JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן נתאר פרוטוקול כדי לקבוע נטל פטרייתי ריאתי בעכברים עם aspergillosis פולשנית באמצעות כימות של כסף methanamine שונה של Gomori מכתים בסעיפים היסטולוגית. השימוש בשיטה זו הביאה תוצאות דומות עם פחות בעלי חיים לעומת הערכה של הנטל פטרייתי מאת PCR כמותי של ריאות פטרייתית דנ א.

Abstract

כימות של ריאות פטרייתית הנטל הוא קריטי לקביעת רמות היחסי של מערכת החיסון הגנה, התקפה אלימה פטרייתי במודלים של העכבר של זיהום פטרייתי ריאתי. למרות שיטות מרובות משמשים כדי להעריך את הנטל פטרייתי, כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) של ה-DNA פטרייתי התפתחה טכניקה עם כמה יתרונות על פני שיטות קודמות המבוסס על תרבות. כיום, אבחון מקיף של הריאה פתולוגיה, ליקוציט גיוס, נטל פטרייתי, ביטוי גנים בעכברים עם aspergillosis פולשנית (IA) מחייבת השימוש של מספר משמעותי של ניסיוני ובעלי שליטה. כאן כימות של הריאה היסטולוגית מכתים כדי לקבוע נטל פטרייתי באמצעות מספר מצומצם של בעלי חיים נבחנה בהרחבה. ריאות מקטעים היו מוכתם לזהות מבנים פטרייתי בכסף ששונה methanamine של Gomori (גרמים) מכתים. התמונות צולמו מהמקטעים שהוכתמו סקאוטרים משדות דיסקרטית 4 הריאות כל פורמלין-קבוע פרפין-מוטבע. גרמים אזורים בתוך כל תמונה צבעונית היו לכמת באמצעות תוכנית ניתוח תמונה, של כימות הזה, האחוז הממוצע של האזור המוכתם נקבע עבור כל דגימה. באמצעות אסטרטגיה זו, עכברים eosinophil לקויה הציג ירד הנטל פטריות ומחלות בטיפול קספופונגין, בעוד פראי-סוג עכברים עם. חקירות פנים לא שיפר עם קספופונגין. באופן דומה, נטל פטרייתי בעכברים חסר γδ T תאים שופרו גם על ידי קספופונגין, כפי שהיא נמדדת qPCR, כימות גרמים. כימות סקאוטרים הוא הציג ולכן כשיטה מצפני העול פטרייתי ריאות היחסית בסופו של דבר עשוי להפחית את הכמות של חיות ניסוי הדרושים עבור מחקרים מקיפים של aspergillosis פולשנית.

Introduction

IA הוא זיהום אופורטוניסטי שעשויות להתפתח אצל אנשים רגישים עם ליקויים החיסונית מולדות או נרכשות עקב טיפול מדכא מערכת החיסון או דלקת כרונית1,2. זיהום ראשי לעיתים קרובות מתהווה בריאות, למרות כמה מופעים הפצת אספרגילוס fumigatus הכבד, הכליות, הלב, והיא המוח עלולה להתרחש, וכתוצאה מכך רקמה מקיף הפלישה hyphae מלווה על ידי מחלה קשה וגבוה שיעורי התמותה1,2. יתר על כן, היעילות של pharmacotherapies קיימת מוגבלת, עשוי להיות נחלש עוד יותר על ידי הופעתם של זני פטריות עמיד של הסביבה3. לכן חשוב להבין את המנגנונים של הפתולוגיה התקפה אלימה ומנחה פטרייתי לקדם פיתוח או החרפה של מחלה פטרייתית פולשנית.

מודלים מאתר נשארים חשוב ללימודים IA מכניסטית, בכך שהם מאפשרים לחוקרים להעריך את התפקידים של התקפה אלימה פטרייתי גנים ולארח effectors החיסון עבור הקמת צמיחה של4, ויוו א fumigatus5. כתוצאה מכך, יש אסטרטגיות מרובות ויוחאי ביעילות לכמת או להשוות נטל פטרייתי בקבוצות של חיות ניסוי6,7. אסטרטגיות אלו כרוכים מבוסס על תרבות, ביוכימי, מתכלה, או qPCR שיטות, כל אחת עם יתרונות וחסרונות. יתר על כן, כל השיטות האלה כרוכים ההקדשה של קבוצת משנה של בעלי חיים בנוסף לאלה מקריב. הערכות של תפקוד המערכת החיסונית אפקטור, ביטוי מפענוח השוואתי histopathology7. לכן, מחקרים מקיפים IA דורשים לעיתים קרובות במספרים משמעותיים של מחקר חיות בעלות משמעותית. אסטרטגיות אפקטיביות להפחית זמן הניסוי, עלויות בעלי חיים, שיקולים אתיים על ידי ניצול ברקמות בעלי חיים עבור ניתוחים מרובים ולכן הם יקרי7.

בדו ח זה, הוא הציג שיטה המתארת כימות של סקאוטרים מכתים בסעיפים היסטולוגית להשוואה של הנטל פטרייתי היחסי בין קבוצות הניסוי של עכברים עם. חקירות פנים. כל שלב מתרבות פטרייתי הזיהום, רקמות הקציר, עיבוד, ושל ייבוא תמונות ניתוח נתונים, מתואר בפירוט. הנטל פטרייתי התקבלו ע י כימות סקאוטרים הושוו עם qPCR neutropenic מודלים של IA, וכן מטופלים קספופונגין עכברים פראי-סוג או eosinophil לקויה עם חקירות פנים8. התוצאות מציגות דמיון עם סקאוטרים כמת, qPCR של ה-DNA פטרייתי. זה מרמז כי סקאוטרים כימות עשוי להיות שימושי כדי החוקרים העוסקים בניתוח היסטולוגית כשיטה משלימה או אלטרנטיבית של השוואה של הנטל היחסי פטרייתי בעכברים עם. חקירות פנים, בסופו של דבר עשוי להפחית את העלות ואת משימוש למחקר בבעלי הלימודים מורכבים, מכניסטית.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של אינדיאנה סטייט, הקמפוס המארח של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה – הוט.

1. הכנת fumigatus א Conidia על זיהום

  1. בעת העבודה בברדס fume מאוורר היטב, להוסיף µL 125 של פתרון מניות fumigatus א 293 900 µL תא תרבות כיתה מים (CCGW). ואז להעביר את הפתרון תמצית צלחת אגר (מאה) באמצעות פיפטה מה תשתה, אדוני, נמרח בקלות עם לולאה לחסן.
  2. אחסן את הצלחת פטרייתי בחושך ב 24 מעלות צלזיוס לפחות 14 ימים ולא יותר מ- 28 ימים.
  3. Conidia הקציר באמצעות חרוזי זכוכית כאמור תיאר9.
  4. שופכים 1.5 גר' 0.5 מ מ חרוזי זכוכית לצלחת, בעדינות להטות את זה אחורה וקדימה עד החרוזים הם מצופה כדי לחלץ conidia. לאסוף את התערובת חרוז/conidia צינור חרוטי 15-mL. להשעות של Dulbecco מ ל תמיסת מלח באגירה פוספט (DPBS) ו מערבולת.
  5. לספור את conidia ב 50 x לדילול תגובת שיקוע ב DPBS באמצעות hemocytometer. לספור את מספר conidia באזור המוצג באיור 1 ולהשתמש משוואה 1 כדי לחשב את הריכוז.
    גורם לדילול × #Conidia × 104= Conidia/mL (משוואה 1)
    הערה: שטחים נוספים של פינה מרובעת 4 x 4 יכול לספור עם הממוצע של אזורים אלה משמשים #Conidia משוואה1.

figure-protocol-1363
איור 1: Hemocytometer נציג שטח המשמש conidia סומך (תיבת, חץ).

  1. לדלל את המתלים conidia עם סליין סטרילי (DPBS) כדי לקבל את הריכוז הרצויה, 1.0 x 108 conidia/mL עבור זיהום עם 5 x 106 conidia/50 µL. להכין 50 µL ' של conidia פתרון לכל ' n + 2' עכברים נגועה לחשבון עבור pipetting שגיאה.
    הערה: קציר פטריות רגיל ולסינון/הכנה ייתכן לחלופין בשימוש10. השיטה חרוז זכוכית מומלץ להשתמש כדי להבטיח כי דגימות conidia עם אנטיגנים hyphal קטן/מסיסים מינימלי מתקבלים עבור השאיפה.

2. החיסוני, זיהום של המודל מאתר

  1. השתמש 7-10-בת שבוע עכברים.
    הערה: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinophil לקויה (ΔdblGATA, רקע BALB/c), γδ תא T לקויה (TCRδ-/-, רקע B6) עכברים השתמשו במחקר זה. עבור כל ניסוי, גיל, התאימו מגדר עכברים (זכרים ונקבות) שימשו עבור כל קבוצה.
  2. לרוקן נויטרופילים ויה בקרום הבטן (IP) הזרקה של 0.1 מ"ל (0.5 מ ג) נוגדן אנטי-mouse-Ly - 6G במלח סטרילית-45° ברביע התחתון הנכון לרוחב (עבור לוח זמנים של ניסיוני, ראה איור 2).
  3. 24 שעות לאחר מכן, להדביק עכברים על ידי השאיפה עם 5.0 x 10 conidiafumigatus א 6, הושעו ב-50 µL מלח סטרילית (ראה שלבים 2.4-2.10) כאמור תיאר11. בעקבות זיהום, להזריק תת-ערכה של חיות עם סוכן פטריות כגון diacetate קספופונגין 5 מ"ג/ק"ג ב DPBS השתמשו במחקר זה (מדי יום, ראה איור 2).
  4. עזים ומתנגד עכברים עם איזופלוריין 99.9% באמצעות מכונת הרדמה וטרינרי.
    1. מניחים מגבת נייר על הרצפה של החדר אינדוקציה לתפוס צואה ושתן.
    2. הנח את העכבר בבית הבליעה אינדוקציה, לאבטח את המכסה והגדר את מכשיר אידוי לאיזופלוריין 5% עבור 2 דקות ו- 30 s.
      הערה: משחה הוטרינר אינו משמש כי הזמן הכולל תחת הרדמה היא פחות מ- 5 דקות.
    3. להפחית את מכשיר אידוי חצי בהגדרה המרבית עבור 30 s.
  5. לאשר העכבר הוא מורדם כראוי על ידי התבוננות האטה, חוסר תנועה ונשימה חוסר תגובה לגירוי הבוהן-קורט.
  6. הסר את העכבר לשכת הגיוס והמקום על לוח שיפוע. הנח את העכבר עם גבו מול הלוח. ודא החותכות העליונות שלה בעדינות מאופקים עם גומייה החותכות התחתון בעדינות מאופקים עם חוט מתכת.
  7. בזהירות להחזיק את הלשון מלאה עם מלקחיים קטנים, פיפטה µL 50 conidia/PBS השעיה בבסיס הלשון.
  8. . נצור את לשונך על שלוחה מלא; הקשיבו נשימה מהירה, רעש הנקישה ברורים של השאיפה. להחזיק 20 s או עד ההשעיה היא aspirated באופן מלא.
  9. להסיר את העכבר מהלוח שיפוע ומניחים בעדינות בתוך כלוב להשגחה.
  10. בעקבות שאיפה, העכבר צריך להכרה בתוך 1 מינימלית צג העכבר עד בהכרה מלאה, מסוגל ללכת מסביב לכלוב. צריך להיות מאילן 21 ° C, במעקב פעמיים ביום עד הריאות נקצרים החיות.
  11. חזור על דלדול של נויטרופילים (שלב 2.2) 24 שעות לאחר הפגיעה (איור 2).

figure-protocol-4244
איור 2: לוח הזמנים ניסיוני. איור זה שונה מן הפרסום הקודם8.

3. הקציר ושימור של הריאות העכבר לבדיקה היסטולוגית

  1. עמוק עזים ומתנגד החיה עם מנה קטלנית של 0.1 מ"ל של 390 מ"ג/מ"ל סודיום פנטוברביטל פתרון IP.
  2. לאשר המתת חסד על ידי התבוננות חוסר נשימה ספונטנית, היעדר תגובה גירוי איבר עם פינצטה. ברגע מורדמים, לרסס את הגווייה עם 70% אתנול לחטא.
  3. מקם את הגווייה על לוח מוקצף מכוסה רכיב pad סופג.
    הערה: הגווייה יוצבו על גבו עם סיכות אבטחת כל ארבעת הגפיים ללוח קצף.
  4. פתח את החזה העליון באמצעות מספריים בזהירות. לחתוך את כלוב הצלעות על מנת לחשוף את הריאות והלב. חותכים הכלילי התחתון כדי לאפשר זלוף. להימנע חיתוך כלי הדם ניקב את האיברים.
  5. לאט לאט perfuse עם 5 מ של DPBS קר בתוך החדר הימני של הלב בזווית של 45 מעלות עם מחט 25-G. חזור על זלוף 5 מ של 10% פורמלין.
  6. בזהירות לחשוף את קנה הנשימה ולנתק את רפידות השומן שמסביב. משנה זהירות ולהימנע ניקב את קנה הנשימה. ודא שרקמת חיבור עודף מוסר כדי להמחיש באופן מלא קנה הנשימה לפני שתמשיך. ברגע קנה הנשימה חשוף, במקום מלקחיים תחת קנה הנשימה להעלות את זה.
  7. לעשות חור קטן קנה הנשימה העליונות באמצעות מחט 25-G.
    הערה: החור צריך למקם כך הצינורית כולו מתאים לקנה. . בזהירות כדי למנוע קריעה קנה הנשימה.
  8. הכנס בצינורית דרך החור, לכיוון הריאות. אבטח את הצינורית עם חוט כירורגי קשור באופן רופף סביב קנה הנשימה.
    הערה: אם קנה הנשימה קרוע, ניתן למקמם את הצינורית דרך קנה הנשימה ככל האפשר דרכי הנשימה.
  9. באמצעות מזרק, מנפח הריאות עם 1 מ ל 10% מאגר פורמלין דרך הצינורית. ודא כי האינפלציה של הריאות הוא גלוי. אם לא, להתאים את הצנתר וחזור. ברגע הריאות הם מנופח, להסיר את הצינורית בזהירות ובמהירות להדק את החוט בצורה מאובטחת לאטום את קנה הנשימה.
    הערה: אם קנה הנשימה הוא נקרע, לא יכול לנפח את הריאות, עדיין עשויים להיות שנקטפו הריאות, אך הדבר עלול למנוע קיבוע נאות.
  10. הסר בעדינות את קנה הנשימה והריאות מבית החזה על ידי בקפידה ניתוק רקמת החיבור של קנה הנשימה עם מלקחיים תוך משיכת בעדינות החוט. הכנס צינור חרוטי 50-mL 15 מ ל 10% פורמלין מאגר בריאות, קנה הנשימה. מקם קצה אחד של החוט מחוץ הצינור, לאטום את הכובע. היפוך צינור כדי לגמרי להטביע את הדגימה לשבועיים.
  11. אחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר לפחות 24 שעות או עד עיבוד נוסף.
    התראה: פורמלין הוא דבר מסוכן ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כולל משקפי מגן, מסיכת פנים. לעבוד תחת ברדס כימי בעת עיבוד הדגימות.

4. הקציר ושימור של הריאות העכבר עבור נטל פטרייתי דנ א

  1. בצע את שלבים 3.1-3.5 כפי שתואר לעיל על עכבר נפרד.
  2. לאט לאט perfuse עם 10 מ"ל של DPBS קר בתוך החדר הימני של הלב בזווית של 45 מעלות עם מחט 25-G.
  3. לסלק את הריאות עם מספריים ולמקם mL 1.5 שכותרתו צינורות.
  4. לאחסן את הריאות ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד נוסף.
  5. להשתמש בטכניקות סטנדרטי כמתואר (הטבעה ואת חלוקתה) ועל פי הפרוטוקולים של היצרן (ראה טבלה של חומרים).

5. מיקרוסקופ והדמיה

  1. פתח את התוכנית כימות הדמיה (ראה טבלה של חומרים).
  2. באמצעות מיקרוסקופ אור, להשיג לפחות 4 תחומי ברורים סקאוטרים צבעונית שקופיות (המטרה X 10). להבטיח שתמונות נציג של דרכי הנשימה נגועים בתוך הריאה עם צפיפות רקמה דומה.
    הערה: אם צפיפות, התפלגות של מוקדים hyphal מופיעים שונה במידה ניכרת בין קבוצות ניסוי ובקרה, שדות נוספים עשוי להילקח, או האזור סקאוטרים של המקטע כל הריאה ייתכן לדימות (4 X המטרה). להשיג כמה תמונות של האזורים של הריאות (המזוהה על-ידי רקמות המקביל מורפולוגיה) על מקטע ריאות טורי מוכתם hematoxylin ואאוזין, אם רצונך בכך.
  3. להוסיף קווי מידה לתמונות במידת הצורך ולשמור את התמונות כדי ניתן לכמת. בחירה, עריכה > הוסף/ערוך כיול סימני > תפריט: בחר גודל בר עובי, צבע, מידה קו > לחצו על התמונה עבור איפה סרגל קנה מידה כדי למקם. סגירת התפריט ולבחור, עריכה > מיזוג > למזג סימנים כיול > לבחור קובץ שמירה בשם > שם לקובץ ולאחר מכן לחץ על שמור.

6. שימוש את תוכנית עיבוד התמונה כדי לחשב את הנטל פטרייתיים (איור 3)

  1. פתח את תוכנית עיבוד תמונה. בחר קובץ > תיקיה עם דגימות לכמת > תמונה (איור 3 א). בחר את התמונה > סוג > להמיר ל- "RGB מחסנית" (איור 3B).
  2. השתמש במקש חץ ימינה כדי לבחור השני של שלוש תמונות נתון (איור 3B). פגע "control + shift + T" להעלות את "סף" תפריט הגדרות ומתאם (איור 3C). אתר את התמונה המקורית של .tiff או. jpg כהפניה ופתח עם תמונה הצגת התוכנית (איור 3C).
  3. משוך את המחוון למעלה עד הסוף שמאלה, התאם את המחוון התחתון עד האזור שנבחר (באדום) הוא נציג של תמונת מיקרוסקופ (בדרך כלל החל מ- 130-160 כמצוין שבצד המחוון (איור 3C).
  4. ברגע שנבחר, הקש על "קבע" > "אישור" (דמות תלת-ממד). בחר 'נתח' > "הגדרת המידות" > בדוק "אזור, אזור השבר, הגבלה על הסף, הצג תווית" ולהשאיר את ההגדרות התחתון (את התפריט הנפתח ואת העשרונית) כברירת מחדל > "אישור" (דמות תלת-ממד).
  5. אזורים משמעותי של רווח לבן או צביעת הרקע אולי ייכללו לפי בחירה של הרקמה המתאימה עם כלי שטח או מצולע.
  6. לבסוף לבחור, "נתח" > "מדידה" (יופיע חלון עם נתונים או כרטיסיה בשורת המשימות של windows יופיע בתווית, "תוצאות") (איור 3E). להעביר את המידע תוכנית ניתוח נתונים עבור יצירת גרפים וניתוח סטטיסטי.
  7. הזן הממוצע של האחוזים אזור ארבע עבור כל דגימה ריאות. 5-8 דגימות הן בדרך כלל מספקות לזהות הבדלים משמעותיים בין הקבוצות. אם השוואה בין שתי קבוצות הניסוי, לבצע של סטודנט אינטראקצית t-מבחן כדי לקבוע מובהקות.

figure-protocol-9906
איור 3: נציג צילומי מסך עבור כל שלב של סקאוטרים היסטולוגית שדה כמת. (א) בחר קובץ > תיקיה עם דגימות לכמת > בחר תמונה. (B) בחר תמונה > סוג > להמיר ל- "RGB מחסנית". השתמש במקש חץ ימינה כדי לבחור השני של שלוש תמונות נתון. (ג) להיט "control + shift + T" להעלות את "סף" תפריט הגדרות ומתאם. אתר את התמונה המקורית של .tiff או. jpg כהפניה ופתח בתוכנית מציג תמונה. משוך את המחוון למעלה כל הדרך שמאלה, התאם את המחוון התחתון עד האזור שנבחר (באדום) הוא נציג של תמונת מיקרוסקופ (בדרך כלל החל מ- 130-160 כמצוין שבצד המחוון. (ד) לאחר מסומנת לחץ "קבע" > "אישור". בחר 'נתח' > "הגדרת המידות" > בדוק "אזור, אזור השבר, הגבלה על הסף, הצג תווית" ולהשאיר את ההגדרות התחתון (את התפריט הנפתח ואת העשרונית) כברירת מחדל > "אישור". (E) ולבסוף בחר "נתח" > "מדידה" (יופיע חלון עם נתונים או כרטיסיה בשורת המשימות של windows יופיע שכותרתו "תוצאות"). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

7. דנ א נטל פטרייתי

  1. הסר את הריאות-80 ° C ולאחר lyophilize במשך 4 שעות לפחות (בן לילה הוא אופטימלי) או עד יבש לחלוטין על-ידי מערכת ההקפאה יבש.
  2. בעוד הריאות הם ייבוש, להכין מאגר של הפקת דנ א (0.1 M NaCl, 10 מ מ EDTA pH 8.0, 10 מ מ טריס HCl pH 8.0, ו- 0.5% מרחביות).
  3. מקום המאגר מיצוי הדנ א מוכן באמבט מים 60 ° C כדי לחמם. בנוסף, המקום פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25:24:1) צינור חרוטי 50-mL ולאפשר הפרדה.
  4. מקם את הריאות lyophilized צינור 2-mL בורג מכסה 0.2 מ של חרוזי זכוכית. באמצעות מכה חרוז, לטחון את רקמת הריאה יבש עבור s 15-30 עד להיווצרות אבקה.
  5. להוסיף מאגר ה-DNA החילוץ חמים 0.8 מ ל כל שפופרת של מערבולת היטב. דגירה כל שפופרת למשך 15 דקות אמבט חרוז 65 ° C, ואז מערבולת לפני המקננת למשך 15 דקות נוספות. לאחר המקננת, מערבולת, ולאחר מכן צנטריפוגה צינורות ב g 25,000 x למשך 10 דקות.
  6. תווית 3 זוגות 1.5 mL צינורות לכל אחת הדגימות ולהעביר את השכבה העליונה של תגובת שיקוע לתוך מערכת אחת של צינורות. שימוש באזהרה בעת pipetting את השכבה העליונה מימית כדי שלא להפריע למטופלים השכבה האמצעית.
  7. להוסיף נפח שווה של אלכוהול פנול: כלורופורם: isoamyl ומערבבים היטב. ואז צנטריפוגה ב g x 25,000 למשך 15 דקות לפני pipetting את השכבה העליונה לתוך הסט השני של צינורות.
  8. להוסיף נפח שווה של כלורופורם: isoamyl כלורופורם, מערבבים היטב, צנטריפוגה-g x 25,000 עבור 10 דקות פיפטה בקפידה את השכבה העליונה לתוך סדרה של צינורות.
  9. להוסיף 500 µL של אלכוהול איזופרופיל 50 µL NaoAc (pH 5.2), מערבבים היטב, ומאפשרים דגימות דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. צנטריפוגה ואז ב g x 25,000 למשך 30 דקות, decant את תגובת שיקוע.
  10. לשטוף בגדר DNA עם 750 µL של אתנול 70% קר קרח, צנטריפוגה עבור 5 דקות ב x 25,000 ג'י Decant האתנול ולאפשר שכדורי לאוויר יבש את החצוצרות שלה ב ציטוטוקסיקה למשך 40 דקות.
  11. Resuspend כדורי יבש ב- 300 µL טה המאגר.
    הערה: ה-DNA ניתן לאחסן ב-20 ° C עד לכמת.
  12. לכמת הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים ולהכין µL 100 של 0.2 µg µL של כל מדגם ה-DNA לניתוח qPCR.
  13. לבצע qPCR סטנדרטי שהפקידים שתואר קודם לכן גם עם µg 1 של דנ א, פריימר rDNA 18S פטרייתי, ומגדיר בדיקה עם כ'חטיף בדיקה שונה (5'- / 56-FAM/אילנה CGG חטיבתי/זן/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/3 ')12,13.
  14. להכין עיקול רגיל של הדנ א fumigatus א , לחשב את ריכוז הדנ א פטרייתי ב pg בכל דגימה באמצעות הכתב הממוצע לצבוע Ct ערכים.
  15. להתוות את pg/µg של ה-DNA פטריות עם שגיאת התקן של הממוצע. ביצוע של תלמיד t-מבחן ניתוח כדי לקבוע מובהקות.
    הערה: כפי פחות רעיל אלטרנטיבה הפקת דנ א פנול-כלורופורם המשמשות בתקנון, עמודה מבוסס DNA מיצוי ערכות יכול לשמש.

תוצאות

איור 4 כולל גרף של הישרדות מסוג הפרוע או לקויה eosinophil עכברים עם. חקירות פנים שטופלו קספופונגין. התוצאות מציגות לקויה eosinophil עכברים הציג הישרדות מוגברת בהשוואה לפראי-סוג עכברים (50% תמותה לעומת התמותה 100%, בהתאמה). איור 5 מציג סקאוטרים נציג מכתים מ neutropenic פראי-סוג והן eosinophil לקויה עכברים עם. חקירות פנים מטופלים או מטופל עם קספופונגין. קספופונגין הטיפול הביא היחסי פטרייתי בטחוני בעוד eosinophil לקויה, אבל לא פראי-סוג עכברים (לוחות נכון), ואילו בשתי הקבוצות לא קיבלו קספופונגין היו דומים (לוחות שמאלה). איור 6 מציג ההשוואה של הנטל פטרייתי ב שטופלו קספופונגין ולשלוט שלא טופלו עכברים פראי-סוג או eosinophil לקויה, באמצעות שתי qPCR של DNA פטרייתיים (איור 6A), נציג סקאוטרים כימות של 4 (10 X המטרה) שדות ( איור 6B). התוצאות שהופקו מן בשתי הטכניקות מראים כי תוצאות הטיפול קספופונגין הנטל פטרייתי המשמעותי ביותר להקטין בין עכברים פראי-סוג של eosinophil לקויה (איור 6A). עם זאת, בעכברים אינו מטופל, כימות גרמים בלבד גרמו ירידה משמעותית עכברים שחסרו אאוזינופילים (איור 6B). כאשר חושבו האזור רשע סעיפים שהוכתמו סקאוטרים שלם-לונג (4 X המטרה), ההבדלים היו דומה התוצאות המתקבלות עם 4 נציג 10 X שדות, אבל עם פחות מובהקות סטטיסטית (איור 6C). איור 7 מראה הישרדות, תמונות של נציג סקאוטרים מכתימים (4 10 X שדות), כימות של הנטל פטרייתי על ידי שתי השיטות γδ חשוכת-תא T (TCRδKO) עכברים שטופלו קספופונגין לעומת שליטה, לא מטופל עכברים. קספופונגין הטיפול חל שיפור הישרדות (איור 7 א), נטל פטרייתיים (איור 7 ב-D) בעכברים TCRδKO. בדומה לתוצאות של איור 6, התוצאות של נטל פטרייתי כפי שהיא נמדדת qPCR, (איור 7 ב) ונציג סקאוטרים כמת (איור 7C) היו דומות.

figure-results-2100
איור 4: גדל הישרדות בעכברים חשוכת-eosinophil (ΔdblGATA) עם. חקירות פנים לאחר הטיפול עם קספופונגין. 15-30 עכברים/קבוצה. סיכום של 3-6 ניסויים. p < 0.0001. איור זה שונה מן הפרסום הקודם8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2627
איור 5: להחליפן בתמונות סעיפים ריאות שהוכתמו סקאוטרים פראי-סוג, eosinophil לקוי, ו שטופלו קספופונגין או שליטה לא מטופל עכברים עם חקירות פנים נציג של 3-4 עכברים/קבוצה. סרגל קנה מידה שווה 100 מיקרומטר. איור זה שונה מן הפרסום הקודם8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3192
איור 6: נטל פטרייתי בפראי-סוג, עכברים eosinophil לקויה עם IA מטופלים או פקד שטופלו קספופונגין. QPCR (א) ה-DNA פטרייתי. 15-30 עכברים/קבוצה, סיכום של 3-6 ניסויים. (B) סקאוטרים כימות של מקטעים היסטולוגית, כלומר אחוז סקאוטרים מכתים משדות 4 (10 x המטרה). (ג) סקאוטרים כמת, % כלומר סעיף כל הריאה (4 X המטרה). B ו- C הם סיכום של עכברים 5/קבוצה. p < 0.05. p < 0.001. p < 0.0001. איור זה נוצר באמצעות נתונים דווחו על הפרסום הקודם8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4027
איור 7: ירידה בחומרת IA בעכברים לקויה תא T γδ לאחר הטיפול קספופונגין. (א) הישרדות. QPCR (B) של ה-DNA פטרייתי. (ג) סקאוטרים כימות של כימיקלים. (ד) להחליפן בתמונות סעיפים מוכתמים סקאוטרים מתאי γδ T עם. חקירות פנים, קספופונגין שטופלו או מטופל. A ו- B הם סיכום של שני ניסויים עם 7-10 עכברים/קבוצה. C ו- D הם סיכום של עכברים 4/קבוצה. p < 0.05. p < 0.01. p < 0.001. איור זה שונה מן הפרסום הקודם8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

מטרת מאמר זה היה להציג את שיטת קביעת נטל פטרייתי ריאות אצל עכברים עם. חקירות פנים על-ידי ניצול ריאות שהוכתמו סקאוטרים היסטולוגית מקטעים עבור ניתוח תמונות ו כמת. במחקר זה, הטיפול עם התרופה נגד פטריות β-גלוקן-סינתזה-מיקוד קספופונגין14 לא לשפר הישרדות או פטרייתי נטל בעכברים פראי-סוג neutropenic עם חקירות פנים8. עם זאת, בהיעדר אאוזינופילים או γδ T תאים, הישרדות, נטל פטרייתי משופרת. תוצאות המחקר שלנו הוכיח גם כי ניתן להשיג תוצאות דומות על ידי סקאוטרים נטל פטרייתי לעומת שימוש נרחב פטרייתי DNA qPCR בשיטה6.

ישנם מספר יתרונות ניצול סקאוטרים נטל פטרייתי כמת. ראשית, התהליך עלול לנצל דגימות היסטולוגית הקיימים, ולכן פוטנציאל להפחית את מספר ניסויים נדרש כדי לקבוע הבדלים משמעותיים. שנית, במחקר זה, פחות חיות נדרשו על כימות נטל פטרייתי סקאוטרים להשגת הבדלים משמעותיים בהשוואה qPCR של ה-DNA פטרייתיים (איור 6, איור 7). שלישית, השוואה של הנטל פטרייתי ב מבודד שונה על-ידי qPCR עשוי להיות מושפע הבדלים תלויי-בידוד ribosomal DNA עותק מספר15. לעומת זאת, כימות סקאוטרים אינו מושפע לפי העתק מספר, כפי נטל פטרייתי נקבעת לפי רמות היחסי של צמיחה פטרייתי ריאות. לפיכך, השימוש סקאוטרים כימות נטל פטרייתי מפחית את השימוש של בעלי חוליות, לא דורשת קביעה מראש של rDNA עותק מספר. בסופו של דבר, בנוסף לשינויו מורפולוגיה פטרייתי, טיפול קספופונגין מגבירה את הפיצול פטרייתי, ובכך עשוי באופן מלאכותי להגדיל פטרייתי נטל על בידוד של המושבה יחידות ויוצרים מן הריאות homogenates12,16 ,17. לפיכך, כימות סקאוטרים של הנטל פטרייתי מונע מספר מגבלות הטבועות עם שיטות נפוצות אחרות.

עם זאת, המגבלות של כימות גרמים ו/או מחקר זה הן חשוב לציין. קודם, המחברים הנחת התפלגות דומות של צמיחה hyphal לאורך כל הריאות של כל קבוצה ניסיונית, ובכך משמש כימות מנציג 4 10 x שדות אובייקטיבית כמידה נציג הנטל פטרייתי ב הריאה כולה (איור 6B). זה אפשרי כי בחלק מהמקרים התפוצה היחסית, על הגודל ועל צפיפות של מוקדים hyphal מספיק חלוקים כך הנטל פטרייתי נראה שונה עם שיטה זו, המקבילה בשיטת qPCR. עם זאת, שלנו תוצאות נוספות עם כל הריאה סעיף כימות להשתמש בשדות אובייקטיבית 4 X הראה דומה, אם כי פחות הבדלים משמעותיים סטטיסטית, בין קבוצות (איור 6C). השגיאה הסטנדרטית של כימות זה היה גדל עם אסטרטגיה זו, ככל הנראה עקב ירידה ברזולוציה hyphal עם 4 X אובייקטיבית, רקע מוגברת בתחומים שיוצרת. לכן כימות נציג של פחות שדות בהגדלה גבוהה יותר היא המועדפת. שנית, רק קטע אחד, מרכזי, שימש עבור כל דגימה. זה אפשרי, על סמך את מבודד פטרייתי או זני עכברים משומש, כי מחקרים עלול לגרום הפצה אחידה של צמיחה hyphal. במקרים אלה, סעיפים נוספים ברחבי כל בלוק פראפין צריך ניתן לכמת כדי לקבל עול יותר ייצוגית. שלישית, בניסויים זה זירוז ייצור משמעותי של mucins (כלומר, לכימות דרכי הנשימה צמיחה פטרייתי bronchopulmonary אלרגית aspergillosis (ABPA)18 או סיסטיק פיברוזיס (CF)18), תגובתיות סקאוטרים עם רב-סוכר-עשיר mucins19 יכול להניב פירות שאינם ספציפיים סקאוטרים +, ובכך להטות דגימות לטובת נטל פטרייתי גבוה יותר. מאז רק הדגם neutropenic של חקירות פנים נעשה שימוש במחקר זה, זה אפשרי כי השימוש של דגמים חיסוניים אחרים המוסמכים או מדכאים יכול תוצאות בתוצאות פחות דומות. למרות אזהרות אלו, כימות סקאוטרים מספק שיטה דומה כדי לקבוע נטל פטרייתי, את המשך השימוש במחקרים נוספים עשויים עוד יותר לאמת את התועלת של שיטה זו כמו עקבי, אמינה וחסכונית.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך בחלקה על ידי של אינדיאנה אוניברסיטת בית הספר של רפואה מחקר שיפור גרנט, מאת 1R03AI122127-01-NIH-NIAID. נ. א נתמכה חלקית בתקופה זו על ידי קריירות ב מלגת אימונולוגיה של האגודה האמריקאית של Immunologists.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Aspergillus fumigatus 293 Stock SolutionFungal Genetics Stock CenterFGSC #A1100
HyPure Cell Culture Grade WaterThermo Fisher ScientificSH30529.03
Malt ExtractMP Biomedicals2155315White Powder
BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: PeptoneFisher ScientificL11843
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)Fisher ScientificD16-3
Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1423-500
Auto Dry CabinetShanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTDHSFC160FD
1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety CabinetThermo Fisher Scientific1375
0.5 mm Glass BeadsBioSpec Products11079105
15 ml Conical TubesThermo Fisher Scientific339650
HemacytometerFisher Scientific# 0267110
Leica Model DME MicroscopeLeica13595XXX
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD8662-500 ml
1.5 ml tubesFisher Scientific# 05-408-129
BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in.Sigma-AldrichZ192384
Anti-mouse-Ly-6G antibodyBioXCellBP0075-1Clone 1A8
Caspofungin diacetateSigma-AldrichSML0425
IsofluraneHenry Schein Animal Health1169567762
Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia MachineSupera Anesthesia InnovationsM3000
Pureline Oxygen ConcentratorSupera Anesthesia InnovationsOC8000
Slant Board RestraintIndiana State University Facilities ManagementCustom made
Gilson PIPETMAN Classic 200 ml PipetsFisher ScientificF123601G
Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus)Vortech Pharmaceuticals0298-9373-68
General-Purpose Broad-Tipped ForcepsFisher Scientific10-300
Fisherbrand Standard Dissecting ScissorsFisher Scientific08-951-20
Fisherbrand General-Purpose Curved ForcepsFisher Scientific10-275
Ethyl Alcohol-200 ProofPHARMCO-AAPER111000200
Fisherbrand Absorbent UnderpadsFisher Scientific14-206-63
BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in.Fisher ScientificZ192406
All-Plastic Norm-Ject SyringesFisher Scientific14-817-30
IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50BFisher ScientificNC9742754
Formalin Solution, neutral buffered, 10%Sigma-AldrichHT501128-4L
50 ml Conical TubesThermo Fisher Scientific339652
Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube PacksFisher ScientificB1000729
Fisherfinest Histoplast Paraffin WaxFisher Scientific22-900-700
Disposable Base MoldsFisher Scientific22-363-554
Reichert Jung Histocut 820 MicrotomeLabequip.com31930
Water BathPrecision Scientific66630-23
CO2 IncubatorFisher Scientific116875H
Silver Stain (Modified GMS) KitSigma-AldrichHT100A-1KT
Fast Green FCFFisher ScientificAC410530250
Frosted Microscope SlidesFisher Scientific12-550-343
Fisherfinest Superslip Cover GlassFisher Scientific12-545-89
Cytoseal XYLFisher Scientific22-050-262
Olympus Provis AX70 MicroscopeOlympusOLYMPUS-AX70
U-PHOTO Universal Photo SystemOlympusOLYMPUS-U-PHOTO
U-MCB-2 MULTI CONTROL BOXOlympusOLYMPUS-U-MCB-2
U-PS POWER SUPPLY UNITOlympusOLYMPUS-U-PS
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry SystemLABCONCO7740020
Maxima C Plus Vacuum PumpFisher Scientific01-257-80Displacement- 6.1 cfm
1-ButanolFisher ScientificA383-4
AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFSFisher ScientificNC9573988
Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw CapsFisher Scientific# 02-682-557
Mini-Beadbeater-24BioSpec Products112011
BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADSFisher ScientificNC0451999
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)Fisher ScientificBP152-1
Hydrochloric Acid, Certified ACS PlusFisher ScientificA144S
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt DihydrateFisher ScientificS311
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, ElectrophoresisFisher ScientificBP166
Chloroform/isoamyl alcohol 24:1Fisher ScientificAC327155000
Biotek Epoch Microplate SpectrophotometerFisher Scientific11-120-570
Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR MixesFisher ScientificAB4137A
Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′Integrated DNA TechnologiesN/A
Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′Integrated DNA TechnologiesN/A
Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′Integrated DNA TechnologiesN/A
Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mLFisher Scientific43-165-67
Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap StripsFisher ScientificAB-0386
Mx3005P QPCR System, 110 VoltAgilent401443Stratagene is now owned by Agilent
BALB/c miceThe Jackson Laboratory000651
C57BL/6 (B6) miceThe Jackson Laboratory000664
Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) miceThe Jackson Laboratory005653
γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) miceThe Jackson Laboratory002120
ImageJ SoftwareNational Institutes of HealthN/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/
Spot Advanced SoftwareSpot ImagingSPOT53Ahttp://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/
GraphPad Prism 6GraphPad SoftwareN/Ahttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Fisherbrand Absorbent UnderpadsFisher Scientific14-206-62
Step 4.5http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf

References

  1. Hohl, T. M., Feldmesser, M. Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense. Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).
  2. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus--what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen?. PLoS Pathog. 9 (12), e1003743 (2013).
  3. Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond. Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).
  4. Desoubeaux, G., Cray, C. Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization. Front Microbiol. 8, 841 (2017).
  5. Hohl, T. M. Overview of vertebrate animal models of fungal infection. J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).
  6. Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
  7. Patterson, T. F. The future of animal models of invasive aspergillosis. Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).
  8. Amarsaikhan, N., et al. Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis. J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).
  9. Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia. PLoS One. 6 (4), e18777 (2011).
  10. Brunel, S. F., et al. Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus. J Vis Exp. (122), (2017).
  11. Rao, G. V., et al. Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx. J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).
  12. Bowman, J. C., et al. Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate. Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).
  13. Li, H., et al. The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).
  14. Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. Echinocandins: the newest class of antifungals. Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).
  15. Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).
  16. Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).
  17. Petraitiene, R., et al. Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia. Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).
  18. Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).
  19. Taylor, M. J., et al. Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein. Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133fumigatusPCRaspergillosis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved