דור ובידוד של מחזור התא נעצר תאים עם Karyotypes מורכבים

Summary

אנאפלואידיה מוביל לחוסר יציבות הגנום, אשר בסופו של דבר מייצר תאים בבידוד-מחזור התא עם karyotypes מורכבים. מאמר זה מספק שיטה פשוטה ונוחה לבודד תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים זה להפסיק לחלק.

Abstract

סגרגציה שגויה כרומוזום מוביל aneuploidy, מצב שבו תאים הנמל מספר כרומוזום מאוזנת. מספר קווי ראיה מציינות בחום שאנאפלואידיה הזה מעורר יציבות הגנום, בסופו של דבר ליצירת תאים עם karyotypes מורכבים זה לעצור את התפשטות שלהם. בידוד ואפיון של תאים מחסה karyotypes מורכבים מכריעים לחקור את ההשפעה של מספר כרומוזום מאוזנת על פיזיולוגיה של התא. נכון להיום, אין שיטות הוקמו באופן אמין בידוד תאי aneuploid כזה. מאמר זה מספק פרוטוקול העשרה וניתוח של תאים aneuploid karyotypes מורכבים ניצול טכניקות תרביות רקמה סטנדרטי, זולה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לנתח מספר תכונות של תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים לרבות פנוטיפ הפרשה הזדקנות ביולוגית-הקשורים המושרה, תכונותיהם הפרו דלקתיים, ואת היכולת לתקשר עם תאים חיסוניים. כי התאים הסרטניים הנמל לעיתים קרובות חוסר איזון, כרומוזום מספר, זה הכרחי לפענח כיצד אנאפלואידיה משפיעה על פיזיולוגיה של התא בתאים נורמליים, עם המטרה הסופית של חשיפת שני tumorigenic pro אנטי השפעותיו.

Introduction

שגיאות בתהליך של כרומוזום סגרגציה להוביל aneuploidy, מצב המאופיין מספר כרומוזום זה אינו כפולה של^3,42,1,המשלים הפלואידי. Aneuploid karyotypes על ההדק שכפול הלחץ שיוצר עוד אי יציבות גנומית^5,6,7,8,9,10, מגביר קריוטיפ המורכבות, ומוביל בסופו של דבר לעצור את מחזור התא של subpopulation של תאים¹⁰. מטרת השיטה המובאת כאן היא ליצירה להפריד כזה subpopulation רכיבה על אופניים תאים. על ידי שימוש בטכניקות תרביות רקמה זולה, פרוטוקול זה מקלה על בידוד ואפיון של מחזור התא נעצר תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים. תאים אלו נקראים תאים ArCK (Arrested עם מורכבות קריוטיפ) ואת עמיתיהם אופניים euploid כפקדים.

פרוטוקול זה הוא הראשון שהוקם למטרה זו מאפשרת הבידוד ואת המשך מחקר של קווי ArCK, כולל אך לא מוגבל, הזדקנות ביולוגית המושרה שלהם ועל פנוטיפ הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה (SASP), שלהם פרו-דלקתיים תכונות, היכולת שלהם לעסוק עם תאים חיסוניים. השיטה המוצגת כאן פותחה ב untransformed, מונצחים תאים אנושיים, אך לא נבדק עדיין בשורות סרטן. כמה תאים טרנספורמציה עשוי להיות חסר רגישות מחזור התא מעצר בשל דיכוי אחד או מספר מסלולים; לכן, נוסף אימות צריכה להתבצע בתוך שורות תאים אחרים.

Protocol

מצב התרבות

שורת התאים hTERT RPE-1 היה תרבותי במדיום של Dulbecco ששינה נשר (טבלה של חומרים) בתוספת 10% סרום שור עוברית, 2 מ מגלוטמין ו פניצילין U/ml 100/סטרפטומיצין.... התאים היו מודגרות ב 37 ° C עם 5% CO₂ בסביבת humidified. הפרוטוקול המתואר להלן פותחה על-ידי שימוש ס מ-10 מנות, כל הפרטים הטכניים דיווח לפנות את הצלחות. אם משתמש מנות שונות, גודל למעלה או למטה בהתאם.

1. סינכרון של תאי RPE-1

1. השתמש שהתאים טריים המופשרים שלא עברו יותר מ- 15 קטעים עבור כל הניסויים. יום 1, להפשיר, לוותר על ~2.5 - 5.0 x 10 תאים hTERT⁵ RPE-1 לתוך תבשיל תרביות רקמה ס מ-10. הוסף 8 מ של מדיום הגידול הסטנדרטי, דגירה בין לילה. לקבוע את מספר הטלפון הנייד באמצעות מונה תא סטנדרטי (כמו hemocytometer).
   הערה: תא צפיפות מתייחס תנאי הגידול של תאי RPE-1. תנאי הגידול עשוי להשתנות בין שורות תאים שונים; שקול לכוונן אותם בהתאם.
2. יום 2, לסנכרן תאים בגבול G1/S על-ידי כ רפה בעברית מדיום הגידול הרגיל והוספת 8 mL בינוני המכיל תימידין 5 מ מ.
   הערה: תימידין הריכוז והאורך של הטיפול עשוי להשתנות על פני שורות תאים שונים. רצוי לבצע ניסויים פיילוט כדי לקבוע את התנאים הטובים ביותר עבור קווי תא להיבדק.
3. יום 3, 24 שעות לאחר הוספת תימידין בינוני (שלב 1.2), שחרר תימידין בבלוק על-ידי כ רפה בעברית בינוני ושטיפת תאים שלוש פעמים עם 1 x PBS. הוסף 8 מ של מדיום הגידול רגילים וחוזרים צלחות החממה.

2. דור של Aneuploid תאים על ידי הפרעה הפעילות של Mps1 קינאז Mitotic

1. יום 3, 6 שעות לאחר שחרורו של תימידין בלוק (צעד 1.3; זה בערך 3-6 שעות לפני התאים נכנסים מיטוזה), תשאף בינוני, לשטוף פעם עם 1 x PBS, והחלף בינוני המכיל 500 nM reversine (החומר המדכא Mps1).
   הערה: תאי RPE-1 להזין מיטוזה 9-12 שעות לאחר תימידין שטיפת-אאוט^10,11. עם זאת, קינטיקה מחזור התא משתנים בין שורות תאים שונים. לכן, זה הכרחי לקבוע אלו קינטיקה בניסויים טייס על ידי ביצוע ניתוח מחזור התא על ידי שיטות הוקמה (למשל, על ידי מדידת ניתוח תוכן באמצעות FACS הדנ א). בנוסף, הריכוז עבודה אופטימלית של מעכבי Mps1 עשויים להשתנות בין שורות תאים. הקודם באמצעות תאים RPE1 הוכתר בהצלחה באמצעות reversine-ריכוז העבודה של 500 nM^10,11,12. רצוי לבצע ניסויים פיילוט כדי לקבוע ריכוז אופטימלי עבור שורת תאים להיבדק.
2. יום 4, 12 שעות לאחר הטיפול reversine (כ 6 שעות לאחר התאים היו מיטוזה), האחות reversine בינוני ולשטוף תאים שלוש פעמים עם 1 x PBS. להוסיף את מדיום הגידול רגיל 8 מ"ל לצלחת וחוזרים תאים החממה.

3. הסרת תאים אופניים Aneuploid והעשרה מאוכלוסיית ArCK

1. ביום 6, כ 72 h לאחר תאים להזין את מיטוזה ראשונה (צעד 2.2; זה כ 66 h לאחר reversine שטיפת-אאוט, התואם בערך 2-3 מחזורי תא), תשאף בינוני, לשטוף פעם עם 1 x PBS והחלף בינוני המכיל 300 nocodazole ננומטר.
   הערה: עבודה אחרונים הראו כי תאי RPE-1 מחסה aneuploid karyotypes genomically לא יציבים, לעצור את התפשטות שלהם על 2-3 מחזורי תאים לאחר¹⁰הראשונות מיטוזה פגום. עם זאת, קינטיקה הזה עשוי להשתנות בין שורות תאים שונים. לכן, חשוב לבצע ניסויים פיילוט כדי לקבוע את העיתוי הנכון עבור הסרת תאים אופניים aneuploid.
2. ביום 7, 12 שעות לאחר הטיפול nocodazole, תשאף בינונית ומוסיפים 3 מ"ל של 1 x PBS לצלחת. לנער את התאים mitotic על-ידי הקשה על הצד של הצלחת. לסובב את הצלחת בין לכל ברז כדי לאפשר גם הסרה של תאים mitotic.
3. כדי להבטיח הסרה מלאה של תאים mitotic, חזור על התהליך לנער-off עבור מספר סיבובים (3 - 5 פעמים מומלץ), כ רפה בעברית והוספת 3 מ"ל של PBS x 1 בין כל סיבוב.
4. לאחר טלטול-off, תשאף בעדינות כל נוזל אשר דבקה את המכסה או על הקצה של הצלחת. בקצרה, בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 10. ודא כי מספר תאים mitotic שנצפו. אם יותר מ-5 תאים mitotic נראים תחת המטרה X 10, חזור על סיבוב נוסף של שייק-off.
   הערה: התאים Mitotic יופיע מעוגל, עשוי להיות מנותקת חלקית לאחר טלטול-off. זה חיוני להבטיח הסרה מלאה של תאים mitotic לפני חשיפת התאים לסיבוב הבא של הטיפול nocodazole. כך עשויה להוביל למוות תא mitotic ו/או לגרום הדור של תאים tetraploid.
5. לאחר הסופי לנער-off, לשטוף תאים פעם אחת עם 5 מ של 1 x PBS. הוסף 8 מ ל בינוני המכיל 330 nocodazole ננומטר המשקולת, תקופת דגירה של 12 שעות.
6. חזור nocodazole טיפול/שייק-off (שלבים 3.1-3.5) כל 12 שעות עד אין תאים mitotic שנצפו לאחר דגירה. בדרך כלל, 4-5 סיבובים של טיפול/שייק-לא מומלץ.
   הערה: המידע הניתן כאן מתייחסים תאי RPE-1. מספר סיבובים של טיפול/שייק-off עשוי להשתנות בין שורות תאים שונים. כדי למנוע חשיפה ממושכת ומיותר nocodazole זה הכרחי לקביעת בקפידה, בניסוי פיילוט, מספר סיבובים הנדרשים להסרת מלאה ויעילה של תאים אופניים aneuploid.
7. אחרי 4-5 סיבובים של nocodazole טיפול/שייק-off (שלבים 3.1-3.6), להוסיף 10 מ של מדיום הגידול הרגיל, דגירה. מאפשרים לתאים לנוח במשך 12-24 שעות לפני השימוש מניפולציה או assay בעתיד.
   הערה: לאחר הסופי לנער-off, בתאי שנותרה על הצלחת מחזור התא נעצר, כפי שמוצג לאחרונה¹⁰, הנמל karyotypes מורכבים. תאים אלה מכונים תאי ArCK (Arrested עם קריוטיפ מורכבים). רצוי לבצע מבחני על אוכלוסיות ArCK בתוך שבוע של בידוד.
8. לחלופין, כדי להעריך את אחוז תאים נעצר עם karyotypes מורכבים, לאסוף ולספור תאים כל טלטול-off באמצעות מונה תא סטנדרטי.

איור 1: בסך הכל סכמטי של השיטה המשמשת ליצירה לבודד תאים aneuploid עם מורכבות קריוטיפ (ArCK) ותמונות נציג. (א) סכמטי של ArCK תאים פרוטוקול דור ובידוד. (B) להחליפן בתמונות של תאי RPE-1 hTERT בכל שלב של הטיפול. הלוח האחרון (המתוארים באדום) מייצג את התאים ArCK מבודדים. סולם בר 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

4. אפיון אוכלוסיית ArCK

1. לאשר הבידוד מוצלח מאוכלוסיית ArCK על ידי ביצוע של מבחני הבאים.
   1. בטא ישבנים-צביעת (דה מרקר של הזדקנות ביולוגית) galactosidase באמצעות זמינים מסחרית קיט (ראה טבלה של חומרים).
   2. למדוד הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון CCL2, על ידי העסקת ערכות זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).
   3. אשר רמות מוגברת של מחזור התא מעכבי p53, p21, p16 מאת המערבי כתם.
      הערה: לשלוט כראוי את מבחני אלה, ArCK אוכלוסיות צריך להשוות לתאים אופניים הן euploid והן aneuploid. הראשון הוא המעבר נמוך, פראי-סוג RPE-1 hTERT תאים שצומחת אקספוננציאלית. האחרון ניתן להשיג על ידי גרימת כרומוזום סגרגציה שגויה ב RPE-1 hTERT קצירת תאים 72 h לאחר מיטוזה aberrant הראשון. לשם כך, בצע את הפרוטוקול המתואר לעיל מתאי שלב 1.1 והקציר ממש לפני הטיפול nocodazole הראשון (שלב 3.1).
2. לבצע רצף תא בודד כדי להעריך את קריוטיפ של התאים נעצר.
   הערה: רצף תא בודד היא שיטה מבוססת היטב כדי לקבוע שינויים כרומוזומלית ולא משנה כרומוזומלית לרוחב אוכלוסיה תא-ברמה תא בודד¹³. הליכים מפורטים כיצד לבצע רצף תא בודד ניתן למצוא במקום אחר¹⁰.

תוצאות

שיטה זו משתמשת מערכת תרביות רקמה במבחנה כדי לבודד תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים זה לעצור את ההתפשטות שלהם. אוכלוסייה זו נחשבת תאים ArCK (Arrested עם Karyotypes מורכבים). איור 1A מציג את הערכה של הניסוי. פראי-סוג אופניים RPE-1 hTERT תאים מסונכרנים בגבול G1/S עם תימידין, מטופלים עם מעכב Mps1 לזירוז כרומוזום סגרגציה שגויה. Nocodazole רעל ציר נוסף התאים 72 h לאחר אינדוקציה של כרומוזום סגרגציה שגויה. 12 שעות לאחר הטיפול nocodazole, התאים aneuploid כי הם עדיין מסוגלים להתרבות הזן מיטוזה, לכוד בשלב זה מחזור התא עקב הפרעה microtubule הפילמור. אלה לכודים תאים ואז מוסרות בקלות ע י טלטול עדין-off. התהליך לנער-off הוא חוזרות 3 - 5 פעמים כדי להבטיח הסרה מלאה של רכיבה על אופניים תאים. איור 1B מציג את התמונות נציג של תאי RPE-1 בכל שלב של הטיפול.

תאים ArCK להציג רמות מוגברת של מעכבי מחזור התא, כגון p53, p21 p16 לעומת euploid ו- aneuploid על אופניים תאים, כפי שמוצג באיור 2A. בנוסף, איור 2B מראה חיובי β-galactosidase מכתים בתאים ArCK לעומת תאים שליטה euploid, סמן ומבוססת על הזדקנות ביולוגית הסלולר.

איור 2: תוצאות נציג ניצול תאים ArCK. ((א)) תספיג הערכת רמות מעכב מחזור התא euploid, aneuploid על אופניים ותאים ArCK. הרמות של p53, p21 p16 נקבעו על ידי ניתוח תספיג חלבון. אקטין שימש פקד הטעינה. (B) β-galactosidase מכתים הערכת רמת הזדקנות ביולוגית בתאים ArCK. הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (β-גל) פעילות נקבע ב- euploid תאים ותאים ArCK. סולם בר 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מחזור התא זו מעצר הוא מאפיין בולט של תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים, כפי שמוצג על ידי ניתוח קריוטיפ נציג של תא בודד רצף איור 3, שבו תאים ArCK להציג מרובים, כרומוזום אקראי רווחים והפסדים. ממצא זה בהסכם מלא עם דוחות קודמים¹⁰.

איור 3: נציג תא בודד רצף של תאים ArCK. פילוח חלקות המציגה של קריוטיפ 6 תאים ArCK נציג. פילוח מראים את המספר עותק של כל הכרומוזומים בין 1 ל- X ביחס הפניה euploid בקנה מידה₂ יומן (סוג פראי RPE-1 הוא קו תא דיפלואידי ממוצא הנשי). כרומוזום רווחי מסומנים באדום, הפסדים כרומוזום בצבע ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

שיטה חדשנית זו כדי ליצור ולהעשיר עבור תאים נעצר עם קומפלקס karyotypes (ArCK) מאפשר חקר התאים יש כרומוזום רווחים או הפסדים מרובים. ולהפסיק לחלק. הגדרת השיטה תוכנן כדי להקל על הבידוד של תאים ArCK בצורה מהירה ואמינה.

השלב הקריטי ביותר זה וזמינותו בקפדנות שולט על ציר הזמן של הטיפול בתרופה, והכי חשוב, הסרת תאים אופניים aneuploid. לקבלת תוצאות מיטביות, העיתוי של טיפול nocodazole ו- shake-off יש חשיבות מיוחדת כדי להבטיח כי תאים אופניים יוסרו מן הצלחת בזמן שהם עדיין מעוגל, mitotic, מונע את האפשרות של מוות של תאים mitotic או גלישה לתוך G1, יצירת פוטנציאל אוכלוסיה tetraploid. לא מומלץ כי העיתוי של שייק-off סוטה יותר משעתיים מ הדגירה המומלץ nocodazole 12-h.

מחקרים עתידיים על ArCK תאים יש את הפוטנציאל לקדם הבנה עמוקה יותר של מה מורכב karyotypes להשפיע על פיזיולוגיה של התא. בפרט, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאים של המערכת החיסונית הם אינטראקציה עם, סיווג המערכת החיסונית הגורם המפעיל של ArCK תאים¹⁰. השיטה המתוארת כאן מספקת נקודת התחלה מצוינת עבור אפיון נוסף של תאים ArCK, כולל לבירור המנגנונים המולקולריים שבבסיס סיווג המערכת החיסונית תאים untransformed, המחקר של טרנספורמציה איך oncogenic ייתכן לעקוף את מנגנון מעקב זה, שאלה קריטית^14,שדה¹⁵.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Thermofisher	11995-073
Thymidine	Sigma Aldrich	T1859
Reversine	Cayman Chemical Company	10004412
Nocodazole	Sigma Aldrich	M1410
Anti-p53 antibody	Santa Cruz	sc-126
Anti-p21 antibody	Santa Cruz	sc-6246
Anti-p16 antibody	BD	554079
Senescence b-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit	R&D Systems	ARY005B