Indagine della sintesi di RNA usando 5-Bromouridine di etichettatura e di immunoprecipitazione

Riepilogo

Questo metodo può essere utilizzato per misurare la sintesi del RNA. 5-Bromouridine è aggiunto alle cellule e integrare nel RNA sintetizzato. Sintesi di RNA viene misurata mediante estrazione di RNA immediatamente dopo la marcatura, seguita da 5-Bromouridine-mirati immunoprecipitazione di etichettati RNA e analisi di trascrizione inversa e reazione a catena della polimerasi quantitativa.

Abstract

Quando livelli allo stato stazionario del RNA sono confrontati fra due condizioni, non è possibile distinguere se i cambiamenti sono causati da alterazioni nella produzione o degradazione del RNA. Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione della produzione di RNA, usando 5-Bromouridine etichettatura di RNA seguito da immunoprecipitazione, che consente l'indagine di RNA sintetizzato entro un breve lasso di tempo (ad es., 1h). Il vantaggio di 5-Bromouridine-etichettatura e immunoprecipitazione sull'uso di inibitori trascrizionali tossici, come α-amanitina e actinomicina D, è che ci sono no o molto bassi effetti sulla vitalità cellulare durante l'uso a breve termine. Tuttavia, poiché 5-Bromouridine-immunoprecipitazione acquisisce solo RNA prodotta entro il breve tempo di etichettatura, lentamente prodotta così come rapidamente degradato RNA può essere difficile da misurare da questo metodo. Il RNA 5-Bromouridine-labelled catturato da 5-Bromouridine-immunoprecipitazione può essere analizzato da trascrizione d'inversione, reazione a catena della polimerasi quantitativa e sequenziamento di nuova generazione. Tutti i tipi di RNA possono essere indagati, e il metodo non è limitato alla misura mRNA come è presentato in questo esempio.

Introduzione

5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitazione (IP) permette lo studio della produzione di RNA nelle cellule con no o molto limitati effetti su cellule fisiologia durante il breve periodo^1,2di etichettatura. Il metodo si basa di incorporazione del derivato sintetico uridina BrU in RNA recentemente sintetizzato seguita da IP di RNA etichettato usando gli anticorpi anti-BrU (Figura 1).

È stato conosciuto per decenni quella sintesi della proteina possono essere regolata trascrizionalmente e l'esistenza di fattori di trascrizione è stata supposta più di 50 anni fa³. Oggi, è noto che molte malattie sono causate da disregolazione della trascrizione e della stabilità del RNA (complementare figura S1 in riferimento⁴), e la capacità di misurare le variazioni nella produzione di RNA è di grande importanza nella malattia di comprensione sviluppo.

D'altra parte, strumenti per regolare la produzione di RNA offrono nuove possibilità per il trattamento di malattie causate da troppo o troppo poco l'espressione della proteina, o accumulo di proteine come nella malattia di Parkinson (PD). La proteina predominante accumulando aggregati come insolubili nel PD è α-synuclein, e il livello di α-synuclein è direttamente legato alla malattia, come la moltiplicazione del gene del gene α-synuclein causa familiare PD⁵. Inoltre, α-synuclein aggrega in un modo dipendente dalla concentrazione. Downregulation dei livelli di mRNA di α-synuclein è quindi un'interessante strategia terapeutica, che è stato raggiunto con successo usando l'interferenza del RNA per ridurre la perdita di un neurone delle cellule nel PD modelli del roditore^6,7.

È importante essere in grado di misurare i cambiamenti nella produzione di RNA causata da malattia o interventi terapeutici. Metodi all'avanguardia per misurazione livelli allo stato stazionario di RNA, come trascrizione d'inversione seguita da reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR), non sono in grado di distinguere tra i cambiamenti causati da regolazione trascrizionale o da alterato Stabilità del RNA. Un metodo ampiamente usato per le indagini dei tassi di decadimento di RNA è il blocco dell'apparato trascrizionale utilizzando composti come α-amanitina o actinomicina D seguita da misure del RNAs decadente. Tuttavia, ci sono alcuni problemi connessi con un blocco generale di trascrizione nelle cellule, come induzione di apoptosi^8,9. Al lato degli effetti citotossici, trascrizionali inibitori presentano anche diversi problemi tecnici, come lento assorbimento cellulare di α-amanitina e mancanza di specificità di actinomicina D (rivisto in riferimento¹⁰).

Per evitare il blocco generale della trascrizione, nucleotidici sono stati utilizzati, quali 5-Etinil uridina (5-UE), 4-thiouridine (4-TU) e BrU. Questi sono prontamente presi dalle cellule di mammifera e integrare nel RNA recentemente sintetizzato, Abilitazione impulso-etichettatura di RNA entro un lasso di tempo specifico. BrU è meno tossico che 5-UE e 4-TU, che lo rende il preferito analogo scelta^11,12.

BrU-IP può essere utilizzato per indagare sia il tasso di sintesi di RNA e di stabilità e così distinguere tra le cause alla base dei cambiamenti nel RNA totale. Questo articolo si concentrerà sulla misurazione della sintesi del RNA e si riferisce per fare riferimento a² per i dettagli sull'indagine di stabilità del RNA. Per studiare la sintesi del RNA, cellule brevemente sono etichettate con BrU ad es. per 1 h seguita da BrU-IP¹ (Figura 1). Questo permette di eseguire misure di RNA sintetizzati entro il breve tempo di etichettatura e cambiamenti osservati verranno darà una stima migliore dei regolamenti nella sintesi di RNA che misurando i cambiamenti in RNA totale da RT-qPCR. Va ricordato, tuttavia, che anche se la data di etichettatura è, ad esempio, solo 1 h, degradazione può ancora avere un'influenza sui livelli di RNA osservata.

RNA da esperimenti di BrU-IP sono adatte per analisi a valle sia RT-qPCR¹ o di prossima generazione sequenziamento^2,13. Altri metodi di rilevamento standard di RNA, come Macchiarsi nordico o analisi della protezione della ribonucleasi, possono anche essere applicabile per certo RNAs.

Protocollo

Nota: Eseguire tutte le operazioni a temperatura ambiente, se non diversamente indicato e mantenere buffer su ghiaccio o in frigo (tranne dall'eluizione di tampone contenente SDS). Il protocollo è diviso in 5 sezioni: esempi di preparazione di RNA; preparazione di perline per IP; associazione del RNA BrU-etichettati per perline; eluizione e purificazione di RNA BrU-etichettati associato di estrazione del fenolo-fenolo/cloroformio-cloroformio 3 passi; analisi di RNA (in questo esempio usando RT-qPCR)

1. preparazione dei campioni di RNA

1. Conteggio HEK293T cellule utilizzando una cella automatizzata del contatore e seme 3.500.000 cellule in una capsula Petri 10 cm in media di crescita 10ml (Medium dell'Aquila per volta di Dulbecco supplementato con 10% siero fetale di vitello e 50 µ g/mL di penicillina/streptomicina) per ottenere un totale di > 40 µ g di RNA dopo l'estrazione 48 ore più tardi. Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% CO₂.
2. 48 h dopo la semina, aspirare media di sviluppo di 8 mL e 2 mL si lasci alle spalle per evitare l'essiccamento fuori le cellule. Aggiungete 2 mM BrU e qualsiasi trattamento a 8 mL aspirato mezzi di sviluppo e rimuovere il residuo mL 2 dalle cellule prima di riapplicare il 8ml BrU contenenti terreni di coltura. Evitare l'uso dei mezzi freschi su richiesta del BrU, le cellule, poiché questo può indurre cambiamenti nell'espressione genica.
3. Incubare le cellule per 1 h con BrU e trattamento. Lavare le cellule nel buffer di 5ml Hank e tripsinizzano le cellule con tripsina 0.05% 2 mL. Aggiungere 8 mL crescita media per fermare la reazione, trasferire le cellule in una provetta da 15 mL e rotazione verso il basso le cellule per 2 min a 1.000 x g.
4. Rimuovere il supernatante ed estrarre RNA totale dal pellet cellulare utilizzando un isolamento di RNA kit (Vedi Tabella materiali) o qualsiasi altro metodo preferito ed eluire privo di RNasi H₂O. Store il RNA a-80 ° C fino al momento di procedere.

2. preparazione di perline per IP

1. Preparare perline in lotti per il numero di campioni di essere studiato più uno extra per rappresentare perdita durante il pipettaggio e vortice di miscelazione. Risospendere le microsfere magnetiche di IgG anti-topo accuratamente mescolando il vortice e prendere 20 perle µ l per campione in una provetta da 1,5 mL RNAsi-libera. Posto la provetta da 1,5 mL in un supporto magnetico e lasciare circa 20 s per le perline per raccogliere sul lato.
2. Eliminare il surnatante, estrarre il tubo dal supporto magnetico e risospendere in 400 µ l 1 x BrU-IP tampone pipettando. Girare il tubo molto brevemente per 2 s in una centrifuga di tavolo, inserirlo nel supporto magnetico e rimuovere il surnatante. Ripetere la fase di lavaggio una volta.
3. Associazione aspecifici di blocco per le perle utilizzando eparina. Risospendere le sfere in 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL di tampone di eparina e lasciare rotante per 30 min. lavare le perle una volta, come descritto al punto 2.2.
   Nota: L'eparina è un polimero caricato negativamente, che si sfideranno con RNA per l'associazione. tRNA o altro RNAs irrilevante può essere utilizzato anche se l'applicazione a valle non è sequenza.
4. Risospendere le sfere in 1 mL 1 x BrU-IP buffer e aggiungere 1,25 anticorpo di anti-α-bromodeossiuridina µ g/campione, che riconosce anche BrU. Incubare le perline per 1 h durante la rotazione, o durante la notte a temperatura ambiente.
5. Lavare le perle tre volte come descritto al punto 2.2. Risospendere le sfere in 50 µ l di campione 1 x BrU-IP buffer integrato con 1 mM BrU e lasciare a rotazione per 30 min abbassare la sensibilità dell'anticorpo associato ai talloni e con la presente il rischio di associazione non specifico durante IP.
6. Lavare le perle tre volte come descritto al punto 2.2 e risospendere in 50 µ l di campione 1xBrU-IP buffer.

3. associazione del RNA BrU-etichettati per perline

1. Misurare le concentrazioni di RNA in RNA estratti dal passaggio 1.3 tramite spettrofotometro ultravioletto-visibile e diluire 40 µ g RNA da ogni campione in privo di RNasi H₂O a un volume totale di 200 µ l.
2. Riscaldare i campioni di RNA per 2 min a 80 ° C per denaturare il RNA e spin brevemente in una centrifuga da tavolo. Aggiungere 200 µ l 2 x inibitore BrU-IP + BSA/RNasi.
3. Aggiungere 50 µ l risospese e preparato perline dal passaggio 2.6 per ogni campione e lasciare rotante 1 h. lavare le perle quattro volte come descritto al punto 2.2.

4. eluizione e purificazione di RNA mediante estrazione con fenolo-fenolo/cloroformio-cloroformio 3 passi

1. Eluire il RNA ed eseguire estrazione del fenolo
   1. Risospendere le sfere in 200 µ l di tampone di eluizione per eluire RNA e presto da allora in poi aggiungere fenolo di 200 µ l, pH 6.6 (attenzione: tossici, vedi nota sotto passo 4.1.2) per rimuovere eventuali molecole di RNA non dal campione.
   2. Mix di vortice del campione e spin 3 min a 25.000 x g in una centrifuga da tavolo.
      Nota: Fenolo è tossico e deve essere gestita in una cappa aspirante indossa la protezione della pelle. Il pH leggermente acido assicura che solo RNA e non il DNA, viene estratto. il RNA rimarrà nella fase acquosa superiore a causa della natura idrofila di cariche. I nuclei idrofobi delle proteine si legano fenolo e spostare fenolo-fase organica inferiore.
2. Eseguire l'estrazione del fenolo-cloroformio
   1. Aspirare tanto superiore-fase possibile (circa 190 µ l di 200 µ l, a seconda dell'esperienza nella gestione) e spostarlo in un tubo con 200 µ l fenolo/cloroformio, pH 6.6 (attenzione: tossici, vedi nota). Assicurarsi di aspirare lo stesso importo attraverso campioni.
   2. Vortice mescolare il campione e la rotazione per 3 min a 25.000 x g.
      Nota: Cloroformio è tossico e deve essere gestita in una cappa aspirante indossa la protezione della pelle. Cloroformio è aggiunto per rimuovere il fenolo, che possa influenzare l'analisi a valle delle RNA inibendo la trascrizione d'inversione della polimerasi e¹⁴ reazioni a catena¹⁵.
3. Eseguire l'estrazione di cloroformio aspirando la fase acquosa superiore come prima (ora circa 180 µ l) e trasferire in una provetta contenente cloroformio di 200 µ l. Vortice mescolare il campione e spin 3 min a 25.000 x g.
4. Aspirare la fase acquosa superiore come prima (ora circa 170 µ l) e trasferirlo in una provetta contenente 17 µ l (1/10 di volume) 3 M CH₃COONa, pH 6.0. Per neutralizzare e precipitare RNA dalla soluzione acquosa, aggiungere 2 glicogeno µ l (20 mg/mL), che precipita insieme a RNA e rende più visibile la pallina del RNA.
5. Aggiungere 500 µ l di etanolo 96% per aumentare il binding tra il sale ioni e RNA e mescolare capovolgendo la provetta un paio di volte. Lasciare il tubo durante la notte a-20 ° C o 15 min su ghiaccio secco.
6. Spin il campione a 25.000 x g, 4 ° C per 30 min. Discard surnatante senza disturbare il pellet e lavare la pallina in etanolo di 75% µ l 185 per rimuovere qualsiasi residuo di sale. Spin a 25.000 x g, 4 ° C per 5 min.
7. Eliminare il surnatante completamente senza disturbare il pellet e lasciare il pellet a secco 5-10 minuti con un coperchio aperto. Risospendere in 10 µ l, privo di RNasi H₂O applicata sul lato del tubo per evitare di disturbare il pellet.

5. analisi del RNA

1. Preparare cDNA usando una trascrizione inversa di cDNA kit (Vedi Tabella materiali) o qualsiasi altro preferito metodo utilizzando 2 µ l di campione di RNA e 1 µ g lievito RNA totale come elemento portante di RNA per la reazione di sintesi del cDNA (non utilizzata se cDNA è utilizzato per il sequenziamento di nuova generazione). Utilizzare 1 µ g di RNA senza lievito RNA per la preparazione di cDNA di ingresso corrispondente.
2. CDNA diluito 01:25 e mix 9 µ l diluito cDNA con 10 µ l qPCR Master mix e 1 µ l fluorogenic sonda, entrambi specificati nella Tabella materiali.
   Nota: La diluizione di cDNA dipende dalla preparazione di cDNA e qPCR metodo utilizzato.
3. Eseguire il seguente programma di qPCR (ad esempio, su un sistema Fast Real-Time PCR di 7500 o equivalente): 2 min a 50 ° C, 20 s a 95 ° C, 40 cicli di 3 s a 95 ° C e 30 s a 60 ° C.

Risultati

I nostri test iniziale di tempo BrU-etichettatura sono state eseguite in cellule AsPC-1. Le cellule sono state trattate con BrU per 0, 1, 2 e 4,5 h, seguita da estrazione di RNA totale e BrU-IP. GAS5 e GAPDH sono stati misurati in BrU-IP RNA, che ha dimostrato che l'etichettatura 1h era sufficiente per raggiungere un circa 9 e 44 volte cambiamento rispetto allo sfondo (0h) per GAPDH e GAS5, rispettivamente.

BrU-IP e l'analisi so...

Discussione

Questo protocollo descrive l'uso di BrU-IP per determinazione della produzione di RNA mediante etichettatura di recente prodotte RNA per 1 h con BrU, seguita da estrazione di RNA immediata e immunoprecipitazione di RNA BrU-etichettati. Questo metodo precedentemente è stato descritto nel riferimento¹⁶, e in questo articolo include alcuni passaggi aggiuntivi per aumentare la specificità IP e purezza RNA, dai branelli di pre-trattamento con basse concentrazioni di BrU, nonché una fase di purificaz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribolock Rnase inhibitor	ThermoFisher	EO0381
Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG	Life Technologies	11202D
α-Bromodeoxyuridine mouse antibody	BD Bioscience	555627
Nanodrop 1000	Thermo Fisher		Ultraviolet-visible spectrophotometry
Water-Saturated Phenol pH 6.6	ThermoFisher	AM9712
Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6	ThermoFisher	AM9732
High Pure RNA isolation Kit	Roche	11828665001
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher	4368814
Taqman Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444557	qPCR Master Mix
Taqman RNA probes	ThermoFisher	SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1	Flurogenic probes
7500 Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystems
HEK293T cell line	ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Lonza	BE12-604F
Fetal calf serum	Biochrom	S0115
Penicillin/Streptomycin	Biochrom	A2213
Hank's buffer			5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved.
DEPC-H2O			0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O
2xBrU-IP Buffer			40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor			2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL heparin			2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin
1xBrU-IP			2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock
Elution buffer			0.1% SDS in RNAse-free H2O