Génération et l’isolement des cellules Cycle cellulaire-arrêté avec caryotypes complexes

Résumé

Aneuploïdie entraîne l’instabilité du génome, qui finalement produit arrêté au cycle cellulaire des cellules avec des caryotypes complexes. Cet article fournit une méthode simple et pratique pour isoler les cellules aneuploïdes avec caryotypes complexes qui cessent de se diviser.

Résumé

Mauvaise ségrégation des chromosomes mène à l’aneuploïdie, une condition dans laquelle les cellules abritent un nombre chromosomique déséquilibré. Plusieurs éléments de preuve indiquent fortement qu’aneuploïdie déclenche l’instabilité du génome, en fin de compte générer des cellules avec des caryotypes complexes qui arrêtent leur prolifération. Isolement et caractérisation des cellules contenant des caryotypes complexes sont cruciaux pour étudier l’impact d’un nombre chromosomique déséquilibrée sur la physiologie cellulaire. A ce jour, aucuns méthodes n’ont été établies de manière fiable isoler ces cellules aneuploïdes. Cet article fournit un protocole pour l’enrichissement et l’analyse des cellules aneuploïdes avec caryotypes complexes utilisant des techniques de culture de tissu standard et peu coûteux. Ce protocole peut être utilisé pour analyser plusieurs caractéristiques des cellules aneuploïdes avec caryotypes complexes notamment leur induite phénotype sécrétoire associée à la sénescence, propriétés pro-inflammatoires et capacité d’interagir avec les cellules immunitaires. Parce que les cellules cancéreuses abritent souvent des déséquilibres dans le nombre de chromosomes, il est crucial de déchiffrer l’aneuploïdie impact sur la physiologie cellulaire dans les cellules normales, dont le but ultime de découvrir les deux ses pro - et anti - tumorigenic effets.

Introduction

Les erreurs dans le processus de ségrégation des chromosomes aboutissent à l’aneuploïdie, une condition caractérisée par un nombre de chromosomes qui n’est pas un multiple du complément haploïde^1,2,3,4. Aneuploïde caryotypes stress de réplication déclencheur qui génère davantage d’instabilité génomique^5,6,7,8,9,10, augmente complexité du caryotype et finalement conduit à l’arrêt du cycle cellulaire d’une sous-population de cellules¹⁰. Le but de la méthode présentée ici est de générer et de séparer telle une sous-population de cellules de cyclisme. En employant des techniques de culture de tissus bon marché, ce protocole facilite l’isolement et la caractérisation des cellules aneuploïdes cycle cellulaire-arrêté avec caryotypes complexes. Ces cellules sont appelées cellules ArCK (Arrested avec caryotype complexe) et leurs homologues de cyclisme euploïdes comme témoins.

Ce protocole est le premier à être mis en place à cet effet et permet l’isolement et approfondir des lignes ArCK, y compris, mais non limité à, leur sénescence induite et le phénotype sécrétoire associée à la sénescence (SASP), leur pro-inflammatoires caractéristiques et leur capacité à s’engager avec les cellules immunitaires. La méthode présentée ici a été développée dans les cellules humaines non transformées, immortalisées, mais n’a pas encore été testée dans des lignées cancéreuses. Certaines cellules transformées peuvent être insensibles à l’arrêt du cycle cellulaire due à la suppression d’une ou plusieurs voies ; par conséquent, outre validation doit être exécutée dans les autres lignées cellulaires.

Protocole

Condition de culture

Lignée cellulaire hTERT pre-1 a été cultivée dans de Dulbecco Modified Eagle (Table des matières) additionné de 10 % sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine et 100 U/ml de pénicilline/streptomycine. Les cellules ont été incubées à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ dans un environnement humidifié. Le protocole décrit ci-dessous a été développé en utilisant des plats de 10 cm et tous les détails techniques signalées se référer à ces plats. Si vous utilisez des plats différents, l’échelle vers le haut ou vers le bas en conséquence.

1. synchronisation des cellules pre-1

1. Utiliser des cellules fraîchement décongelées qui n’ont pas subi de plus de 15 passages pour toutes les expériences. Jour 1, décongeler et répartir ~2.5 - 5.0 x 10 cellules de hTERT⁵ pre-1 dans une boite de culture de tissu de 10 cm. Ajoutez 8 mL de milieu de croissance standard et incuber pendant la nuit. Déterminer le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules standard (par exemple un hémocytomètre).
   Remarque : La densité des cellules se réfère à des conditions de croissance des cellules pre-1. Conditions de croissance peuvent varier entre les différentes lignées cellulaires ; envisager d’ajuster en conséquence.
2. Jour 2, synchroniser les cellules à la frontière de G1/S en aspirant le milieu de croissance régulière et en ajoutant 8 mL de milieu contenant la thymidine 5 mM.
   NOTE : Concentration de la Thymidine et de la durée du traitement peuvent varier entre différentes lignées cellulaires. Il est conseillé d’effectuer des expériences pilotes afin de déterminer les meilleures conditions pour les lignes de la cellule à tester.
3. Le jour 3, 24h après avoir ajouté le milieu de la thymidine (étape 1.2), la libération de bloc de la thymidine par aspiration moyenne et laver les cellules trois fois avec du PBS 1 x. Ajoutez 8 mL de milieu de croissance régulière et remettez les plaques dans l’incubateur.

2. génération d’aneuploïde cellules par interférence avec l’activité de la Kinase mitotique Mps1

1. Le jour 3, 6 h après la sortie du bloc de la thymidine (étape 1.3 ; c’est environ 3 à 6 h avant les cellules entrent dans la mitose), aspirer moyenne, laver une fois avec du PBS 1 x et remplacer par un milieu contenant 500 nM reversine (inhibiteur de la Mps1).
   Remarque : Les cellules RPE-1 entrer mitose 9-12 h après la thymidine de wash-out^10,11. Toutefois, la cinétique du cycle cellulaire varient selon les différentes lignées cellulaires. Par conséquent, il est crucial déterminer ces cinétiques chez les expériences-pilotes en effectuant l’analyse du cycle cellulaire par des méthodes établies (par exemple, en mesurant l’analyse ADN contenu via FACS). En outre, la concentration optimale de travail de Mps1 inhibiteur peut varier entre lignées cellulaires. Des expériences antérieures à l’aide de cellules RPE1 ont réussi à l’aide de reversine à une concentration de travail de 500 nM^10,11,12. Il est conseillé d’effectuer des expériences pilotes pour déterminer la concentration optimale pour la lignée cellulaire à tester.
2. Jour 4, 12 h après le traitement de reversine (environ 6 h après les cellules en mitose), aspirer reversine moyen et laver les cellules trois fois avec du PBS 1 x. Ajoutez 8 mL de milieu de croissance régulière de la plaque et remettez les cellules dans l’incubateur.

3. Elimination des cellules aneuploïdes de cyclisme et l’enrichissement de la Population ArCK

1. Jour 6, environ 72 h après les cellules dans la première mitose (étape 2.2 ; il s’agit d’environ 66 h après reversine de wash-out, ce qui correspond à environ 2-3 cycles de cellule), aspirer moyenne, laver une fois avec du PBS 1 x et les remplacer avec un milieu contenant 300 nM nocodazole.
   NOTE : Les travaux récents ont montré que les cellules RPE-1 hébergeant des caryotypes aneuploïdes génomiquement instables et arrêtent leur prolifération sur les cycles cellulaires 2-3 après la première mitose défectueux¹⁰. Toutefois, cette cinétique peut varier entre les différentes lignées cellulaires. Par conséquent, il est crucial d’effectuer des expériences pilotes pour déterminer le moment approprié pour l’élimination des cellules aneuploïdes de cyclisme.
2. Jour 7, 12 h après le traitement de la nocodazole, aspirer moyen et ajouter 3 mL de solution 1 PBS x à la plaque. Secouer les cellules mitotiques en tapant sur le côté de la plaque. Faire pivoter la plaque entre chaque robinet pour voire le retrait des cellules mitotiques.
3. Afin d’assurer l’élimination complète des cellules mitotiques, répétez le processus shake-off pour plusieurs tours (3 - 5 fois recommandés), aspiration et l’ajout de 3 mL de solution de 1 PBS x entre chaque tour.
4. Après la secousse-off, aspirez doucement tout liquide qui ont adhéré et le couvercle ou le bord de la plaque. En bref, vérifiez la plaque sous un microscope à grossissement de 10 X. Veiller à ce que quelques cellules mitotiques soient respectées. Si plus de cinq cellules mitotiques sont perçus au titre de l’objectif 10 X, répéter une nouvelle série de shake-off.
   NOTE : Cellules mitotiques sembleraient arrondis et peuvent être partiellement détachées après la secousse du décollage. Il est essentiel d’assurer l’élimination complète des cellules mitotiques avant d’exposer les cellules pour le prochain cycle de traitement de la nocodazole. Faute de quoi peut conduire à la mort cellulaire mitotique et/ou dans la génération de cellules tétraploïdes.
5. Après la secousse définitive, laver les cellules une fois avec 5 mL de PBS 1 x. Ajoutez 8 mL de milieu contenant 330 nM nocodazole dans la plaque et incuber pendant 12 h.
6. Répétez nocodazole traitement/shake-arrêt (étapes 3.1-3.5) toutes les 12 h sans cellules mitotiques sont observés après incubation. Habituellement, les 4-5 cycles de traitement/shake-off sont recommandés.
   Remarque : Les informations fournies ici faire référence aux cellules de pre-1. Le nombre de tours de traitement/shake-off peut varier entre les différentes lignées cellulaires. Pour éviter une exposition excessive et inutile à la nocodazole, il est crucial de déterminer avec soin, dans une expérience pilote, le nombre de tours requis pour l’élimination efficace et complète des cellules aneuploïdes de cyclisme.
7. Après 4-5 tours de la nocodazole traitement/shake-arrêt (étapes 3.1-3.6), ajouter 10 mL de milieu de croissance régulière et incuber. Permettre aux cellules au repos pendant 12 à 24 heures avant l’utilisation future de manipulation ou d’un essai.
   NOTE : Après la secousse définitive, les cellules restantes sur la plaque sont cycle cellulaire arrêté et, comme indiqué récemment¹⁰, hébergent des caryotypes complexes. Ces cellules sont appelées cellules ArCK (Arrested avec caryotype complexe). Il est conseillé d’effectuer des essais sur les populations ArCK moins d’une semaine d’isolement.
8. Éventuellement, pour évaluer le pourcentage de cellules arrêtées avec caryotypes complexes, collecter et compter les cellules de chaque shake-off à l’aide d’un compteur de cellules standard.

Figure 1 : ensemble schématique de la méthode utilisée pour générer et isoler les cellules aneuploïdes avec caryotype complexe (ArCK) et images représentatives. (A) protocole de génération et l’isolement de cellules de schématique de ArCK. (B) les images représentant des cellules hTERT pre-1 à chaque étape du traitement. Le dernier panneau (encadré en rouge) représente les cellules isolées de ArCK. Balance bar 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

4. caractérisation des Population ArCK

1. Confirment la réussite de l’isolement de la population ArCK en effectuant les épreuves suivantes.
   1. Asses bêta-galactosidase (le marqueur de sénescence) une coloration utilisant un commercialement disponible nécessaire (voir la Table des matières).
   2. Mesurer la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, telles que CCL2, en employant des trousses disponibles dans le commerce (voir Table des matières).
   3. Confirmer l’intensification du cycle cellulaire inhibiteurs p53, p21, p16 par Western Blot.
      NOTE : Pour contrôler correctement ces tests, ArCK populations devraient être comparées aux cellules cyclisme euploïdes et aneuploïdes. Le premier est le passage bas, sauvage pre-1 hTERT cellules en croissance exponentielle. Ceux-ci peut être obtenus en induisant une mauvaise ségrégation des chromosomes dans la pre-1 hTERT et récolte des cellules 72 h après la première mitose aberrante. Pour cela, suivre le protocole décrit ci-dessus à l’étape 1.1 et récolte des cellules juste avant le traitement premier de la nocodazole (étape 3.1).
2. Effectuer des unicellulaires séquencement afin d’évaluer le caryotype des cellules arrêtées.
   NOTE : Le séquençage de cellule unique est une méthode bien établie pour déterminer les modifications chromosomiques et Sub chromosomiques dans une population de cellule à cellule unique niveau¹³. Des procédures détaillées pour savoir comment effectuer le séquençage unicellulaires se trouvent ailleurs¹⁰.

Résultats

Cette méthode utilise un système de culture de tissus in vitro afin d’isoler les cellules aneuploïdes avec caryotypes complexes qui arrêtent leur prolifération. Cette population est appelée cellules ArCK (Arrested avec caryotypes complexes). Figure 1 a montre le schéma de l’expérience. Cellules de hTERT pre-1 vélo de type sauvage sont synchronisés à la frontière de G1/S avec de la thymidine et traitées par un inhibiteur de Mps1 d’induire les mauvaise ségrégation des chromosomes. La nocodazole poison du fuseau est ajouté aux cellules 72 h après l’induction de mauvaise ségrégation des chromosomes. 12 h après le traitement de la nocodazole, les cellules aneuploïdes qui sont encore capables de proliférer entrez mitose et sont pris au piège dans ce stade du cycle cellulaire en raison de l’interférence avec la polymérisation des microtubules. Ces pris au piège les cellules sont alors faciles à enlever par secousse douce-off. Le processus de shake-off est répétée 3 - 5 fois pour assurer le retrait complet du cyclisme des cellules. Figure 1 b montre les images représentant des cellules RPE-1 à chaque étape du traitement.

ArCK cellules affichent des niveaux accrus d’inhibiteurs de cycle de cellules, telles que p53 p21 et p16 comparée à euploïdes et aneuploïde cyclisme des cellules, comme illustré à la Figure 2 a. En outre, la Figure 2 b montre positif β-galactosidase, coloration dans les cellules ArCK comparativement aux cellules témoins euploïdes, un marqueur bien établi pour la sénescence cellulaire.

Figure 2 : résultats représentatifs utilisant des cellules ArCK. (A) Western blot évaluation niveaux d’inhibiteur de cycle cellulaire euploïdes, aneuploïde cyclisme et cellules ArCK. Les niveaux de p53 et p21 p16 ont été déterminées par l’analyse par western blot. Actine a servi de témoin de chargement. (B) β-galactosidase coloration d’évaluer le niveau de sénescence dans les cellules ArCK. Activité associée à la sénescence β-galactosidase (β-Gal) a été déterminée en cellules euploïdes et ArCK. Balance bar 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Cet arrêt du cycle cellulaire est une caractéristique importante des cellules aneuploïdes avec caryotypes complexes, comme en témoigne l’analyse représentative d’unicellulaires séquençage dans la Figure 3, dans lequel les cellules ArCK affichent plusieurs, chromosome aléatoire des gains et des pertes. Cette constatation est en plein accord avec les précédents rapports¹⁰.

Figure 3 : représentant unicellulaires séquençage des cellules ArCK. Segmentation des parcelles montrant le caryotype de six cellules de ArCK représentatifs. Segmentation diagrammes montrent le nombre de copies de tous les chromosomes de 1 à X par rapport à une référence euploïde sur une échelle de₂ log (wild type RPE-1 est une lignée de cellules diploïdes d’origine féminine). Gains de chromosomes sont surlignés en rouge, pertes chromosomiques en vert. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Cette nouvelle méthode de générer et d’enrichir pour cellules arrêtées avec caryotypes complexes (ArCK) permet l’étude des cellules qui ont plusieurs chromosome des gains ou des pertes et de cesser de diviser. La configuration de la méthode a été conçue pour faciliter l’isolement des cellules ArCK de manière rapide et fiable.

L’étape la plus critique dans ce test est de contrôler rigoureusement la chronologie du traitement médicamenteux et, surtout, l’élimination des cellules aneuploïdes de cyclisme. Pour des résultats optimaux, le moment du traitement de la nocodazole et secouer le décollage est d’une importance particulière pour s’assurer que les cellules cyclisme sont retirés de la plaque alors qu’ils sont toujours arrondis et mitotiques, empêchant la possibilité de la mort cellulaire mitotique ou le glissement en G1, potentiellement créer une population tétraploïde. Il n’est pas recommandé que le timing de shake-off s’écarte de plus de deux heures de l’incubation de la nocodazole recommandée de 12 h.

Les études futures sur ArCK cellules sont susceptibles de faciliter une meilleure compréhension de comment complexe caryotypes affectent la physiologie cellulaire. En particulier, une étude récente a montré que les cellules du système immunitaire sont capables d’interagir avec et clairance immune déclencheur de ArCK cellules¹⁰. La méthode décrite ici constitue un excellent point de départ pour une caractérisation plus poussée des cellules ArCK, y compris la clarification des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la clairance immune dans les cellules non transformées et l’étude de la transformation oncogénique comment peut contourner ce mécanisme de surveillance, une question cruciale dans le champ^14,15.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Thermofisher	11995-073
Thymidine	Sigma Aldrich	T1859
Reversine	Cayman Chemical Company	10004412
Nocodazole	Sigma Aldrich	M1410
Anti-p53 antibody	Santa Cruz	sc-126
Anti-p21 antibody	Santa Cruz	sc-6246
Anti-p16 antibody	BD	554079
Senescence b-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit	R&D Systems	ARY005B