Um procedimento abrangente para avaliar o desempenho In Vitro da neovascularização de Hemangioblastoma putativo usando o Spheroid brotando do ensaio

Resumo

Este trabalho apresenta um procedimento abrangente para avaliar em vitro se vasculogênese clássico existe em hemangioblastomas (HBs) e seu papel na HBs. Os resultados destacam a complexidade do HB-neovascularização e sugerem que esta forma comum de angiogênese é apenas um mecanismo complementar no HB-neovascularização.

Resumo

A inactivação do gene supressor de tumor da von Hippel-Lindau (BVS) desempenha um papel crucial no desenvolvimento da hemangioblastomas (HBs) dentro do sistema nervoso central humano (CNS). No entanto, tanto a origem citológica e o processo evolutivo da HBs (incluindo a neovascularização) permanecem controversas, e antiangiogênese para BVS-HBs, baseados no clássico HB angiogênese, têm produzido resultados decepcionantes em ensaios clínicos. Um grande obstáculo para o sucesso clínico tradução de tratamento anti-vascular é a falta de uma compreensão completa de neovascularização neste tumor vascular. Neste artigo, apresentamos um procedimento abrangente para avaliar em vitro se vasculogênese clássico existe em HBs, bem como seu papel na HBs. Com este procedimento, pesquisadores com precisão podem compreender a complexidade do HB neovascularização e identificar a função desta forma comum de angiogênese em HBs. Estes protocolos podem ser usados para avaliar a terapia anti-vascular mais promissor para os tumores, que tem alto potencial de translação para tratamento de tumores ou para ajudar na otimização do tratamento antiangiogênico para HBs, no futuro, traduções. Os resultados destacam a complexidade da HB neovascularização e sugerem que esta angiogênese formulário comum é apenas um mecanismo complementar em HB neovascularização.

Introdução

Hemangioblastomas (HBs) são tumores vasculares benignos encontrados exclusivamente dentro do sistema nervoso central humano (CNS). Eles desenvolvem em pacientes com doença de von Hippel-Lindau (BVS) ou lesões esporádicas. BVS-HBs são difíceis de curar através de tratamento cirúrgico devido a frequente recorrência e desordem de múltiplas lesões que resultam genética¹. Embora a inactivação do gene supressor de tumor da BVS tem sido considerada a causa de tumorigênese da BVS-HBs, a origem citológica (incluindo a neovascularização) e processo evolutivo de HBs permanecem em grande medida controversa². Portanto, uma melhor compreensão dos mecanismos biológicos HB-neovascular pode fornecer insights úteis sobre antivasculares mais promissoras para BVS-HBs.

Recente pesquisa sugeriu que HB-neovascularização é semelhante ao embriológicas vasculogenesis^3,4,5. Clássico vascular fator de crescimento endotelial (VEGF)-mediada angiogênese que originou o endotélio vascular e que é impulsionado pela perda da BVS da função resultou na proliferação e formação neovascular, que tem sido desafiado a⁶. Em 1965, Cancilla e Zimmerman encontrado, usando microscopia eletrônica, que HBs originaram-se o endotélio⁷. Mais tarde verificou-se que as células do estroma são derivadas de vasoformative elemento⁸. Em 1982, Jurco et al . encontraram que as células do estroma são de origem endotelial⁹. Portanto, formulamos a hipótese que vascular em células endoteliais humanas é as células originais do HB-neovascularização¹⁰. Embora seja melhor usar as culturas primárias de HB células derivadas de cirurgias pacientes BVS, nossa pesquisa anterior indicou que culturas primárias de HB não são estáveis, e linhas de célula não podem ser estabelecida³. Além disso, as culturas primárias no ambiente 3D não conseguiu identificar a origem citológica do HB-neovascularização porque eles incluem os progenitores de HB-vascular ingredientes^10,11. Portanto, como um modelo primitivo e clássico das células endoteliais, células endoteliais vasculares humanas (HUVEC) poderiam servir como um modelo alternativo de celular para HBs.

O ensaio de germinação esferoide é um novo modelo em tecido engenharia^12,13. Neste trabalho, um 3D baseados em colágeno coculture sistema em vitro usando o spheroid brotando do ensaio foi desenvolvido, com um objectivo global para avaliar se a vasculogênese clássico existe em HBs, bem como seu papel na HBs.

Protocolo

Esse método foi realizado em conformidade com as directrizes aprovadas e regulamentos da investigação ética Comissão de Huashan Hospital, Universidade de Fudan. Medidas de segurança padrão correspondente foram seguidas em cada etapa. Para uma apresentação esquemática, por favor consulte a Figura 1.

1. celular cultura e construção do plasmídeo

1. Rotineiramente, manter a veia umbilical humana endothelial da pilha (HUVEC) no Dulbecco modificada do suplementado Eagle (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 unidades/mL de penicilina e 100 µ g/mL de estreptomicina em um 5% umidificado incubadora de CO₂ a 37 ° C.
2. PLKO.1 Digest plasmídeo com ApaI e EcoRI para a síntese do fragmento de shRNA. Certifique-se de que a sequência do oligonucleotide do vetor de shRNA BVS é CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG¹⁴.
3. Em seguida, misture 20 sistema µΜ com frente 5 µ l de oligo, 5 µ l de oligo reverso, 5 µ l de 10x buffer de NEB e 35 µ l de DDQ₂O junto (o volume total é de 50 µ l). Aqueça a mistura a 98 ° C durante 4 min e lentamente a frio até à temperatura em poucas horas.
4. Ligam os oligos recozidos e plasmídeo PLKO.1 juntamente com T4 ligase a 4 ° C para a noite. 16 h depois, adicione 5 µ l do mix de ligadura em 25 µ l competente DH5α as células. Em seguida, tela os plasmideos com êxito ligados e verifique se o fragmento inserido por sequenciamento.

2. infecção e pacote de lentivirus

1. No total, misture 10 µ g do vetor PLKO.1-shVHL ou PLKO.1-shScramble, 7,5 µ g do plasmídeo psPAX2 de embalagem e 2,5 µ g do envelope do plasmídeo pMD2.G em 500 µ l da mídia DMEM sem soro fetal bovino (FBS) por 25 min.
2. Adicione 7 mLDMEM sem FBS a solução preparada acima.
3. Células de cultura 293FT no DMEM sem FBS em um pratos de cultura de tecido de 10 cm de diâmetro. Certifique-se de que o número de células de 293FT é 1 x 10⁷ usando um contador de célula.
4. Adicione 1 mL da solução preparada acima para o meio das células de 293FT para transfeccao.
   Nota: A linha de celular 293FT é derivado da linhagem de células 293F e estàvel expressar o antígeno de T grande SV40. Portanto, é um hospedeiro adequado para a produção de Lentivirus.
5. Substituir o meio de cultura com o DMEM contendo 10% FBS após 6 h.
6. Recolha a mídia usando uma pipeta em 48 h depois do transfection.
   Nota: O vírus existe no DMEM contendo 10% FBS. O flutuador de células mortas no meio. Use estéril membrana de 0,45 µm para filtrar as células mortas e impurezas. Geralmente, não há nenhuma necessidade de verificar a multiplicidade de infecção (MOI). Isto é para estabelecer uma linha de células estáveis. Na última etapa, todas as células vivas sem infecção bem sucedida morrerá por puromicina. O grupo shScramble e células HUVEC são um grupo de controle. Certifique-se de que todas as células HUVEC morrercom com a concentração de puromicina usado por 72 h. Cada poço tem o mesmo número de células.
7. Cultura de células HUVEC na mídia lentivirus para 72 h. Em seguida, adicione a puromicina aos meios de comunicação das células HUVEC na concentração de 2 µ g/mL para células de uso HUVEC 24 h. sem qualquer tratamento, como o grupo de controle. Certifique-se de que todos controlam células morrem por esta altura.
   Nota: As células vivas representam uma linha de celular estável da BVS "knockdown" células e células shSramble. A densidade do chapeamento é 5.000/bem em placas de 96 poços.

3. geração de células endoteliais esferoides

1. Trypsinize as células de HX e Resuspenda em meio DMEM com 10% FBS. Com um número moderado de células numa placa de cultura de 10 cm, adicione 1 mL de EDTA-typsin.
2. As células em uma placa de 96 poços de fundo redondo 3D, em uma densidade de células de 1 × 10³ células/poço da semente. Use um bem que pode acomodar um esferoide de 0,50 µ l para suspender o spheroid. Contar as células usando um sistema de contador de células seguindo as instruções do fabricante.
3. Incube as células a 37 ° C e 5% CO₂ continuamente por 72 h. Nestas condições, certifique-se de que a suspensão de células formam os esferoides de célula automaticamente. Substitua metade do meio de cultura após 36 h.

4. ensaio de angiogênese in vitro

1. Descongelar a solução de gel a 4 ° C e dilui-lo com o meio de soro reduzido a uma proporção de diluição de 1:5.
2. Chupe os esferoides DMEM meio de cultura com uma micropipeta. Depois de lavar os esferoides com 5 mL de meio de soro reduzida, suspenda os esferoides suavemente e cautelosamente no gel diluído. Certifique-se de que não há nenhuma bolha de ar.
3. Incorpore a 300 µ l de líquido misturado em uma placa de 15. Após incubação a 37 ° C e 5% de CO₂ para 1 h, adicione 400 µ l de meio de soro reduzida a cada poço. Encha de água estéril em torno dos poços para gerar um ambiente umidificado para impedir a evaporação.
4. Depois disso, cultura a placa a 37 ° C em 5% CO₂ em 100% de umidade por 1h.
5. Cuidadosamente, Aspire o meio velho e substituí-lo por 600 µ l de meio de soro reduzida com suplementos de crescimento de células endoteliais de 1% em cada poço.
6. Depois de 12h ou 24h, tirar fotos sob um microscópio invertido (40 *).

5. análise de dados

1. Carregar as imagens para uma plataforma de análise de imagem on-line para obter dados de comprimento de broto (Tabela de materiais).
2. Na página da Web, crie uma conta por e-mail.
3. Em seguida, carregar as imagens, clicando no botão upload.
4. Baixe o resultado clicando no botão de download.
   Nota: O software irá gerar a imagem processada e os dados. Os dados contêm cinco partes: broto cumulativa comprimento, comprimento do broto média, o desvio-padrão de comprimento do broto, broto área e área de esferoide. Na imagem processada, cada parâmetro é descrito em uma cor diferente para facilitar a identificação da imagem processada: vermelha representa sprouts esqueleto, amarelo com o número de brotos, azul a estrutura broto, broto branco final e esferoide laranja.

Resultados

Imagens originais são tomadas pelo microscópio invertido. As imagens típicas do grupo controle e o grupo BVS são mostradas na Figura 2-A1 e Figura 2-A2. O comprimento de germinação do grupo controle é mais curto que a do grupo BVS.

Depois de carregar as imagens, a plataforma on-line fornece resultados de análise diretamente. A s...

Discussão

Recentemente, vários campos de pesquisa da biologia vascular foram estimulados pelo estudo do endotélio angiogênico¹⁵. Neste artigo, nós desenvolvemos um esferoide endotelial brotando técnica como modelo experimental para estudar a formação de vasos que se origina a perda do gene da BVS da função nas células endoteliais manipuladas para identificar moléculas candidato romance do angiogênico cascata. O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro relatório para examinar os efeitos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
human umbilical vein endothelial cell	Fudan IBS Cell Center	FDCC-HXN180
dulbecco’s modified eagle’s medium	Gibco	11995040
fetal bovine serum	Gibco	26400044
PLKO.1-puro vector	Addgene	#8453
packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
3D round-bottom 96-well plates	S-Bio	MS-9096M
matrigel	BD Biosciences	354234
Opti-MEM medium	Gibco	31985-070	reduced serum medium
15-well plate	Ibidi	81501	Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the μ–Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight
endothelial cell growth supplements	Sciencell	#1052
10-cm culture dish	Corning	Scipu000813
Puromycin	Gibco	A1113802
typsin-EDTA	Gibco	25200056
Automated Cell Counter System	BioTech
Image Analysis software	Winmasis		http://mywim.wimasis.com