Enquête de synthèse de l’ARN à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage et immunoprécipitation

Résumé

Cette méthode peut être utilisée pour mesurer la synthèse de l’ARN. 5-Bromouridine est ajouté aux cellules et incorporé dans l’ARN synthétisé. Synthèse de l’ARN est mesurée par l’extraction de l’ARN immédiatement après marquage, suivi par immunoprécipitation 5-Bromouridine-ciblées d’étiquetés RNA et analyse par transcription inverse et la PCR quantitative.

Résumé

Lorsque les niveaux de l’état stationnaire RNA sont comparées entre deux conditions, il n’est pas possible de distinguer si les changements sont causés par des modifications de la production ou la dégradation de l’ARN. Ce protocole décrit une méthode pour la mesure de la production d’ARN, à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage d’ARN suivie d’immunoprécipitation, qui permet l’investigation de l’ARN synthétisé dans un court délai (par exemple, 1 h). L’avantage de 5-Bromouridine-étiquetage et immunoprécipitation sur l’utilisation d’inhibiteurs de transcriptional toxiques, tels que le α-amanitine et l’actinomycine D, est qu’il n’y aucune ou très peu d’effets sur la viabilité cellulaire lors d’une utilisation à court terme. Cependant, parce que le 5-Bromouridine-immunoprécipitation capte seulement RNA produites dans le court délai d’étiquetage, produit lentement comme rapidement dégradés RNA peut être difficile à mesurer par cette méthode. L’ARN 5-Bromouridine-marqué capturé par 5-Bromouridine-immunoprécipitation peut être analysé par transcription inverse, quantitative PCR et séquençage de la génération suivant. Tous les types d’ARN peuvent être l’objet d’une enquête, et la méthode n’est pas limitée à la mesure des ARNm est présenté dans cet exemple.

Introduction

5-Bromouridine (BrU) immunoprécipitation (IP) permet l’étude de la production d’ARN dans les cellules avec no ou des effets très limités sur cellulaire physiologie au cours de la brève période^1,2d’étiquetage. La méthode repose sur l’incorporation du dérivé synthétique de l’uridine BrU en ARN nouvellement synthétisé suivi par IP d’ARN marqué à l’aide d’anticorps anti-BrU (Figure 1).

On sait depuis des décennies que la synthèse de protéine peut être réglée de transcription, et l’existence de facteurs de transcription a émis l’hypothèse il y a plus de 50 ans³. Aujourd'hui, on sait que plusieurs maladies sont causées par le dérèglement de la transcription et de la stabilité de la RNA (complémentaire Figure S1 en référence⁴), et la capacité à mesurer les changements dans la production d’ARN est d’une grande importance dans la maladie de compréhension développement.

En revanche, outils pour réguler la production d’ARN fournissent de nouvelles possibilités pour le traitement de maladies causées par l’expression de protéines trop ou trop peu, ou l’accumulation de protéine comme dans la maladie de Parkinson (MP). La protéine prédominante, accumulant des agrégats comme insolubles dans PD est α-synucléine, et le niveau de la synucléine α est directement lié à la maladie, comme des causes de multiplication de gène du gène α-synucléine familial PD⁵. Par ailleurs, α-synucléine regroupe de manière dépendante de la concentration. Diminution de l’expression des ARNm de la synucléine α est donc une stratégie thérapeutique intéressante, qui a été réalisée avec succès à l’aide de l’interférence ARN pour diminuer la perte des neurones dans PD modèles rongeurs^6,7.

Il est important de pouvoir mesurer les changements dans la production d’ARN causée par une maladie ou des interventions thérapeutiques. Méthodes de pointe pour mesurant les niveaux d’ARN, l’état stationnaire comme transcription inverse suivie par quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), ne sont pas capables de distinguer les changements causés par la régulation de la transcription ou altérés Stabilité de RNA. Une méthode largement utilisée pour l’étude des taux de décomposition de RNA n’entrave de la machinerie transcriptionnelle utilisant des composés tels que le α-amanitine ou l’actinomycine D, suivie par des mesures de l’ARN en décomposition. Cependant, il y a certains problèmes liés à un blocage général de transcription dans des cellules, telles que l’induction de l’apoptose^8,9. À côté des effets cytotoxiques, inhibiteurs de la transcriptionnelles présentent également de nombreux problèmes techniques, comme la lente absorption cellulaire de le α-amanitine et le manque de spécificité de l’actinomycine D (revu en référence¹⁰).

Pour éviter le blocage total de la transcription, analogues nucléotidiques ont été utilisées, comme 5-éthynyl uridine (UE 5), 4-thiouridine (TU-4) et BrU. Ceux-ci sont facilement absorbés par les cellules de mammifères et incorporés dans l’ARN nouvellement synthétisé, permettant pouls-étiquetage de l’ARN dans un délai spécifique. BrU est moins toxique que l’UE 5 et 4-TU, ce qui en fait le préféré analogique de choix^11,12.

BrU-IP peut servir à enquêter sur les deux le taux de synthèse d’ARN et de la stabilité et donc distinguer les causes des changements dans l’ARN total. Cet article se concentrera sur la mesure de la synthèse d’ARN et se réfère pour faire référence ಠpour plus de détails sur l’étude de stabilité de RNA. Pour étudier la synthèse de l’ARN, les cellules sont brièvement étiquetés avec BrU par exemple pendant 1 h puis BrU-IP¹ (Figure 1). Ceci permet des mesures de l’ARN synthétisé dans le court délai d’étiquetage et les changements observés donnera une meilleure estimation des règlements dans la synthèse de l’ARN qu’en mesurant les changements dans l’ARN total par RT-qPCR. Il convient de mentionner, toutefois, que même si le temps d’étiquetage est, par exemple, seulement 1 h, dégradation peut avoir encore une influence sur les niveaux d’ARN observés.

L’ARN à partir des expériences de BrU-IP ne conviennent pas pour analyse en aval par les deux RT-qPCR¹ ou prochaine génération séquençage^2,13. Autres méthodes de détection RNA standards, tels que le transfert de Northern ou dosage de ribonucléase de protection, peuvent également s’appliquer pour certains ARN.

Protocole

Remarque : Exécutez toutes les étapes à la température ambiante, sauf indication contraire et garder les tampons sur la glace ou dans le réfrigérateur (à l’exception de l’élution de la mémoire tampon contenant du SDS). Le protocole est divisé en 5 sections : échantillons de la préparation de l’ARN ; préparation des perles de la propriété intellectuelle ; liaison de l’ARN marqué BrU de perles ; élution et la purification d’ARN de BrU-étiqueté lié par extraction de 3 étapes de phénol-phénol/chloroforme-chloroforme ; analyse de l’ARN (dans cet exemple à l’aide de la RT-qPCR)

1. préparation des échantillons d’ARN

1. Cellules HEK293T comte utilisant une cellule automatisée contrer et 3 500 000 cellules dans un plat de Pétri de 10 cm dans 10 mL de milieu de croissance (milieu de l’aigle de la modification de Dulbecco additionné de 10 % de sérum de veau foetal et 50 µg/mL de pénicilline/streptomycine) des graines afin d’obtenir un total de > 40 µg RNA après extraction 48 h plus tard. Maintenir les cellules à 37 ° C et 5 % de CO₂.
2. 48 h après l’ensemencement, aspirer 8 mL de milieu de croissance et laisser 2 mL pour éviter le dessèchement des cellules. Ajouter 2 mM BrU et tout traitement à 8 mL aspiré des milieux de culture et enlever les résidus de 2 mL des cellules avant de rebrancher le 8 mL de milieu de culture contenant BrU. Évitez d’utiliser des supports neufs, à la demande de la BrU aux cellules, puisque ceci peut induire des changements dans l’expression des gènes.
3. Incuber les cellules pendant 1 h avec BrU et traitement. Laver les cellules dans un tampon de 5 mL Hank et trypsinize les cellules à l’aide de trypsine de 0.05 % de 2 mL. Ajoutez 8 mL de milieu de croissance pour arrêter la réaction, transférer les cellules dans un tube de 15 mL et tournez en bas les cellules pendant 2 min à 1 000 x g.
4. Retirez le surnageant et extrait le culot cellulaire à l’aide d’un ARN de l’ARN total nécessaire (voir la Table des matières) ou tout autre méthode préférée et éluer exempte de RNase H₂O. magasin de l’ARN à-80 ° C jusqu’au moment de procéder.

2. préparation des perles de la propriété intellectuelle

1. Préparer les perles en lots pour le nombre d’échantillons à étudier plus un supplémentaire pour tenir compte des pertes pendant le pipetage et whirl mélange. Remettre en suspension les billes magnétiques de anti-souris IgG soigneusement par le mélange de tourbillon et retirer 20 perles µL par échantillon dans un tube de 1,5 mL de RNase-libre. Place le tube de 1,5 mL dans un support magnétique et laisser environ 20 s pour les perles pour recueillir sur le côté.
2. Retirez le surnageant, sortir le tube du support magnétique et resuspendre dans 400 µL de tampon de BrU-IP 1 x par pipetage. Tourner le tube très brièvement pour 2 s dans une centrifugeuse de table-top, placez-le dans le socle magnétique et éliminer le surnageant. Répéter une fois l’étape de lavage.
3. Liaison non-spécifique de bloc aux billes à l’aide de l’héparine. Remettre en suspension les perles dans 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL de tampon de l’héparine et laisse tourner pour 30 min. Lavez les perles une fois, comme dans l’étape 2.2.
   Remarque : L’héparine est un polymère chargé négativement, qui sera en concurrence avec l’ARN pour la liaison. ARNt ou autres ARN non pertinent aussi peut être utilisé que si l’application en aval n’est pas séquençage.
4. Remettre en suspension les perles dans 1 mL 1 x tampon de BrU-IP et ajoutez 1,25 µg/échantillon anti-α-bromodéoxyuridine anticorps, qui reconnaît également BrU. Incuber les perles pendant 1 h pendant la rotation, ou jusqu’au lendemain à la température ambiante.
5. Laver les perles trois fois comme au point 2.2. Remettre en suspension les perles dans 50 µL/sample 1 x tampon de BrU-IP additionné de 1 mM BrU et laisser tourner pendant 30 min diminuer la sensibilité de l’anticorps lié aux talons et par la présente le risque de liaison non-spécifique au cours de la propriété intellectuelle.
6. Laver les perles trois fois comme à l’étape 2.2 et remettre en suspension dans un tampon 50 µL/échantillon 1xBrU-IP.

3. liaison d’ARN marqué BrU à perles

1. Mesurer les concentrations de RNA dans les extraits de RNA de l’étape 1.3 par spectrophotométrie UV-visible et diluer 40 µg RNA chaque échantillon libre de RNase H₂O pour un volume total de 200 µL.
2. Chauffer les échantillons d’ARN pendant 2 min à 80 ° C pour dénaturer l’ARN et essorage brièvement dans une centrifugeuse de table. Ajouter 200 µL 2 x inhibiteur de RNAse-IP + BSA/BrU.
3. Ajouter 50 µL resuspendues et préparé des billes de l’étape 2.6 pour chaque échantillon et laisser tourner 1 h. lavage les perles quatre fois comme à l’étape 2.2.

4. élution et la Purification de l’ARN par Extraction au phénol-phénol/chloroforme-chloroforme 3 étapes

1. Éluer l’ARN et d’effectuer l’extraction de phénol
   1. Remettre en suspension les perles dans 200 µL de tampon d’élution pour éluer l’ARN et rapidement par la suite ajouter 200 phénol µL, pH 6,6 (attention : toxique, voir note ci-dessous étape 4.1.2) pour éliminer toute non-RNA des molécules de l’échantillon.
   2. Tourbillon de mélanger l’échantillon et un essorage 3 min à 25 000 x g dans une centrifugeuse de table.
      NOTE : Phénol est toxique et doit être manipulé sous une hotte portant protection de la peau. Le pH légèrement acide veille à ce que seulement les ARN et pas d’ADN, est extraite. L’ARN restera dans la phase aqueuse supérieure en raison de la nature hydrophile de charges. Les noyaux hydrophobes des protéines lient le phénol et passer à la phénol-phase organique inférieure.
2. Effectuer l’extraction de phénol-chloroforme
   1. Aspirer autant phase supérieure possible (environ 190 µL de la 200 µL, selon l’expérience dans la manutention) et le mettre dans un tube avec 200 µL phénol/chloroforme, pH 6,6 (attention : toxique, voir la note). Veillez à aspirer la même quantité dans les trois échantillons.
   2. Tourbillon mélanger l’échantillon et un essorage pendant 3 min à 25 000 x g.
      NOTE : Chloroforme est toxique et doit être manipulé sous une hotte portant protection de la peau. Chloroforme est ajouté au phénol, qui peut affecter l’analyse en aval de l’ARN par inhibition de la transcription inverse¹⁴ et amplification des réactions en chaîne¹⁵.
3. Effectuer l’extraction de chloroforme en aspirant la phase aqueuse supérieure comme avant (maintenant environ 180 µL) et transférer dans un tube contenant le 200 µL chloroforme. Tourbillon mélanger l’échantillon et tourner 3 min à 25 000 x g.
4. Aspirer la phase aqueuse supérieure comme avant (maintenant environ 170 µL) et transférez-le dans un tube contenant 17 µL (volume 1/10) 3M CH₃COONa, pH 6,0. Pour neutraliser et précipiter RNA de la solution aqueuse, ajouter 2 glycogène µL (20 mg/mL), qui précipite ainsi que RNA et rend le culot de RNA plus visible.
5. Ajouter 500 µL 96 % d’éthanol pour augmenter la liaison entre les ions salins et les ARN et les mélanger en renversant le tube une couple de fois. Maintenir le tube nuit à-20 ° C ou 15 minutes sur la glace sèche.
6. Faites tourner l’échantillon à 25 000 x g, 4 ° C pendant 30 min. jetez surnageant sans déranger le culot et laver le culot dans 185 µL 75 % d’éthanol d’enlever n’importe quel sel résiduel. Tourner à 25 000 x g, 4 ° C pendant 5 min.
7. Jeter le surnageant complètement sans déranger le culot et laisser le culot pour sécher 5-10 min avec un couvercle ouvert. Resuspendre dans 10 µL exempte de RNase H₂O appliqué sur le côté du tube pour éviter de déranger le culot.

5. analyse de l’ARN

1. Préparer le cDNA utilisant une ADNc de la transcription inverse nécessaire (voir la Table des matières) ou tout autre préféré méthode utilisant 2 µL d’échantillon RNA et 1 µg levure ARN total comme transporteur RNA pour la réaction de synthèse de cDNA (non utilisée si l’ADNc est utilisé pour l’ordonnancement de la génération suivante). Utilisez 1 µg RNA sans levure RNA pour préparation de cDNA de l’entrée correspondante.
2. ADNc diluée 01:25 et mélange 9 µL dilué d’ADNc avec 10 µL qPCR Master 1 µL fluorogène sonde et mélange les deux spécifiés dans la Table des matières.
   Remarque : La dilution de l’ARNC dépend de la préparation de l’ARNC et qPCR méthode utilisée.
3. Exécutez le programme suivant de qPCR (par exemple, sur un système rapide de Real-time PCR 7500 ou l’équivalent) : 2 min à 50 ° C, 20 s à 95 ° C, 40 cycles de 3 s à 95 ° C et 30 s à 60 ° C.

Résultats

Nos premiers tests de temps de BrU-étiquetage ont été effectuées dans les cellules CPIRA-1. Les cellules ont été traitées avec BrU 0, 1, 2 et 4,5 h, suivie par l’extraction de l’ARN totale et BrU-IP. GAS5 et GAPDH ont été mesurés dans l’ARN BrU-IP, ce qui démontre que l’étiquetage 1 h est suffisant pour atteindre un changement environ 9 et 44 fois comparé à fond (0 h) pour GAPDH et GAS5, respectivement.

BrU...

Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation de BrU-IP pour la détermination de la production d’ARN par étiquetage des nouvellement produites RNA pendant 1 h avec BrU, suivie d’extraction de l’ARN immédiate et immunoprécipitation d’ARN marqué BrU. Cette méthode a déjà été décrit dans référence¹⁶, et cet article comprend quelques étapes supplémentaires pour augmenter la spécificité de la propriété intellectuelle et de la pureté de RNA, par prétraitement des billes avec de faibl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ribolock Rnase inhibitor	ThermoFisher	EO0381
Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG	Life Technologies	11202D
α-Bromodeoxyuridine mouse antibody	BD Bioscience	555627
Nanodrop 1000	Thermo Fisher		Ultraviolet-visible spectrophotometry
Water-Saturated Phenol pH 6.6	ThermoFisher	AM9712
Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6	ThermoFisher	AM9732
High Pure RNA isolation Kit	Roche	11828665001
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher	4368814
Taqman Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444557	qPCR Master Mix
Taqman RNA probes	ThermoFisher	SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1	Flurogenic probes
7500 Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystems
HEK293T cell line	ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Lonza	BE12-604F
Fetal calf serum	Biochrom	S0115
Penicillin/Streptomycin	Biochrom	A2213
Hank's buffer			5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved.
DEPC-H2O			0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O
2xBrU-IP Buffer			40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor			2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL heparin			2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin
1xBrU-IP			2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock
Elution buffer			0.1% SDS in RNAse-free H2O