조직학 정량화 폐 실험 Aspergillosis에 곰 팡이 부담을 결정 하

요약

여기는 Gomori의 수정된 methanamine 실버 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화 하 여 침략 aspergillosis와 쥐에 폐 선 부담을 결정 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 방법의 사용 결과 폐 균 DNA의 양이 많은 PCR에 의해 곰 팡이 부담에 대 한 평가에 비해 적은 동물과 비교 결과.

초록

폐 균 부담의 정량화는 면역 보호 및 폐 곰 팡이 감염의 마우스 모델에서 곰 팡이 독성의 상대적 수준의 결정에 대 한 중요 합니다. 여러 메서드는 곰 팡이 부담을 평가 하는 데 사용 됩니다, 하지만 곰 팡이 DNA의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 이전 문화 기반 방법에 비해 여러 가지 장점 가진 기술로 떠오르고 있다. 현재, 폐 병 리, 백혈구 신규 모집, 곰 팡이 부담, 및 침략 aspergillosis (IA)와 쥐에 유전자 발현의 포괄적인 평가 실험의 뜻깊은 수 및 제어 동물의 사용을 필요로합니다. 여기 폐 조직학 동물의 감소 된 수를 사용 하 여 곰 팡이 부담을 결정 하기 위해 얼룩의 정량화는 자세히 시험 되었다. 폐 섹션 Gomori의 수정된 methanamine 실버 (GMS) 얼룩 곰 팡이 구조를 규명 얼룩이 있었다. 이미지는 포 르 말린 고정 파라핀 포함 폐 각의 4 개의 개별 분야에서 GMS 스테인드 섹션에서 촬영 됐다. 각 이미지 내의 영역을 스테인드 GMS는 이미지 분석 프로그램을 사용 하 여 계량 했다 그리고이 정량화에서 스테인드 영역의 평균 백분율은 각 샘플에 대 한 결정 했다. 이 전략을 사용 하 여, 전시 eosinophil 불충분 한 쥐 감소 곰 팡이 부담 및 caspofungin 치료, 질병 동안 아이오와 야생-타입 마우스 caspofungin와 함께 개선 되지 않았다. 마찬가지로, 마우스 γ T 세포 부족에 곰 팡이 부담 했다 또한 향상 caspofungin, 정량 및 GMS 정량화로 측정 된. 따라서 GMS 정량화 상대 폐 균 부담 궁극적으로 침략 aspergillosis의 포괄적인 연구에 필요한 실험 동물의 수량을 줄일 수 있는 결정을 위한 방법으로 도입 되었습니다.

서문

IA 면역 진압 치료 또는 만성 감염^1,2선 천 적 또는 후 천 적인 면역 결핍과 취약 개인에 개발할 수 있는 기회 감염 이다. 1 차 감염 자주 폐, 간, 신장, 심장, Aspergillus fumigatus 의 일부 인스턴스 배포에서 발생 하 고 뇌를 심각한 질병 그리고 높은 함께 균의 광범위 한 조직 내 습의 결과로 발생할 수 있습니다. 사망률^1,2의 속도. 또한, 기존 pharmacotherapies의 효능 제한, 그리고 환경³항진균-저항 하는 긴장의 출현에 의해 더 약화 될 수 있습니다. 그것은 그러므로 침략 버섯 모양 질병의 악화 또는 개발을 촉진 하는 곰 팡이 독성 및 병 리의 메커니즘을 이해 하는 것이 중요입니다.

그들은 곰 팡이 독성 유전자의 역할을 평가 하 고 설립과 A. fumigatus vivo에서^4,5의 성장에 대 한 면역 이펙터를 호스트 하는 연구자 수 murine 모델 기계적 아이오와 연구에 대 한 중요 한 유지. 따라서, 여러 전략 효과적으로 계량 하거나 비교 실험 동물^6,7의 그룹에 게 선 부담 고안 되었습니다. 이러한 전략 문화 기반, 생화학, immunoassay, 또는 정량 방법, 각각 고유한 장점과 단점을 포함 한다. 또한, 이러한 메서드의 각 면역 effector 기능, 유전자 표정 분석 및 비교 histopathology⁷의 평가 대 한 희생 뿐 아니라 동물의 부분 집합의 헌신을 포함. 따라서, 포괄적인 IA 연구는 종종 상당한 비용 연구 동물의 많은 수를 필요로합니다. 동물의 조직 여러 분석을 이용 하 여 실험 시간, 동물 비용, 및 윤리적인 고려 사항 감소 효과적인 전략은 따라서 매우 귀중 한⁷.

이 보고서에서 GMS IA와 쥐의 실험적인 그룹 간의 상대 곰 팡이의 비교를 위해 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화를 설명 하는 방법 소개. 곰 팡이 문화에서 감염, 조직 수확 및 처리, 이미지 수집 및 데이터 분석, 각 단계는 자세히 설명 되어 있습니다. 곰 팡이 부담 GMS 정량화 하 여 얻은 정량 IA의 neutropenic 모델에서 그리고 IA⁸caspofungin 처리 야생-타입 또는 eosinophil 불충분 한 쥐에 비교 되었다. 결과 GMS 정량화와 곰 팡이 DNA의 정량 유사성을 보여. 이것은 GMS 정량화 상대 균 부담 IA와 쥐의 비교의 보조 또는 대체 방법으로 조직학 분석에 종사 하는 연구원에 게 유용 하 고 궁극적으로 비용 및 연구에 있는 동물의 사용을 줄일 수 있습니다. 복잡 한, 기계 연구입니다.

프로토콜

모든 동물 절차 동물 관리 및 사용 위원회의 인디애나 주립 대학, 인디애나 대학의과 대학의 호스트 캠퍼스 승인 했다-테 르 오 트.

1. A. fumigatus Conidia 감염에 대 한 준비

1. 환기가 증기 두건에서 작업 하는 동안 900 µ L 셀 문화 학년 물 (CCGW) A. fumigatus 293 재고 솔루션의 125 µ L를 추가 합니다. 다음에 맥 아 피 펫을 통해 추출 천 (MEA) 배지 inoculating 루프와 균등 하 게 확산을 솔루션 전송.
2. 적어도 14 일 동안과 더 이상 28 일 24 ° C에서 어둠 속에서 곰 팡이 접시를 저장.
3. 유리 비즈를 사용 하 여 앞에서 설명한⁹conidia 수확.
4. 접시에 유리 구슬 0.5 m m의 1.5 g를 부 어 부드럽게 그것을 기울이기 앞뒤로 구슬 conidia를 추출 하기 위해 코팅은. 15 mL 원뿔 튜브에 구슬/conidia 혼합물을 수집 합니다. Dulbecco 5 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)와 소용돌이에 일시 중단 합니다.
5. Conidia는 hemocytometer를 사용 하 여 하는 DPBS에 상쾌한의 50 배 희석에서을 계산 합니다. 그림 1 에 표시 된 지역에서 conidia의 수를 계산 하 고 방정식 1 를 사용 하 여 농도 계산 하.
   #Conidia × 희석 요인 10 ×⁴= Conidia/mL (식 1)
   참고: 추가 4 x 4 사각형 모서리가 영역 수 계산, 방정식 1에 #Conidia로 사용 하는이 분야의 의미와.

그림 1: Hemocytometer 대표 지역 conidia 계산에 사용 (상자, 화살표).

6. 당 무 균 식 염 수 (DPBS) 원하는 농도, 5 x 10⁶ conidia/50 µ L. 준비 50 µ L conidia 솔루션의 감염에 대 한 10⁸ conidia/mL x 1.0를 가진 conidia 현 탁 액을 희석 ' n + 2' 계정 pipetting에 감염 되는 쥐 오류가 발생 했습니다.
   참고: 표준 균 수확 및 준비/여과 또는 사용된¹⁰수 있습니다. 유리 구슬 메서드는 가장 사용 conidia 샘플 최소한의 작은/녹는 hyphal 항을 열망에 대 한 가져온.

2. 면역 억제 및 감염 Murine 모델의

1. 7-10-주-오래 된 마우스를 사용 합니다.
   참고: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinophil 불충분 한 (ΔdblGATA, BALB/c 배경), 그리고 γ T 세포 결핍 (TCRδ-/-, B6 배경) 쥐가이 연구를 위해 사용 되었다. 각 실험, 나이 및 성별 일치 (남성과 여성 모두) 마우스 각 그룹에 대해 사용 되었다.
2. 호 중구 통해 복 (IP) 주입 측면 하단 오른쪽 사분면에 45 °에 메 마른 염 분에 0.1 mL (0.5 mg) 안티-mouse-Ly-6 G 항 체의 고갈 (실험 일정 그림 2참조).
3. 24 시간 후, 10⁶A. fumigatus conidia 50에 x 5.0 포부 쥐 감염 µ L 살 균 염 분 앞¹¹에서 설명한 (단계 2.4-2.10 참조). 동물의 하위 집합 등이 연구에 사용 하는 DPBS에 5 mg/kg caspofungin diacetate antifungal 에이전트와 함께 주사 감염, 다음 (매일, 그림 2참조).
4. 99.9 %isoflurane 수의학 마 취 기계를 사용 하 여 함께 마우스를 anesthetize.
   1. 대변과 소변을 잡으려고 유도 챔버의 바닥에 종이 타월을 놓습니다.
   2. 마우스에 유도 챔버, 뚜껑, 보안 고 2 분 및 30에 대 한 5 %isoflurane는 기화 기를 설정 s.
      참고: 수 의사 연 고 마 취 총 시간은 5 분 미만 이기 때문에 사용 되지 않습니다.
   3. 30에 대 한 최대 설정의 절반은 기화를 줄일 s.
5. 확인 호흡, 운동의 부족 및 발가락 꼬집어 자극에 응답의 부족 둔화 마우스 제대로 관찰 하 여 마 취.
6. 유도 약 실 및 경사 보드에 장소에서 마우스를 제거 합니다. 보드에 대 한 그것의 뒤를 가진 마우스를 놓습니다. 그것의 위 앞 니는 고무 밴드와 부드럽게 절제 된 더 낮은 앞 니 부드럽게 금속 와이어와 절제 된 확인 합니다.
7. 조심 스럽게 작은 집게와 혀의 기지에서 conidia/PBS 서 스 펜 션의 피 펫 50 µ L 전체 확장에서 혀를 개최.
8. 전체 확장; 혀를 잡으십시오 빠른 호흡과 열망의 독특한 클릭 소음을 들어봅니다. 20 동안 s 또는 서 스 펜 션은 완벽 하 게 발음 하는 때까지.
9. 경사 보드에서 마우스를 제거 하 고 부드럽게 관찰에 대 한 감 금 소에 배치.
10. 포부, 다음 마우스 야 회복 1 분 모니터 내 의식 마우스까지 완벽 하 게 의식 하 고 감 금 소의 주위에 걸을 수 있습니다. 동물 21 ° C에서 지 내게 하 고 폐는가 걷이 될 때까지 두 번 매일 모니터링 해야 합니다.
11. 호 중구 (단계 2.2) 24 h 후 감염 (그림 2)의 소모를 반복 합니다.

그림 2: 실험 일정. 이 그림은 이전 게시⁸에서 수정 되었습니다.

3. 수확 및 조직학 분석을 위한 마우스 폐의 보존

1. 깊이 anesthetize 390 mg/ml pentobarbital 나트륨 솔루션 IP의 0.1 ml의 치명적인 복용량을 가진 동물.
2. 핀셋으로 자발적인 호흡의 부족 및 사지 자극 반응의 부재를 관찰 하 여 안락사를 확인 합니다. 안락사, 일단 70% 에탄올 소독과 시체를 스프레이.
3. 흡수 성 패드로 덮여 폼 보드에 시체를 놓습니다.
   참고: 시체 두어야 한다 그것의 뒤에 폼 보드에 모든 4 개의 사지를 고정 하는 핀.
4. 주의와 위를 사용 하 여 상단의 가슴 구멍을 엽니다. 폐 및 심 혼을 노출 하려면 흉 곽을 떨어져 잘라. 관류 수 있도록 열 등 한 베 나 정 맥을 잘라. 혈관을 절단 하 고 장기를 puncturing 하지 마십시오.
5. 천천히 25 G 바늘으로 45 ° 각도에서 심장의 우 심 실에서 차가운 DPBS의 5 mL와 함께 perfuse. 10% 포 르 말린의 5 mL와 관류를 반복 합니다.
6. 조심 스럽게 기도 하 고 주변 지방 패드를 분리. 주의 사용 하 고 기도 puncturing 피하십시오. 초과 결합 조직 완전히 진행 하기 전에 기도 시각화 하기 위해 제거를 확인 합니다. 일단 기도 노출 장소 그것을 상승 기도 아래 집게.
7. 25 G 바늘을 사용 하 여 위쪽 기도에 작은 구멍 고추.
   참고: 구멍 해야 될 배치 전체 정 기도에 맞는. 주의 사용 하 여 기관지 파열 방지.
8. 정 및 폐 쪽으로 구멍을 통해 삽입 합니다. 기관지 주위에 느슨하게 묶인 수술 실로 정을 보안 합니다.
   참고: 기관지 파열 하는 경우는 정 가능한 기도에서 기도 과거 삽입할 수 있습니다.
9. 주사기를 사용 하는 정 맥을 통해 10% 포 르 말린 버퍼의 1 mL와 함께 폐 부 풀 려. 폐의 인플레이션 볼 수 있는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 카 테 터를 조정 하 고 반복. 폐가 팽창 되 면 신속 하 게 주의 정 맥을 제거 하 고 안전 하 게 봉쇄 기도 스레드 조입니다.
   참고: 기관지 파열 폐 팽창 될 수 없는 경우에, 폐 수확 여전히 수 있습니다 하지만이 적절 한 고정 되지 않을 수 있습니다.
10. 부드럽게 기관지 및 폐에서에서 제거 가슴 신중 하 게 스레드를 잡아 당겨 부드럽게 하는 동안 집게와 기도의 결합 조직을 뽑아야 합니다. 10% 포 르 말린 버퍼의 15 mL 50 mL 원뿔 튜브에 폐와 기관지를 놓습니다. 스레드 튜브 외부의 한쪽 끝을 배치 하 고 뚜껑을 봉인. 완전히 정착 액에 샘플 잠수함 튜브 반전.
11. 적어도 24 시간 또는 추가 처리 때까지 실 온에서 샘플을 저장 합니다.
    주의: 포 르 말린은 유해. 고글, 얼굴 마스크 등 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오. 샘플을 처리할 때 화학 후드 작동 합니다.

4. 수확 및 DNA 곰 팡이 부담에 대 한 마우스의 폐의 보존

1. 별도 마우스에 위에서 설명한 단계 3.1-3.5를 수행 합니다.
2. 천천히 25 G 바늘으로 45 ° 각도에서 심장의 우 심 실에서 차가운 DPBS의 10 mL와 함께 perfuse.
3. 가 위 폐를 소비 세와 레이블이 1.5 mL 튜브에.
4. 추가 처리까지-80 ° C에서 폐를 저장 합니다.
5. (포함 및 단면)에 설명 된 대로, 제조업체의 프로토콜 ( 재료의 표참조)에 따라 표준 기법을 사용 합니다.

5. 현미경 및 이미징

1. 이미징 정량화 프로그램 ( 재료의 표참조).
2. 가벼운 현미경을 사용 하 여, 슬라이드 (10 X 목표) 스테인드 GMS의 4 가지 분야를 얻을. 이미지 비슷한 조직 밀도와 폐 내의 감염 된 항공의 대표 인지 확인 합니다.
   참고: 밀도 및 hyphal foci의 유통 제어 및 실험 그룹 사이 현저 하 게 다른 경우, 추가 필드 촬영 될 수 있습니다, 또는 전체 폐 섹션의 GMS 지역 몇 군데 있습니다 (4 X 목표). 원하는 경우 hematoxylin와 오신, 스테인드 직렬 폐 섹션에 (동등한 조직 형태 식별) 폐의 같은 영역에의 이미지를 얻을.
3. 필요한 경우 이미지에 눈금 막대를 추가 하 고 측정할 수에 이미지를 저장. 선택, 편집 > 추가/편집 교정 표시 > 메뉴: 선 두께, 색상 및 스케일 바 크기 선택 > 눈금 막대 배치 하는 대 한 이미지를 클릭 하십시오. 메뉴를 닫고 선택, 편집 > 병합 > 교정 표시 병합 > 파일 이름으로 저장 선택 > 파일의 이름을 지정 하 고 클릭 저장.

6. 곰 팡이 부담 (그림 3)를 계산 하는 이미지 처리 프로그램을 사용 하

1. 이미지 처리 프로그램을 엽니다. 파일을 선택 > 계량 샘플 폴더 > 이미지 (그림 3A). 이미지 선택 > 형식 > 변환 "RGB 스택" (그림 3B).
2. 3 주어진된 이미지 (그림 3B)의 두 번째를 선택 하려면 오른쪽 화살표 키를 사용 합니다. "컨트롤 + 교체 + T"를 명 중을 "임계값" 메뉴 설정 조절기 (그림 3C). 참고로 원래.tiff 또는.jpg 이미지를 찾아서 이미지 보기 프로그램 (그림 3C)와 열.
3. 왼쪽에 있는 모든 방법을 위쪽 슬라이더를 당겨와 (red)에 선택 영역 (일반적으로 이르기까지 130-160에서 슬라이더 (그림 3C)의 오른쪽에 표시 현미경 이미지의 대표 될 때까지 아래쪽 슬라이더를 조정.
4. 일단 선택, 눌러 "설정" > "확인" (그림 3D). "분석"을 선택 > "측정 설정" > "지역, 지역 분수, 제한 임계값, 표시 라벨"을 확인 하 고 기본으로 하단 설정 (메뉴 및 소수 자릿수)을 두고 > "확인" (그림 3D).
5. 공백 또는 배경 얼룩의 중요 한 영역 선택 영역이 나 다각형 도구로 적절 한 조직에 의해 제외 될 수 있습니다.
6. 마지막으로, "분석"을 선택 > "측정" (데이터 창이 나타납니다, 또는 windows 작업 표시줄에 탭 표시, "결과" 표시 됩니다) (그림 3E). 그래프를 위한 데이터 분석 프로그램을 데이터를 전송 및 통계 분석.
7. 각 폐 샘플에 대 한 4 개의 영역 비율의 평균을 입력 합니다. 5-8 샘플 그룹 간의 중요 한 차이 검출 하기 위하여 일반적으로 충분 하다. 두 실험 그룹을 비교 하는 경우 수행 하는 짝이 없는 학생의 t-의미를 확인 하려면 테스트.

그림 3: GMS 조직학의 각 단계에 대 한 대표 스크린샷 필드 정량화. (A) 파일 선택 > 계량 샘플 폴더 > 선택 이미지. (B)을 선택 이미지 > 형식 > "RGB 스택" 변환. 3 주어진된 이미지의 두 번째를 선택 하려면 오른쪽 화살표 키를 사용 합니다. (C) 히트 "컨트롤 + 교체 + T" "임계값" 메뉴 설정 조절기를가지고. 참고로 원래.tiff 또는.jpg 이미지를 찾아서 사진 뷰어 프로그램으로 열기. 모든 방법은 왼쪽과 (red)에 선택 영역 (일반적으로에서 이르기까지 130-160으로 슬라이더의 오른쪽에 현미경 이미지의 대표 될 때까지 아래쪽 슬라이더를 조정 가기 슬라이더를 당겨. (D) 선택 된 언론 "설정" > "확인". "분석"을 선택 > "측정 설정" > "지역, 지역 분수, 제한 임계값, 표시 라벨"을 확인 하 고 기본으로 하단 설정 (메뉴 및 소수 자릿수)을 두고 > "확인". (E) "마지막으로 선택 분석" > "측정" (데이터 창이 나타납니다, 또는 windows 작업 표시줄에 있는 탭 "결과" 레이블이 표시 됩니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

7. DNA 곰 팡이 부담

1. -80 ° C에서 폐를 제거 하 고 적어도 4 h lyophilize (하룻밤 최적입니다) 또는 동결 건조 시스템에 의해 완전히 건조 될 때까지.
2. 폐를 건조 하는 동안 DNA 추출 버퍼 (0.1 m M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris HCl pH 8.0 및 0.5 %SDS)를 준비.
3. 미리 따뜻하게 60 ° C 물 욕조에 준비 된 DNA 추출 버퍼를 놓습니다. 또한, 페 놀 장소: 클로 프롬: isoamyl 알콜 50 mL 원뿔 튜브에서 (25:24:1) 분리에 대 한 허용.
4. 유리 구슬의 0.2 mL 2 mL 스크류 캡 튜브에 동결 건조 된 폐를 놓습니다. 그것은 정밀한 분말을 형성 될 때까지 15-30에 대 한 건조 폐 조직 갈기 구슬 때리는 사용 하 여.
5. 각 튜브와 소용돌이를 0.8 mL 따뜻한 DNA 추출 버퍼를 잘 추가 합니다. 추가 15 분 동안 잠복기 전에 각 튜브 65 ° C 비드 목욕 그리고 소용돌이에서 15 분을 품 어. 잠복기, 후 소용돌이 그리고 원심 분리기 튜브 25000 x g 10 분에 합니다.
6. 각 샘플에 대 한 1.5 mL 튜브의 3 세트를 분류 하 고 튜브의 1 세트에는 상쾌한의 상위 계층을 전송. 수성 상위 레이어 밖으로 pipetting 동안 주의 사용 하 여 중간 계층을 방해 하지 않도록.
7. 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜의 동일한 볼륨을 추가 하 고 잘 혼합. 다음 상위 레이어 밖으로 튜브의 두 번째 세트에 pipetting 전에 15 분에 대 한 25000 x g에서 원심.
8. 클로 프롬: isoamyl 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가 하 고 잘, 튜브의 3 세트에 10 분 신중 하 게 상위 레이어 밖으로 피 펫에 대 한 25000 x g에서 원심.
9. 추가 500 µ L 소 프로 파 놀의 50 µ L NaoAc (pH 5.2), 잘, 그리고 샘플 10 분 동안 실내 온도에 알을 품을 수 있도록. 다음 30 분 동안 25000 x g에서 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다.
10. 25000 x g. Decant 에탄올에서 얼음 찬 70% 에탄올과 5 분 원심 분리기의 750 µ L로 DNA 펠 릿을 세척 하 고 40 분 동안 증기 두건에 튜브에 공기를 펠 릿 건조 허용.
11. 건조 알 약 테 버퍼의 300 µ L에서 resuspend.
    참고: DNA 정량까지-20 ° C에서 저장 수 있습니다.
12. DNA는 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량 및 정량 분석에 대 한 각 DNA 샘플의 µ 0.2 µ g/L의 100 µ L를 준비.
13. 3 중 1 µ g의 DNA 샘플, 곰 팡이 18S rDNA 입문서와 함께 앞에서 설명한 표준 정량 수행 하 고 수정 된 프로브 끄는 프로브 세트 (5'-/ 56-팸/AGC CAG CGG/선/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/3 ')^12,13.
14. A. fumigatus genomic DNA에서 표준 곡선을 준비 하 고 각 페이지에 곰 팡이 DNA의 농도 계산 평균 기자를 사용 하 여 샘플 염색 Ct 값.
15. 플롯은 pg / µ g 균 DNA의 뜻의 표준 오류와 함께. 수행 하는 학생의 t-테스트 의미를 결정 하는 분석.
    참고:으로 덜 독성 대안을 여기서 페 놀-클로 프롬 DNA 추출, 열 기반 DNA 추출 키트를 사용할 수 있습니다.

결과

그림 4 는 야생 타입의 생존의 그래프를 포함 또는 IA와 eosinophil 불충분 한 쥐 caspofungin 치료. 결과 표시 eosinophil 불충분 한 쥐는 증가 생존 야생-타입 마우스에 비해 전시 (50% 사망률 100% 사망, 대 각각). 그림 5 는 neutropenic에서 얼룩이 지기 대표 GMS 야생-타입 및 IA와 eosinophil 불충분 한 쥐 취급 또는 caspofungin와 치료. Caspofungin 치료 결과 eosinophil 불충분 한, 하지만 아니 야생-타입 마우스 (오른쪽 패널)에 상대 균 클리어런스, 받지 못한 두 그룹이 caspofungin 비슷한 (왼쪽된 패널). 그림 6 caspofungin 치료에 곰 팡이 부담 비교를 보여줍니다 치료 야생-타입 또는 eosinophil 결핍 마우스를 제어, 균 DNA (그림 6A) 및 대표 GMS의 두 정량 Pcr를 사용 하 여 4 (10 X 목표)의 정량화 (필드 그림 6B)입니다. 두 기술에서 생성 된 결과 caspofungin 치료 결과에 가장 중요 한 곰 팡이 부담 야생-타입 및 eosinophil 불충분 한 쥐 (그림 6A) 사이 감소 보여. 그러나, 치료 쥐만 GMS 정량화 호 산 구는 (그림 6B) 부족 한 쥐에 있는 상당한 감소 결과. 전체 폐 GMS 스테인드 섹션의 의미 영역 계산 때 (4 X 목표), 차이 했다 4 대표 10 필드가, 얻은 결과 유사 하지만 덜 통계적 의미 (그림 6 c). 그림 7 보여줍니다 생존, 대표 GMS 얼룩 (4 10 X 필드)의 이미지와 곰 팡이 부담 정량화 두 방법으로 γ T 세포 결핍 (TCRδKO) 마우스를 제어에 비해 caspofungin로 치료 했다, 쥐를 치료. Caspofungin 치료 향상 된 생존 (그림 7A) 및 TCRδKO 마우스에 곰 팡이 부담 (그림 7B-D). 그림 6의 결과 마찬가지로, 버섯 모양 부담의 결과 GMS 정량화 (그림 ℃) 정량 (그림 7B) 및 대표에 의해 측정 했다 비교.

그림 4: caspofungin와 치료 후 아이오와 eosinophil 불충분 한 (ΔdblGATA) 쥐에 있는 생존을 증가 했다. 15-30 쥐/그룹입니다. 3-6 실험의 요약입니다. p < 0.0001입니다. 이 그림은 이전 게시⁸에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: 야생-타입, eosinophil 결핍, 및 caspofungin 처리 또는 컨트롤에서 GMS 스테인드 폐 섹션의 대표 이미지 치료 아이오와에 있는 쥐 3-4 쥐/그룹의 대표적인입니다. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림은 이전 게시⁸에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6: 야생-타입에 곰 팡이 부담, eosinophil 불충분 한 쥐 취급 하는 IA 또는 제어 치료 caspofungin. (A) 곰 팡이 DNA의 정량. 15-30 쥐/그룹, 3-6 실험의 요약. (B) GMS의 정량화 조직학 단면도, GMS 4 필드 (10 x 목표)에서 얼룩의 평균 %. (C) GMS 정량화, 전체 폐 섹션 (4 X 목표)의 평균 % B와 C 5 쥐/그룹의 요약입니다. p < 0.05입니다. p < 0.001입니다. p < 0.0001입니다. 이 그림은 이전 게시⁸에서 보고 된 데이터를 사용 하 여 생성 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 7: caspofungin 치료 후 γ T 세포 불충분 한 쥐에 있는 IA의 심각도 감소. (A)의 생존 (B) 곰 팡이 DNA의 정량. (C) GMS 조직학의 정량화. (D) IA, 치료 또는 치료와 함께 caspofungin와 γ T 세포에서 GMS 스테인드 섹션의 대표 이미지. A와 B는 7-10 쥐/그룹 두 실험의 요약. C와 D 4 쥐/그룹의 요약입니다. p < 0.05입니다. p < 0.01입니다. p < 0.001입니다. 이 그림은 이전 게시⁸에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 문서의 목적은 이미지 분석 및 정량화에 대 한 GMS 스테인드 폐 조직학 단면도 이용 하 여 IA와 쥐에 폐 버섯 모양 부담의 결심을 위한 방법을 소개 했다. 이 연구, 치료에에서 β-글 루 칸-합성-대상으로 항진균 약물 caspofungin¹⁴ 개선 하지 않은 생존 또는 IA⁸neutropenic 야생-타입 마우스에 곰 팡이 부담. 그러나, 호 산 구는 γ T 세포의 부재, 생존 및 곰 팡이 부담 개선. 우리의 연구 결과 또한 널리 이용 균 DNA 정량 방법⁶에 비해 GMS 곰 팡이 부담 하 여 비교 결과 얻을 수 있습니다 설명 했다.

GMS 곰 팡이 부담 정량화를 활용 하 여 여러 가지 혜택을 확인 하 고 있습니다. 첫째, 프로세스 따라서 잠재적으로 상당한 차이 확인 하는 데 필요한 실험의 수를 줄이고 기존 조직학 샘플 활용 수 있습니다. 둘째, 본이 연구에서는 적은 동물 GMS 곰 팡이 부담 정량화 (그림 6, 그림 7) 곰 팡이 DNA의 정량에 비해 상당한 차이 달성 하기 위해 필요 했다. 셋째, 정량 하 여 다른 격리에 곰 팡이 부담 비교 ribosomal DNA 복사 번호¹⁵에 격리 종속 차이 의해 영향을 받을 수 있습니다. 반면, GMS 정량화는 영향을 받지 복사본 수로 곰 팡이 부담 폐 곰 팡이 성장의 상대적 수준에 의해 결정 됩니다. 따라서, 곰 팡이 부담에 대 한 GMS 정량화를 사용 하 여 척 추가 있는 동물의 사용 줄이고 rDNA 복사 번호의 사전 결정을 필요 하지 않습니다. 마지막으로, 곰 팡이 형태를 수정 하는 것 외에도 caspofungin 치료 곰 팡이 조각화, 증가 하 고 따라서 인위적으로 증가 시킬 수 있습니다 폐 homogenates^{12,16에서에서 콜로 니 형성 단위의 절연 측정 때 곰 팡이 부담 ,17}. 따라서, 곰 팡이 부담 GMS 정량화 다른 일반적으로 사용 되는 방법으로 몇 가지 제한 내재를 방지합니다.

그러나, GMS 정량화 그리고/또한이 연구의 한계는 중요 한 것. 첫째, 저자 각 실험 그룹의 폐에 걸쳐 hyphal 성장의 유사한 분포를 가정 하 고 따라서 4 대표 10에서에서 정량화 객관적인 필드 x으로 사용 대표적인 측정 전체 폐에 곰 팡이 부담에 대 한 (그림 6B)입니다. 그 어떤 경우에 상대 분포, 크기 및 밀도 hyphal foci의 충분히 다 곰 팡이 부담 정량 메서드에서이 메서드 및 해당 다른 표시는 가능 하다. 그러나, 우리의 추가 결과 4 X 객관적인 필드를 사용 하 여 전체 폐 섹션 정량화를 비슷한, 그룹 (그림 6 c) 간의 통계적으로 유의 한 차이 이기는 하지만 덜 보였다. 이 부 량의 표준 오차는이 전략, 목표 및 차선 분야에서 증가 배경 4 감소 hyphal 해상도 때문에 가능성이 증가 되었다. 따라서, 더 높은 확대에 적은 분야의 대표적인 부 량이 좋습니다. 둘째, 단일, 중앙 섹션은 각 샘플에 사용 됩니다. 그것은 가능한, 곰 팡이 분리에 따라 또는 쥐 종자 사용, 일부 연구 hyphal 성장의 고르지 못한 배급에 발생할 수 있습니다. 그 경우에 각 파라핀 블록에 걸쳐 추가 섹션 더 대표 부담을 정량 한다. 셋째, 실험에는 상당한 생산 (즉, 측정 알레르기 bronchopulmonary aspergillosis (ABPA)¹⁸ 또는 낭 성 섬유 증 (CF)¹⁸에 곰 팡이 성장 기도), mucins의와 GMS 반응성 유도 다 당 류-풍부한 mucins¹⁹ 일반적인 GMS + 결과 하 고 따라서 높은 균 부담에 찬성 하 여 몇 가지 샘플을 기울일 수 있습니다. IA의 neutropenic 모델을만이 연구에 사용 되었다, 다른 면역 능력 또는 진압 모델의 사용 덜 비교 결과에 결과 수 가능 하다. 이러한 경고에도 불구 하 고 GMS 정량화 곰 팡이 부담을 결정 하는 유사한 기술 하며 추가 연구에 지속적인된 사용 유틸리티 일관성, 신뢰성, 그리고 비용 효과적으로이 방법의 유효성을 검사 추가 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution	Fungal Genetics Stock Center	FGSC #A1100
HyPure Cell Culture Grade Water	Thermo Fisher Scientific	SH30529.03
Malt Extract	MP Biomedicals	2155315	White Powder
BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone	Fisher Scientific	L11843
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)	Fisher Scientific	D16-3
Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1423-500
Auto Dry Cabinet	Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD	HSFC160FD
1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1375
0.5 mm Glass Beads	BioSpec Products	11079105
15 ml Conical Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650
Hemacytometer	Fisher Scientific	# 0267110
Leica Model DME Microscope	Leica	13595XXX
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8662-500 ml
1.5 ml tubes	Fisher Scientific	# 05-408-129
BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in.	Sigma-Aldrich	Z192384
Anti-mouse-Ly-6G antibody	BioXCell	BP0075-1	Clone 1A8
Caspofungin diacetate	Sigma-Aldrich	SML0425
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	1169567762
Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine	Supera Anesthesia Innovations	M3000
Pureline Oxygen Concentrator	Supera Anesthesia Innovations	OC8000
Slant Board Restraint	Indiana State University Facilities Management	Custom made
Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets	Fisher Scientific	F123601G
Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus)	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68
General-Purpose Broad-Tipped Forceps	Fisher Scientific	10-300
Fisherbrand Standard Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps	Fisher Scientific	10-275
Ethyl Alcohol-200 Proof	PHARMCO-AAPER	111000200
Fisherbrand Absorbent Underpads	Fisher Scientific	14-206-63
BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in.	Fisher Scientific	Z192406
All-Plastic Norm-Ject Syringes	Fisher Scientific	14-817-30
IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B	Fisher Scientific	NC9742754
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
50 ml Conical Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs	Fisher Scientific	B1000729
Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax	Fisher Scientific	22-900-700
Disposable Base Molds	Fisher Scientific	22-363-554
Reichert Jung Histocut 820 Microtome	Labequip.com	31930
Water Bath	Precision Scientific	66630-23
CO2 Incubator	Fisher Scientific	116875H
Silver Stain (Modified GMS) Kit	Sigma-Aldrich	HT100A-1KT
Fast Green FCF	Fisher Scientific	AC410530250
Frosted Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-343
Fisherfinest Superslip Cover Glass	Fisher Scientific	12-545-89
Cytoseal XYL	Fisher Scientific	22-050-262
Olympus Provis AX70 Microscope	Olympus	OLYMPUS-AX70
U-PHOTO Universal Photo System	Olympus	OLYMPUS-U-PHOTO
U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX	Olympus	OLYMPUS-U-MCB-2
U-PS POWER SUPPLY UNIT	Olympus	OLYMPUS-U-PS
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System	LABCONCO	7740020
Maxima C Plus Vacuum Pump	Fisher Scientific	01-257-80	Displacement- 6.1 cfm
1-Butanol	Fisher Scientific	A383-4
AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS	Fisher Scientific	NC9573988
Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps	Fisher Scientific	# 02-682-557
Mini-Beadbeater-24	BioSpec Products	112011
BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS	Fisher Scientific	NC0451999
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)	Fisher Scientific	BP152-1
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus	Fisher Scientific	A144S
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate	Fisher Scientific	S311
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis	Fisher Scientific	BP166
Chloroform/isoamyl alcohol 24:1	Fisher Scientific	AC327155000
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer	Fisher Scientific	11-120-570
Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes	Fisher Scientific	AB4137A
Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′	Integrated DNA Technologies	N/A
Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′	Integrated DNA Technologies	N/A
Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′	Integrated DNA Technologies	N/A
Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL	Fisher Scientific	43-165-67
Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips	Fisher Scientific	AB-0386
Mx3005P QPCR System, 110 Volt	Agilent	401443	Stratagene is now owned by Agilent
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	000651
C57BL/6 (B6) mice	The Jackson Laboratory	000664
Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice	The Jackson Laboratory	005653
γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice	The Jackson Laboratory	002120
ImageJ Software	National Institutes of Health	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
Spot Advanced Software	Spot Imaging	SPOT53A	http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/
GraphPad Prism 6	GraphPad Software	N/A	https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Fisherbrand Absorbent Underpads	Fisher Scientific	14-206-62
Step 4.5			http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf