נוהל מקיף כדי להעריך את ביצועי במבחנה כורוידאלית Hemangioblastoma בשם משתמש את ספרואיד הלבלוב Assay

Summary

מאמר זה מציג נוהל מקיף כדי להעריך במבחנה אם אנגיוגנזה קלאסי קיימת ב- hemangioblastomas (HBs) ותפקידו HBs. התוצאות להאיר את המורכבות של HB-כורוידאלית, מציע כי זו הצורה השכיחה של אנגיוגנזה הוא רק מנגנון משלים ב- HB-כורוידאלית.

Abstract

איון של הגן מדכא הגידול פון היפל-Lindau. אייצ ' (.-אל) ממלא תפקיד מכריע בהתפתחות של hemangioblastomas (HBs) בתוך מערכת העצבים המרכזית אנושי (CNS). עם זאת, התהליך האבולוציוני של HBs (כולל כורוידאלית) והן המקור cytological נותרו שנויים במחלוקת, אנגיוגנזה עבור אייצ '-אל-HBs, בהתבסס על קלאסי על בסיס חצי פנסיון אנגיוגנזה, יצרו תוצאות מאכזבות בניסויים קליניים. מכשול רציני תרגום קליני מוצלח של טיפול אנטי-כלי הדם היא חוסר הבנה מעמיקה של כורוידאלית זה הגידול בכלי הדם. במאמר זה, נציג נוהל מקיף כדי להעריך במבחנה אם אנגיוגנזה קלאסי קיימת ב- HBs, וכן את תפקידו ב- HBs. באמצעות הליך זה, חוקרים יכולים במדויק להבין את המורכבות של כורוידאלית על בסיס חצי פנסיון ולזהות את הפונקציה של זו הצורה השכיחה של אנגיוגנזה HBs. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש כדי להעריך את הטיפול האנטי-וסקולרית המבטיחים ביותר עבור גידולים, אשר יש פוטנציאל גבוה translational לטיפול גידולים או לסיוע באופטימיזציה של הטיפול האנגיוגנזה anti HBs בעתיד תרגומים. התוצאות להאיר את המורכבות של כורוידאלית על בסיס חצי פנסיון, מציע כי אנגיוגנזה טופס הנפוץ הזה הוא רק מנגנון משלים בכורוידאלית על בסיס חצי פנסיון.

Introduction

Hemangioblastomas (HBs) הם גידולים שפירים כלי הדם אשר נמצאים אך ורק בתוך האדם מערכת העצבים המרכזית (CNS). הם מפתחים אצל חולים עם מחלת פון היפל-לינדאו (אייצ '-אל) או נגעים סדיר. אייצ '-אל-HBs קשה לרפא באמצעות טיפול כירורגי עקב הישנות תכופים, נגעים מרובים לנבוע זה גנטי ההפרעה¹. למרות איון של הגן מדכא הגידול אייצ '-אל נחשב שורש tumorigenesis של אייצ '-אל-HBs, המקור cytological (כולל כורוידאלית) ואת התהליך האבולוציוני של HBs נותרו במחלוקת במידה רבה². לכן, הבנה טובה יותר של המנגנונים הביולוגיים HB-neovascular עשוי לספק תובנות שימושיות האסטרטגיות אנטי-וסקולרית המבטיחים ביותר אייצ '-אל-HBs.

מחקרים אחרונים הראו כי על בסיס חצי פנסיון-כורוידאלית דומה^4,3,embryologic vasculogenesis⁵. קלאסי כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF)-אנגיוגנזה בתיווך כי מקורם אנדותל כלי הדם, אשר מונעת על ידי אייצ '-אל אובדן התפקוד, גרמו התפשטות והזמנו neovascular היווצרות, אשר כבר⁶. בשנת 1965, Cancilla וצימרמן מצא, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, כי HBs מקורם אנדותל⁷. מאוחר יותר התברר כי תאי סטרומה נגזרים מתוך רכיב vasoformative⁸. בשנת 1982, Jurco. et al. נמצא כי תאי סטרומה הם מקור אנדותל⁹. לכן, שיערנו כי תאי אנדותל כלי הדם אדם הם התאים המקוריים של HB-כורוידאלית¹⁰. אמנם עדיף להשתמש התרבויות העיקרי מתאי HB נגזר אייצ '-אל המטופל ניתוחים, מחקרים קודמים שלנו ציינו כי תרבויות העיקרי של HB אינם יציבים, שורות תאים לא יכול להיות הוקמה³. יתר על כן, תרבויות ראשי בסביבת 3D לא יוכל לזהות המקור cytological של HB-כורוידאלית כי הם כוללים המוצא לאגס התרבותי מרכיבים על בסיס חצי פנסיון-וסקולרית^10,11. לכן, כמודל פרימיטיביים וקלאסי של תאי אנדותל, תאי אנדותל כלי הדם (HUVEC) אדם יכול לשמש מודל הסלולר אלטרנטיבי HBs.

וזמינותו נבטי ספרואיד הוא מודל חדש^12,הנדסת רקמות,¹³. בנייר זה, יישום תלת-ממד coculture מבוססי קולגן מערכת במבחנה באמצעות ספרואיד את לבלוב assay פותחה, עם מטרה הכוללת כדי להעריך אם אנגיוגנזה קלאסי קיימת ב- HBs, וכן את תפקידו ב- HBs.

Protocol

שיטה זו בוצעה בהתאם הנחיות שאושרו והתקנות של מחקר אתיקה הוועדה של Huashan חולים, אוניברסיטת פודאן (fudan). אמצעי בטיחות סטנדרטית המתאימה עקבו כל צעד. עבור מצגת סכמטית, נא עיין באיור 1.

1. תא תרבות ובבניית פלסמיד

1. באופן שגרתי לשמור על התא אנדותל יפתור (HUVEC) ב Dulbecco המתואמת של בינוני הנשר (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), יחידה/mL 100 של פניצילין, µg/mL 100 של סטרפטומיצין % 5 humidified CO₂ מגשים ב 37 º C.
2. תקציר PLKO.1 פלסמיד עם ApaI, EcoRI לסינתזה של פרגמנט shRNA. ודא כי הרצף oligonucleotide של וקטור shRNA אייצ '-אל CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG¹⁴.
3. לאחר מכן, מערבבים 20 מערכת µΜ עם µL 5 קדימה oligo, 5 µL של oligo הפוכה, 5 µL של 10 x מאגר נב ו 35 µL של ddH₂O יחד (לנפח הכללי הוא 50 µL). מחממים את התערובת ב 98 ° C 4 דקות, לאט מגניב עד לטמפרטורת החדר בעוד כמה שעות.
4. מאתרים ומפסיקים את annealed oligos ואת פלסמיד PLKO.1 יחד עם T4 ליגאז ב 4 ° C נלון. 16 h מאוחר יותר, הוסף 5 µL של מצדו מיקס 25 µL תאים DH5α המוסמכת. לאחר מכן, מסך של פלסמידים מחוברים בהצלחה ולאחר לאמת השבר שנוסף על-ידי רצף.

2. lentivirus החבילה ואת זיהום

1. בסך הכל, מערבבים µg 10 של וקטור PLKO.1-shVHL או PLKO.1-shScramble, µg 7.5 של אריזת פלסמיד psPAX2 ו- 2.5 µg של המעטפה pMD2.G פלסמיד ב 500 µL של התקשורת DMEM ללא סרום שור עוברית (FBS) במשך 25 דקות.
2. להוסיף mLDMEM 7 ללא FBS הפתרון המוכן מעל.
3. התרבות התאים מטרים 293 DMEM ללא FBS במנות תרביות רקמה 10 ס מ קוטר. ודא מספר התאים מטרים 293 1 x 10⁷ באמצעות מונה התא.
4. להוסיף 1 מ"ל של הפתרון המוכן מעל למדיום של תאים מטרים 293 על תרביות תאים.
   הערה: שורת התאים מטרים 293 נגזר מן הקו תא 293F ולבטא stably גדול SV40 T אנטיגן. לכן, זה פונדקאי מתאים לייצור lentiviral.
5. להחליף את המדיום התרבות DMEM המכיל 10% FBS לאחר 6 שעות.
6. לאסוף את המדיה באמצעות פיפטה ב- 48 שעות לאחר תרביות תאים.
   הערה: הוירוס קיים DMEM המכיל 10% FBS. התאים המתים לצוף על בינוני. להשתמש ממברנה סטרילי מיקרומטר 0.45 לסינון של תאים מתים וזוהמה. באופן כללי, יש צורך לבדוק את הריבוי של זיהום (MOI). זה כדי לייסד. תאים יציב. בשלב האחרון, כל התאים החיים ללא זיהום מוצלחת תמות עד puromycin. ShScramble קבוצה של תאים HUVEC הם קבוצת הביקורת. ודא כי כל התאים HUVEC למות עם ריכוז puromycin בשימוש על ידי 72 h. כל טוב יש את אותו מספר של תאים.
7. התרבות התאים HUVEC בתקשורת lentiviral עבור 72 h. לאחר מכן, להוסיף puromycin התקשורת של תאי HUVEC-ריכוז של µg/mL 2 עבור ה 24 תאים לשימוש HUVEC ללא כל טיפול כחלק מקבוצת הביקורת. ודא כי כל לשלוט תאים מתים בזמן הזה.
   הערה: התאים החיים מייצגים קו תא יציב של תאים תמונות ציפורים אייצ '-אל ותאים shSramble. צפיפות ציפוי היא 5000/טוב ב 96-ובכן צלחות.

3. הדור של תאי אנדותל Spheroids

1. Trypsinize תאי HUVECs, resuspend בטווח הבינוני DMEM עם 10% FBS. עם מספר תאים לצלחת תרבות 10-ס מ, להוסיף 1 מ"ל של typsin-EDTA.
2. זרע התאים בצלחת 96-ובכן למטה סיבוב תלת-ממד, ב צפיפות התאים של 1 × 10³ תאים/טוב. השתמש גם להכיל ספרואיד של µL 0.50 להשעות את ספרואיד. ספירת תאים באמצעות מערכת מונה תא ההוראות של היצרן.
3. דגירה התאים ב 37 ° C ו- 5% CO₂ ברציפות במשך 72 h. בתנאים אלה, ודא כי התאים מושעה טופס על spheroids תא באופן אוטומטי. להחליף חצי של המדיום תרבות לאחר 36 שעות.

4. במבחנה Assay אנגיוגנזה

1. להפשיר את הפתרון ג'ל ב 4 ° C, לדלל את זה עם המדיום סרום מופחת ביחס דילול של 1:5.
2. למצוץ את spheroids של המדיום התרבות DMEM עם micropipette. לאחר הרחצה spheroids עם 5 מ של מדיום מופחת סרום, להשעות את spheroids בעדינות ובזהירות הג'ל מדולל. ודא כי ישנם אין בועות אוויר.
3. הטבע µL 300 של נוזל מעורב לתוך צלחת 15-. טוב. לאחר דגירה-37 ° C ו- 5% CO₂ עבור 1 h, להוסיף 400 µL מדיום מופחת סרום מכל קידוח. למלא במים סטריליים סביב הבארות ליצירת סביבה humidified לעכב אידוי.
4. לאחר מכן, תרבות הצלחת ב 37 ° C ב- 5% CO₂ ב- 100% לחות לשעה.
5. בזהירות תשאף המדיום הישן ולהחליף אותו על ידי 600 µL של מדיום מופחת סרום 1% תא אנדותל הצמיחה תוספי כל היטב.
6. לאחר 12 שעות או 24 שעות ביממה, לקחת תמונות תחת מיקרוסקופ אור הפוך (40 *).

5. ניתוח נתונים

1. להעלות את התמונות פלטפורמת ניתוח תמונה באינטרנט כדי לקבל נתוני אורך נבט (טבלה של חומרים).
2. בדף האינטרנט, ליצור חשבון בדואר אלקטרוני.
3. ואז להעלות את התמונות על ידי לחיצה על כפתור ההעלאה.
4. להוריד את התוצאה על ידי לחיצה על לחצן הורד.
   הערה: התוכנה יפיק את התמונה המעובדת ואת הנתונים. הנתונים מכילים לחמישה חלקים: נבט המצטבר אורך, אורך נבט מרושע, סטיית התקן של נבט אורך, נבט אזור ואזור ספרואיד. בתמונה מעובד, כל פרמטר המותווה בצבע שונה כדי להקל על זיהוי בתמונה המעובדת: אדום מייצג נבטים שלד, צהוב מספר נבטים, כחול את מבנה נבט, וסוף לבן נבט, ספרואיד כתום.

תוצאות

התמונות המקוריות נלקחים על ידי מיקרוסקופ אור הפוך. דמויות טיפוסיות של קבוצת הביקורת וקבוצת אייצ '-אל מוצגים באיור2-A1 , איור 2-A2. אורך נבטי של קבוצת הביקורת היא קצרה יותר מזו של קבוצת אייצ '-.

...

Discussion

לאחרונה, מספר תחומי מחקר לביולוגיה היו מגורה על ידי המחקר של אנדותל האנגיוגנזה¹⁵. במאמר זה, פיתחנו ספרואיד אנדותל של לבלוב טכניקה כמודל ניסויי ללמוד היווצרות כלי שמקורו ג'ין אייצ '-אל אובדן התפקוד בתאי האנדותל מניפולציות כדי לזהות מולקולות המועמד הרומן של אשד אנגיוגנזה. למיטב ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
human umbilical vein endothelial cell	Fudan IBS Cell Center	FDCC-HXN180
dulbecco’s modified eagle’s medium	Gibco	11995040
fetal bovine serum	Gibco	26400044
PLKO.1-puro vector	Addgene	#8453
packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
3D round-bottom 96-well plates	S-Bio	MS-9096M
matrigel	BD Biosciences	354234
Opti-MEM medium	Gibco	31985-070	reduced serum medium
15-well plate	Ibidi	81501	Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the μ–Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight
endothelial cell growth supplements	Sciencell	#1052
10-cm culture dish	Corning	Scipu000813
Puromycin	Gibco	A1113802
typsin-EDTA	Gibco	25200056
Automated Cell Counter System	BioTech
Image Analysis software	Winmasis		http://mywim.wimasis.com