חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation

Summary

בשיטה זו ניתן למדוד את סינתזת RNA. 5-Bromouridine הוסיף לתאים, שולבו RNA מסונתז. סינתזת RNA נמדד על ידי RNA חילוץ מיד לאחר labelling, ואחריו immunoprecipitation 5-Bromouridine-ממוקד של RNA וניתוח עם תוויות ברורות על ידי שעתוק במהופך ואת תגובת שרשרת פולימראזית כמותית.

Abstract

כאשר רמות מצב יציב RNA מושווים בין שני תנאים, אין אפשרות להבחין בין אם השינויים נגרמים שינויים ייצור או השפלה של RNA. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת ייצור RNA, באמצעות 5-Bromouridine תוויות של RNA ואחריו immunoprecipitation, אשר מאפשר חקירה של RNA מסונתז בתוך פרק זמן קצר (למשל, 1 h). היתרון של immunoprecipitation ו- 5-Bromouridine-תוויות על השימוש של מעכבי תעתיק רעילים, כגון אמניטין α וואקטינומיצין D, היא שאין שום או אפקטים נמוך מאוד על יכולת הקיום תא במהלך שימוש לטווח קצר. עם זאת, כי 5-Bromouridine-immunoprecipitation רק לוכד RNA שהופק במסגרת הזמן labelling קצר, לאט המיוצר וכן במהירות השפיל RNA יכול להיות קשה למדוד בשיטה זו. ניתן לנתח את הרנ א. 5-Bromouridine-מתויג שנתפסו על ידי 5-Bromouridine-immunoprecipitation על ידי שעתוק במהופך, כמותית של תגובת שרשרת פולימראזית רצף הדור הבא. כל סוגי RNA יכול ייחקרו, השיטה אינה מוגבלת מדידה mRNA כפי מוצג בדוגמה זו.

Introduction

5-Bromouridine (אחי) immunoprecipitation (IP) מאפשר חקר ייצור RNA בתאים ללא או השפעות מוגבלת מאוד על תא פיזיולוגיה במהלך התקציר labelling תקופה^1,2. השיטה מבוססת על התאגדות של הנגזרת uridine סינתטי ברו לתוך RNA מסונתז לאחרונה עקב על ידי ה-IP של RNA שכותרתה באמצעות נוגדנים anti-ברו (איור 1).

זה כבר ידוע כי עשרות שנים את סינתזת החלבון להיות מוסדרות transcriptionally, קיום גורמי שעתוק היה שיערו לפני יותר מ 50 שנה³. כיום, ידוע כי כמה מחלות נגרמות על ידי dysregulation של שעתוק ויציבות RNA (משלים איור S1 הפניה⁴), ואת היכולת למדוד שינויים בייצור ה-RNA הוא בעל חשיבות רבה הבנה במחלה פיתוח.

מצד שני, כלי כדי לווסת את ייצור RNA מספקים אפשרויות חדשות לטיפול במחלות שנגרמו על ידי ביטוי חלבון קטן מדי או גדול מדי, או הצטברות חלבונים כגון מחלת פרקינסון (PD). החלבון השולט צבירת אגרגטים מסיסים כמו ב- PD α-synuclein, הרמה של α-synuclein מקושר ישירות המחלה, כמו ג'ין הכפלה של הגן α-synuclein גורמת PD משפחתית⁵. יתר על כן, α-synuclein אגרגטים באופן תלוי ריכוז. Downregulation של רמות ה-mRNA α-synuclein לכן אסטרטגיה טיפולית מעניינת, אשר בהצלחה הושגה באמצעות התערבות RNA כדי להקטין את איבוד תאים עצביים ב- PD מודלים מכרסמים^6,7.

חשוב שניתן יהיה למדוד את השינויים בתחום ייצור RNA נגרם על-ידי מחלה או התערבויות טיפוליות. המדינה של אמנות שיטות מדידת רמות מצב יציב של RNA, כגון שעתוק במהופך ואחריו תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (RT-qPCR), אינם מסוגלים להבחין בין השינויים שנגרמו על ידי רגולציה תעתיק או משתנה יציבות הרנ א. שיטה בשימוש נרחב לחקירה של RNA הניוון חוסם של מכונות תעתיק באמצעות תרכובות כגון אמניטין α או ואקטינומיצין D ואחריו מדידות RNAs רקובה. עם זאת, ישנם כמה בעיות הקשורות של חסימה הכוללת של שעתוק בתאים, כגון אינדוקציה של אפופטוזיס^8,9. לצד ההשפעות ציטוטוקסיות, מעכבי תעתיק גם להציג מספר בעיות טכניות, כגון ספיגת הסלולר איטי של α אמניטין וחוסר יחודיות של ואקטינומיצין D (נבדקה תוך התייחסות¹⁰).

כדי למנוע את החסימה הכללי של שעתוק, נוקלאוטיד מקבילים היו בשימוש, כגון 5-ethynyl uridine (5-האיחוד האירופי), 4-thiouridine (4-טו) וברו. אלה בקלות נלקח על ידי בתרבית של תאים, שולבו לאחרונה מסונתז RNA, הפעלת הדופק-תוויות של RNA בתוך פרק זמן מסוים. ברו רעיל פחות מ 5-האיחוד האירופי, 4-טו, הפיכתה של אנלוגי המועדפת של הבחירה^11,12.

ברו-IP יכול לשמש כדי לחקור את קצב סינתזת RNA ויציבות, וכך להבדיל בין הגורמים הבסיסיים של שינויים ב- RNA הכולל. מאמר זה יתמקד המידה של סינתזת RNA ומתייחס להפנות² פרטים על החקירה של יציבות הרנ א. לחקור סינתזה RNA, התאים הם בקצרה בלוחיות ברו למשל עבור h 1 ואחריו ברו-IP¹ (איור 1C). דבר זה מאפשר מדידות של RNA מסונתז בתוך זמן קצר labelling וייתן שינויי אומדן טוב יותר של תקנות ב סינתזה RNA מאשר על ידי מדידת שינויים ב- RNA הכולל מאת RT-qPCR. יש לציין, עם זאת, כי למרות הזמן labelling הוא, לדוגמה, רק 1 h, השפלה יכולים עדיין יש השפעה על רמות ה-RNA שנצפו.

RNA של ברו-IP ניסויים מתאימים לניתוח במורד הזרם על ידי שני RT-qPCR¹ או^2,רצף הדור הבא¹³. תקן RNA לזיהוי בשיטות אחרות, כגון סופג בצפון או ribonuclease הגנה assay, עשוי גם להיות ישימים עבור RNAs מסוימים.

Protocol

הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר אלא אם צויין אחרת ולשמור על מאגרי על קרח או במקרר (למעט מ • תנאי מאגר המכיל מרחביות). הפרוטוקול מחולק למקטעים 5: הכנה של RNA דגימות; הכנה של חרוזים IP; איגוד של RNA מתויג ברו כדי חרוזים; • תנאי וטיהור של RNA מתויג ברו המאוגד על-ידי מיצוי פנול-פנול/כלורופורם-כלורופורם 3 שלבים; ניתוח של RNA (בדוגמה זו באמצעות RT-qPCR)

1. הכנת דוגמאות RNA

1. HEK293T ספירת תאים באמצעות תא אוטומטיות מונה, זרע 3,500,000 תאים בצלוחית 10 ס מ בתקשורת הצמיחה 10 מ"ל (בינוני ששינה הנשר של Dulbecco בתוספת 10% עגל עוברית סרום ו פניצילין µg/mL 50/סטרפטומיצין...) כדי לקבל סכום כולל של > 40 µg RNA על החילוץ 48 שעות מאוחר יותר לשמור על תאים-CO 37 ° C ו-5%₂.
2. 48 שעות לאחר זריעה, תשאף 8 mL צמיחה מדיה ולהשאיר את 2 מ"ל מאחור כדי למנוע ייבוש התאים. להוסיף 2 מ מ ברו, כל טיפול 8 מ ל aspirated צמיחה מדיה, ולהסיר את השארית 2 מ"ל מתאי לפני החלת mL 8 ברו המכיל צמיחה מדיה. הימנע משימוש מדיה טריים על היישום של ברו התאים, מאז זה יכול לגרום שינויים בביטוי הגנים.
3. דגירה את התאים עבור h 1 עם ברו וטיפול. לשטוף את התאים במאגר של 5 מ"ל האנק, trypsinize את התאים באמצעות טריפסין 0.05% 2 מ"ל. הוסף 8 מ ל מדיה הצמיחה כדי לעצור את התגובה, להעביר את התאים צינור 15 מ"ל ו ספין למטה התאים למשך 2 דקות ב g 1,000 x.
4. הסר את תגובת שיקוע ולחלץ RNA הכולל מ בגדר התא באמצעות בידוד RNA קיט (ראה טבלה של חומרים) או אחרים העדיפו שיטה ולאחר elute נטולת RNase H₂O. החנות את הרנ א ב-80 מעלות צלזיוס עד מוכנים להמשיך.

2. הכנה של חרוזים IP

1. להכין חרוזים בקבוצות במספר הדגימות להיחקר פלוס אחד נוסף בחשבון הפסד במהלך pipetting, להסתחרר ערבוב. Resuspend העכבר אנטי איג beads מגנטי ביסודיות על ידי סיבוב ערבוב, להוציא 20 µL חרוזי לדגימה צינור 1.5 mL RNase-חופשית. המקום הצינור 1.5 mL מעמד מגנטי ו להשאיר כ 20 s עבור החרוזים לאסוף בצד.
2. הסר את תגובת שיקוע, להוציא את הצינור מדוכן מגנטי, resuspend במאגר ברו-IP 1 x µL 400 על-ידי pipetting. לסובב את הצינור קצר עבור 2 s ומפרידה שולחני, מניחים אותה בחזרה דוכן העדים מגנטי, ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על השלב כביסה פעם אחת.
3. בלוק לא ספציפי מחייב החרוזים קרישת דם. Resuspend את החרוזים של 1 מ"ל 1 x BrU-IP + 1 מ"ג/מ"ל מאגר הפארין, ולהשאיר סיבוב במשך 30 דקות לשטוף את החרוזים פעם אחת, כמו שלב 2.2.
   הערה: הפרין הוא פולימר טעונים שלילית, אשר יתחרו עם RNAs לכריכה. tRNA או RNAs לא רלוונטיים אחרים ניתן להשתמש גם אם היישום במורד הזרם לא והרצף.
4. Resuspend את החרוזים של 1 מ"ל 1 x ברו-IP מאגר ולהוסיף 1.25 נוגדן anti-α-Bromodeoxyuridine µg/המדגם, אשר גם מזהה ברו. דגירה של חרוזי 1 h תוך כדי סיבוב, או למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
5. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים כמו שלב 2.2. Resuspend את החרוזים במאגר 50 x 1 µL/מדגם ברו-IP בתוספת 1 מ"מ ברו ולהשאיר סיבוב למשך 30 דקות להוריד את הרגישות של הנוגדן מאוגד החרוזים, בזאת את הסיכון של איגוד לא ספציפי במהלך ה-IP.
6. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים כמו שלב 2.2, resuspend במאגר µL/מדגם 1xBrU-IP 50.

3. איגוד של RNA מתויג ברו כדי חרוזים

1. למדוד ריכוזים RNA ב RNA תמציות מהשלב 1.3 באמצעות ספקטרופוטומטר אולטרה סגול-גלוי, למהול 40 µg RNA של כל דגימה ללא RNase H₂O את הנפח הכולל של 200 µL.
2. מחממים את דגימות ה-RNA למשך 2 דקות ב- 80 ° C עד denature RNA ו ספין בקצרה ב צנטריפוגה שולחן. להוסיף 200 µL 2 x ברו-IP + BSA/RNAse מעכב.
3. הוסף 50 µL resuspended, להכין חרוזים מהשלב 2.6 כל מדגם ולהשאיר סיבוב ח' 1 לשטוף את החרוזים ארבע פעמים כמו שלב 2.2.

4. • תנאי וטיהור של RNA הפקת פנול-פנול/כלורופורם-כלורופורם 3 שלבים

1. Elute RNA ולבצע פנול החילוץ
   1. Resuspend את החרוזים במאגר • תנאי µL 200 כדי elute RNA, במהירות לאחר מכן להוסיף 200 µL פנול, pH 6.6 (זהירות: רעיל, ראה הערה להלן צעד 4.1.2) כדי להסיר כל מולקולות RNA שאינן מן המדגם.
   2. סיבוב תמהיל המדגם, ספין 3 דקות ב g x 25,000 ומפרידה שולחן.
      הערה: פנול הוא רעיל ויש לטפל בשכונה fume לובש עור הגנה. ה-pH חומצי מעט מבטיח כי רק RNA, ו לא ה-DNA, מופק. הרנ א יישאר בשלב מימית העליון בשל אופיו הידרופילית של חיובים. ליבת הידרופובי חלבונים לאגד פנול ולעבור לשלב התחתון אורגנים פנול.
2. מבצע החילוץ פנול-כלורופורם
   1. האחות העליונה-שלב רב ככל האפשר (190 כ µL של µL 200, תלוי ניסיון בטיפול) והעבר אותו לרכבת התחתית עם 200 µL פנול/כלורופורם, pH 6.6 (זהירות: רעיל, ראה הערה). ודא לרוקן את אותה כמות מדגמים.
   2. ניסיון לערבב את הדגימה ספין למשך 3 דקות ב 25,000 x g.
      הערה: כלורופורם הוא רעיל ויש לטפל בשכונה fume לובש עור הגנה. כלורופורם נוסף כדי להסיר פנול, אשר יכולים להשפיע על ידי עיכוב שעתוק במהופך¹⁴ ופולימראז תגובות שרשרת¹⁵ניתוח במורד הזרם של RNA.
3. לבצע כלורופורם חילוץ על ידי כ רפה בעברית השלב העליון מימית כמו לפני (µL כעת כ- 180), ולהעביר שפופרת המכילה כלורופורם µL 200. ניסיון לערבב את הדגימה, ספין 3 דקות ב g 25,000 x.
4. האחות השלב העליון מימית כמו בעבר (עכשיו כ 170 µL), להעביר אותו צינור המכיל 17 µL (כרך 1/10) 3 מ' CH₃COONa, pH 6.0. כדי לנטרל לזרז RNA מהפתרון מימית, להוסיף 2 הגליקוגן µL (20 מ"ג/מ"ל), אשר ארגונייט שוקע יחד עם ה-RNA והופכת בגדר RNA גלוי יותר.
5. להוסיף 500 אתנול 96% µL להגדיל מחייב בין יונים מלח ו RNA מיקס על ידי היפוך הצינור כמה פעמים. להשאיר את צינור לילה ב-20 ° C או 15 דקות קרח יבש.
6. ספין המדגם ב 25,000 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות להשליך תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר ולשטוף בגדר 185 µL 75% אתנול כדי להסיר את כל משקעי מלח. ספין ב 25,000 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
7. למחוק את תגובת שיקוע לחלוטין מבלי להפריע בגדר, בגדר להתייבש 5-10 דקות עם מכסה פתוח להשאיר. Resuspend ב 10 µL ללא RNase H₂O חלה בצד הצינור כדי להימנע מהפרעה בגדר.

5. ניתוח של RNA

1. להכין cDNA באמצעות תיעוד הפוכה cDNA קיט (ראה טבלה של חומרים) או אחרים העדיפו שיטה באמצעות 2 מדגם ה-RNA µL, 1 µg שמרים RNA הכולל כנשא RNA עבור התגובה סינתזה cDNA (לא משמש אם cDNA משמש עבור רצף הדור הבא). השתמש µg 1 RNA ללא שמרים RNA להכנה cDNA של קלט המתאימים.
2. CDNA שתדללו 1:25 ו- cDNA של µL 9 מדולל לערבב עם 10 µL qPCR מאסטר מיקס, בדיקה 1 µL fluorogenic, שניהם המצוין בטבלה של חומרים.
   הערה: דילול cDNA תלוי cDNA הכנה ואת שיטת qPCR.
3. הפעל את התוכנית qPCR הבאים (למשל, על מערכת מהר בזמן אמת PCR 7500 או שווה ערך): 2 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, 20 s ב 95 ° C, 40 מחזורי 3 s ב 95 ° C ו- 30 s-60 ° C.

תוצאות

לפי הבדיקות הראשוניות של זמן labelling ברו בוצעו בתאים AsPC-1. התאים טופלו על-ברו על 0, 1, 2, ו- 4.5 h, ואחריו הכולל החילוץ-RNA, ברו-IP. GAS5, GAPDH נמדדו ב- RNA ברו-IP, אשר הראו כי 1 h labelling הספיק להגיע כ 9 - ו 44 פי שינוי לעומת הרקע (0 h) עבור GAPDH ו- GAS5, בהתאמה.

ברו-IP הניתוח שת...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את השימוש ברו-IP עבור נחישות של RNA הייצור על ידי תוויות של לאחרונה לייצור RNA 1 h עם ברו, ואחריו פינוי מיידי של RNA ו- immunoprecipitation של RNA מתויג ברו. שיטה זו שתיארנו קודם לכן ההפניה¹⁶, מאמר זה מכיל שלבים נוספים להגברת IP ירידה לפרטים וטוהר RNA, על ידי חרוזים מראש לטיפול עם ריכו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribolock Rnase inhibitor	ThermoFisher	EO0381
Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG	Life Technologies	11202D
α-Bromodeoxyuridine mouse antibody	BD Bioscience	555627
Nanodrop 1000	Thermo Fisher		Ultraviolet-visible spectrophotometry
Water-Saturated Phenol pH 6.6	ThermoFisher	AM9712
Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6	ThermoFisher	AM9732
High Pure RNA isolation Kit	Roche	11828665001
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher	4368814
Taqman Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444557	qPCR Master Mix
Taqman RNA probes	ThermoFisher	SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1	Flurogenic probes
7500 Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystems
HEK293T cell line	ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Lonza	BE12-604F
Fetal calf serum	Biochrom	S0115
Penicillin/Streptomycin	Biochrom	A2213
Hank's buffer			5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved.
DEPC-H2O			0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O
2xBrU-IP Buffer			40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor			2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL heparin			2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin
1xBrU-IP			2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock
Elution buffer			0.1% SDS in RNAse-free H2O