapa 4.4, usando um volume de 0,02 mL cada.
6. Coloca os grânulos de vidro preparados na etapa 1.3 para as 4 placas de Petri usado, 4 contas em cada prato.
7. Feche as tampas dos pratos Petri e agitá-los à mão por 1 min.
8. Vire os pratos de Petri e incubar em uma incubadora de 37 ° C por 24 h.

6. a multiplicação de bactérias Monoclonal

1. Buscar 7 tubos preparados na etapa 2.5.
2. Escolher as bactérias monoclonais resultantes da 4 placas de Petri preparadas na etapa 5.8 com uma espátula de aço inoxidável e colocá-los em 7 tubos separadamente.
3. Deixe os 7 tubos em uma incubadora de 37 ° C por 24 h.
4. Escolha aquele com a maior dispersão de luz utilizando o método colorimétrico visual.

7. preparação de caldo LB-Lennox com glicose e sal

1. Colocar 10 g de caldo LB-Lennox, 10 g de NaCl e 10 g de glicose em uma garrafa de 500 mL de laboratório. Adicione água até o volume atinge 450 mL.
2. Mexa o conteúdo com uma barra de agitação magnética PTFE por 20 min.
3. Autoclave o conteúdo a 120 ° C por 10 min.

8. preparação de tungstato de sódio

1. Coloque 16,5 g de nd de tungstato de sódio₂WO₄.2h₂O em um frasco de 100 mL de laboratório com uma espátula de aço inoxidável. Adicione água até o volume atinge 50 mL.
2. Mexa o conteúdo com uma barra de agitação magnética PTFE por 20 min.
3. Autoclave o conteúdo a 120 ° C por 10 min.
4. A gabinete de segurança biológica, obter filtrado através de um filtro de vácuo da fibra de vidro com poros de 1 µm.

9. preparação de LB com tungstato de sódio, sal e glicose

1. Na biossegurança do armário, despeje o filtrado adquirido na etapa 8,4 à mão na solução com glicose e sal preparado no passo 7.3.
2. O armário de biossegurança, alíquotas com uma pipeta, a solução resultante de 500ml na etapa 9.1 em tubos de centrífuga de 10 x 50 mL.

10. cultura de bactérias

1. Na biossegurança do armário, vai buscar o líquido preparado na etapa 6.4 e alíquota com uma pipeta para os 10 tubos de ensaio preparados no passo 9.2, com cada tubo receber 0,05 mL.
2. Incube os tubos de 10 em uma incubadora de 37 ° C para 120 h.

11. colheita de minerais BME

1. Ultrasonicate cada um dos 10 tubos na fase 9.2 a 20 KHz com 150 W por 1h.
2. Centrifuga os tubos a 2.025 x g, durante 1 h.
3. Remover o líquido dos tubos com uma pipeta, adicione a água e em seguida, repita as etapas 11.1 e 11.2 mais uma vez.
4. Remover o líquido dos tubos com uma pipeta, adicione álcool e então ultrasonicate-los a 20 KHz com 150 W por 1h.
5. Centrifuga os tubos a 2.025 x g, durante 1 h.
6. Repita as etapas 11.4 e 11.5 mais uma vez
7. Minerais BME colheita removendo o líquido dos tubos com uma pipeta; Depois, imediatamente tampa os tubos sem executar qualquer processo de secagem.

12. oscilação de temperatura com Pandoraea SP. e molibdato

1. Cultura Pandoraea SP. , da mesma forma como nos passos 2, 3, 4, 5 e 6 para Shewanella algas. O resultado desta etapa corresponde da etapa 6.4.
2. Fazer caldo LB com glicose e o sal da mesma forma como nos passos 7, 8 e 9, exceto que a 16,5 g de tungstato de sódio em passo 7.1 é substituído com 12 g de molibdato de sódio, Na₂MoO₄ · 2H₂O. O resultado desta etapa corresponde da etapa 9.2.
3. A gabinete de segurança biológica, busca o líquido preparado no passo 12.1 e alíquotas com uma pipeta para os 10 tubos preparados na etapa 12.2, com cada tubo receptor 0,05 mL.
4. Incube os tubos de 10 na etapa 12.3 sob temperaturas oscilantes para 120 h em uma recíproca tremendo banho, oscilando a temperatura 5 vezes entre 25 ° C e 37 ° C, com cada temperatura duração de 12 h.

Resultados

A Figura 1 mostra genuínas microcápsulas esféricas. As duas variedades da bactéria Shewanella algas e Pandoraea sp., originalmente têm uma proporção comprimento-diâmetro de 3:1. Para alcançar a relação comprimento-diâmetro de 1:1, alta concentração (> 100 mM) de metal oxyanions é necessária. Uma baixa concentração (< 5mm) de oxyanions pode resultar em um comprimento a relação do diâmetro de 10:1, como que na Figura 2, que pode resultar de influxo de oxyanions, bloqueando a fissão binária das bactérias. Por último, para alcançar uma relação comprimento-diâmetro de 3:1, assim, na Figura 3, é necessária uma concentração média (~ 20 mM) de oxyanions. A formação de cascas esféricas, com uma relação comprimento-diâmetro de 1:1, pode ser provocada por unidades bacterianas que darem-se a reduzir sua área de superfície para equilibrar a ingestão de oxyanions enquanto difusão oxyanions através da membrana celular. As três figuras juntos indicam que a relação do comprimento-diâmetro poderão ser sintonizada de 10:1 a 1:1, simplesmente ajustando a concentração de oxyanions.

Figura 4 e Figura 5 mostram as nanopartículas grãos de molibdato de sódio em tamanhos diferentes: a mais nova sendo 15 nm e o maior um 110 nm. Observe que na Figura 5, dos cartuchos não-quebrado, partículas de 110 nm pode ainda ser acorrentado ao outro, formando conchas porosas. O gordinho foi adquirido através de oscilação da temperatura do caldo de cultivo 5 vezes entre 25 ° C e 37 ° C, com cada temperatura duração de 12 h. Durante a oscilação de temperatura, só não podem ser produzidos grãos de tamanhos diferentes, mas também manter a estrutura microesférica, o que significa que nós podemos fazer microcápsulas com tamanhos de grão diferente, de 15 nm até 110 nm, apenas controlando a temperatura do caldo .

A Figura 6 mostra o muro quebrado com grãos maiores que ficar ao lado da abertura da parede. A espessura da parede é de cerca de 22 nm e o grão maior é de 40-60 nm. A diferença de tamanho pode resultar de diferentes processos metabólicos, que ainda não foram identificados.

Figura 1: imagem SEM o dos reservatórios esféricos ocos com uma relação comprimento-diâmetro de 1:1. Essa estrutura foi feita de tungstato de sódio excretado por algas Shewanella com glicose como fonte de carbono. Reproduzido com permissão da ECS J. de Sci. de estado sólido e Tech, 6(3), N3113 (2017). Copyright 2017, a sociedade eletroquímica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: imagem SEM o dos reservatórios de filamento longo oco com uma relação comprimento-diâmetro de 10:1. Essa estrutura foi feita de molibdato de sódio excretado por Pandoraea SP. com glicose como fonte de carbono. Reproduzido com permissão da ECS J. de Sci. de estado sólido e Tech, 6(3), N3113 (2017). Copyright 2017, a sociedade eletroquímica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: imagem SEM o quebrado oco conchas em forma de haste com uma relação comprimento-diâmetro de 3:1. Essa estrutura foi feita de tungstato de sódio excretado por algas Shewanella com glicose como fonte de carbono. Reproduzido com permissão da ECS J. de Sci. de estado sólido e Tech, 6(3), N3113 (2017). Copyright 2017, a sociedade eletroquímica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: imagem SEM o dos reservatórios de molibdato de sódio quebrado com um tamanho de partícula de grão de 15 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: imagem SEM o dos reservatórios de molibdato de sódio quebrado e não-quebrado com um tamanho de partícula de grão de 110 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: imagem SEM o de conchas ocas quebradas com uma relação comprimento-diâmetro de 1:1. Essa estrutura foi feita de tungstato de sódio excretado por algas Shewanella com glicose como fonte de carbono. Grânulos com um tamanho de cerca de 40-60 nm pendurar fora o shell bem próximo a um grande buraco, enquanto o escudo em si é feito de grânulos com um tamanho de cerca de 22 nm. Reproduzido com permissão da ECS J. de Sci. de estado sólido e Tech, 6(3), N3113 (2017). Copyright 2017, a sociedade eletroquímica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

No que se refere a autoconsistência dos resultados experimentais, a preparação e a multiplicação de bactérias monoclonais são críticos. Neste experimento, diferente do modelo síntese experiências^15,16, empregado bioativas bactérias Gram-negativas. Para obter uma única parede, optamos por bactérias procarióticas em vez de bactérias eucariontes como fermento¹⁵. Para alcançar uma forma esférica com uma relação comprimento-diâmetro de 1:1, em vez de uma maior proporção comprimento-diâmetro¹⁶, alimentamos as bactérias com uma concentração muito maior de oxyanions para manipulá-los a encolher-se em uma forma esférica, fazendo microcápsulas com uma parede simples, redondo e fina (< 30 nm).

Uma vez o BME baseia-se principalmente na regulação da concentração de oxyanions para controlar o metabolismo de bactérias, que apresenta duas limitações. Em primeiro lugar, a concentração de oxyanions é limitada pela solubilidade, embora a concentração deve ser mais alta possível. Em segundo lugar, mais bacterianos metabolismos vão parar a uma temperatura acima de 45 ° C ou abaixo de 5 ° C, respectivamente o limites superior e inferior de nosso experimento.

Apesar dessas duas limitações, o BME tem um grande potencial para fazer materiais de óxido de metal de interesse prático. Para fundamentar o seu pedido, nós vamos tentar este método para fazer microcápsulas de zircônio e microcápsulas de ferro — o primeiro material para ossos artificiais e o último para a entrega da droga a ser um bom candidato.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB(Lennox)broth with agar tablets	Sigma-Aldrich	L7075	1 tablet for 50 mL broth with agar
LB (Lennox) broth	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) powder 1 kg
Dextrose anhydrous	Nihon Shiyaku Reagent	PL 78695	glucose
Sodium Tungstate	Nihon Shiyaku Reagent	PL 76050	Na2WO4 · 2H2O
Sodium Molybdate	Nihon Shiyaku Reagent	PL103564	Na2MoO4 · 2H2O
Sodium Chloride	Nihon Shiyaku Reagent	PL 68131	NaCl
Ethanol 99.5%	Acros organics	AC615090040	CH3CH2OH
Water	Made in our university		de-ionlized water
Autoclave	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipei City, Taiwan, ROC	TM-329	heat to 120 °C for 10 min
Centrifuge	Digit System Laboratory System, New Taipei City, Taiwan, ROC	DSC302SD	centrifuge at 2025 x g
-80 °C Refrigerator	Panasonic	MDF-U3386S	Use to deep-freeze cryopreserve strain
Ultrasonic Homogenizer Sonicator Processor Cell Disruptor	Lenox	UPS-150	frequency 20 KHz power 150 W
Incubator	Customer made	custom made	heat to 40 °C or cool to 18 °C with time cotrol
Reciprocal shaking baths	Kingtech Scientific Co., Ltd	WBS-L
Digital Stirring Hot Plate	Corning	#6797-620D	use with PTFE magnetic stirring bar
Biosafety cabinet	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	All bacteria related process are done here
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-6500F	SEM Images
50 mL centrifudge tube	Falcon	14-432-22
15 mL centrifudge tube	Falcon	14-959-53A
Laboratory bottle 100 mL	Duran	21 801 24 5
Laboratory bottle 500 mL	Duran	21 801 44 5
Stainless steel spatula	Chemglass	CG-1981-10
PTFE Disposable Stir Bars	Fisher	S68066
Plastic Petri Dishes	Fisher	S33580A
Shewanella algae	Courtesy of author #3	Courtesy of author #3
Pandoraea sp.	Courtesy of author #3	Courtesy of author #3