Geração e isolamento de células de ciclo celular-preso com cariótipos complexos

Resumo

Aneuploidia leva à instabilidade do genoma, que eventualmente produz células de ciclo celular-preso com cariótipos complexos. Este artigo fornece um método simples e conveniente para isolar células aneuploid com cariótipos complexos que deixam de dividir.

Resumo

Segregação de mis cromossomo leva à aneuploidia, uma condição na qual células abrigam um número de cromossomas desequilibrado. Várias linhas de evidência indicam fortemente que aneuploidia provoca instabilidade do genoma, em última análise, gerando células com cariótipos complexos que prendam sua proliferação. Isolamento e caracterização de células abrigando cariótipos complexos são cruciais para estudar o impacto de um número de cromossomas desequilibrado na fisiologia celular. Até à data, não há métodos foram criados para isolar confiantemente tais células aneuploid. Este documento fornece um protocolo para o enriquecimento e a análise de células aneuploid com cariótipos complexos utilizando técnicas de cultura de tecidos de padrão, barato. Este protocolo pode ser usado para analisar várias características de células aneuploid com cariótipos complexos, incluindo seu fenótipo de secretora associada a senescência induzido, Propriedades pró-inflamatórias e capacidade de interagir com células do sistema imunológico. Porque as células cancerosas muitas vezes abrigam desequilíbrios no número de cromossomas, é crucial decifrar como aneuploidia impacta fisiologia celular em células normais, com o objetivo de desvendar os seus pro e anti tumorigenic efeitos.

Introdução

Erros no processo de segregação do cromossomo levam a aneuploidia, uma condição caracterizada por um número de cromossomos que não é um múltiplo do haploide^1,2,3,4. Cariótipos aneuploid stress de replicação de gatilho que gera ainda mais instabilidade genômica^5,6,7,8,9,10, aumenta complexidade de cariótipo e, finalmente, leva a detenção do ciclo celular de uma subpopulação de células¹⁰. O objetivo do método apresentado aqui é gerar e separar tal uma subpopulação de células de ciclismo. Empregando-se técnicas de cultura de tecidos de baixo custo, este protocolo facilita o isolamento e caracterização de células aneuploid ciclo celular-preso com cariótipos complexos. Estas células são denominadas células ArCK (preso com cariótipo complexo) e os seus homólogos de ciclismo euploid como controles.

Este protocolo é o primeiro a ser criado para o efeito e permite o isolamento e um estudo mais aprofundado das linhas ArCK, incluindo, mas não limitado a, sua senescência induzida e o fenótipo secretor associada a senescência (SASP), seus pro-inflamatórios características e sua capacidade de envolver-se com células do sistema imunológico. O método aqui apresentado foi desenvolvido em células humanas sem transformação, imortalizadas, mas ainda não foi testado em linhas de câncer. Algumas células transformadas podem ser insensíveis à detenção do ciclo celular devido à supressão de um ou vários caminhos; Portanto, ainda mais validação deve ser executada em outras linhas de célula.

Protocolo

Condição de cultura

Linhagem de células de RPE-1 hTERT foi cultivada na modificado Eagle suplementado de Dulbecco (Tabela de materiais) com 10% de soro Fetal bovino, 2 mM L-glutamina e 100 U/ml penicilina/estreptomicina. As células foram incubadas a 37 ° C com 5% CO₂ em um ambiente umidificado. O protocolo descrito a seguir foi desenvolvido usando pratos de 10 cm e todos os detalhes técnicos relatados referem-se os pratos. Se usando pratos diferentes, escalar para cima ou para baixo em conformidade.

1. sincronização de células RPE-1

1. Use o recém descongeladas células que não tenham mais de 15 passagens para todos os experimentos. No dia 1, descongelar e dispensar ~2.5 - 5.0 x 10⁵ RPE-1 hTERT células em um prato de cultura de tecido de 10 cm. Adicione 8 mL de meio de cultura padrão e incubar durante uma noite. Determine o número de célula, usando um contador de célula padrão (por exemplo, um hemocytometer).
   Nota: A densidade celular refere-se às condições de crescimento das células RPE-1. Condições de crescimento podem variar entre linhas de célula diferente; Considere-se ajustando-los adequadamente.
2. No dia 2, sincronize pilhas na beira de G1/S por aspiração média de crescimento regular e adicionando meio de 8 mL contendo timidina de 5 mM.
   Nota: Concentração de timidina e duração do tratamento podem variar através das linhas de célula diferente. É aconselhável realizar experiências piloto para determinar as melhores condições para a linha de célula (s) a ser testado.
3. No dia 3, 24 horas após a adição de timidina médio (etapa 1.2), lançamento do bloco de timidina por meio de aspiração e lavagem células três vezes com PBS 1x. Adicionar 8 mL do meio de crescimento regular e retornar as placas para a incubadora.

2. geração de Aneuploid células por interferência com a atividade da quinase mitótica Mps1

1. No dia 3, 6h após o lançamento do bloco de timidina (etapa 1.3; isto é cerca de 3-6h antes que as células entrem na mitose), Aspire o meio, lave uma vez com PBS 1x e substituir com meio contendo 500 nM reversine (inibidor Mps1).
   Nota: As células de RPE-1 digite mitose 9-12 h após timidina wash-out^10,11. No entanto, a cinética do ciclo celular variam entre linhagens celulares diferentes. Portanto, é crucial determinar esses cinética em experiências piloto, realizando análise de ciclo celular por métodos estabelecidos (por exemplo, medindo-se análise de conteúdo através de FACS DNA). Além disso, a concentração ideal de trabalho do inibidor de Mps1 pode variar entre linhas celulares. Experiências anteriores, utilizando células de RPE1 tem sido bem sucedidas usando reversine em uma concentração de trabalho de 500 nM^10,11,12. É aconselhável realizar experiências piloto para determinar a concentração ideal para a linha de celular a ser testado.
2. No dia 4, 12 h após o tratamento de reversine (cerca de 6 h depois de células em mitose), Aspire reversine médio e lavar as células três vezes com PBS 1x. Adicione 8 mL de meio de crescimento regular à placa e retornar as células para a incubadora.

3. remoção de células de ciclismo Aneuploid e enriquecimento da população ArCK

1. No dia 6, cerca de 72 h após células entram a primeira mitose (passo 2.2; isto é cerca de 66 h após reversine wash-out, que corresponde a aproximadamente 2-3 ciclos de célula), Aspire médio, lave uma vez com PBS 1x e substituir com meio contendo 300 nM nocodazole.
   Nota: Trabalho recente mostrou que as células de RPE-1 abrigando cariótipos aneuploid genomically instáveis e prendam sua proliferação sobre ciclos de 2-3 célula após a primeira mitose defeituoso¹⁰. No entanto, esta cinética pode variar entre linhagens celulares diferentes. Portanto, é crucial realizar experiências piloto para determinar o momento adequado para a remoção de células de ciclismo aneuploid.
2. No dia 7, 12 h após o tratamento nocodazole, Aspire médio e adicionar 3 mL de 1X PBS para a placa. Sacudi as células mitóticas tocando o lado da placa. Gire o prato entre cada torneira para permitir até mesmo remoção das células mitóticas.
3. Para assegurar a completa remoção das células mitóticas, repita o processo de agitar-se por várias rodadas (3 - 5 vezes recomendadas), aspiração e adicionar 3 mL de 1X PBS entre cada rodada.
4. Após agitação, delicadamente Aspire qualquer líquido que adere a tampa ou a borda da placa. Brevemente, verificar a placa sob um microscópio com ampliação de 10x. Certifique-se que algumas células mitóticas são observadas. Se mais de cinco células mitóticas são vistas ao abrigo do objectivo X 10, repita mais uma rodada de agitar-se.
   Nota: Células mitóticas apareceriam arredondadas e podem ser parcialmente desconectadas após agitar-se. É crucial assegurar a completa remoção das células mitóticas antes de expor as células para a próxima rodada de tratamento nocodazole. A não observância pode levar à morte celular mitótica e/ou resultar na geração de células tetraploide.
5. Após agitar-off final, lave as células uma vez com 5 mL de 1X PBS. Adicione 8 mL de meio contendo 330 nM nocodazole a placa e incubar durante 12 h.
6. Repeti nocodazole tratamento agitar-ro (passos 3.1-3.5) cada 12h até sem células mitóticas são observadas após a incubação. Geralmente, recomenda-se 4-5 rodadas de tratamento/agitar-se.
   Nota: As informações fornecidas aqui referir-se as células de RPE-1. O número de rodadas de tratamento agitar-ro pode variar entre linhagens celulares diferentes. Para evitar exposição desnecessária e prolongada, a nocodazole é crucial determinar cuidadosamente, em uma experiência piloto, o número de voltas necessárias para remoção eficiente e completa de células de ciclismo aneuploid.
7. Depois de 4-5 rodadas de nocodazole tratamento agitar-ro (passos 3.1-3,6), adicionar 10 mL de meio de crescimento regular e incubar. Permitir que as células descansar por 12-24 h antes do uso futuro de manipulação ou ensaio.
   Nota: Após agitar-off final, as células restantes na placa são ciclo celular preso e, como mostrado recentemente¹⁰, abrigam cariótipos complexos. Estas células são denominadas células ArCK (preso com cariótipo complexo). É aconselhável realizar ensaios em populações de ArCK dentro de uma semana de isolamento.
8. Opcionalmente, para avaliar a percentagem de células presas com cariótipos complexos, recolher e contar as células de cada shake-off usando um contador de célula padrão.

Figura 1: esquemático geral do método usado para gerar e isolar aneuploid células com cariótipo complexo (ArCK) e imagens representativas. (A) esquema de ArCK células protocolo de geração e isolamento. (B) imagens representativas de células de hTERT RPE-1 em cada fase do tratamento. O último painel (esboçado em vermelho) representa as células isoladas de ArCK. Escala da barra 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Caracterização da população de ArCK

1. Confirme o sucesso isolamento da população ArCK realizando ensaios os seguintes.
   1. Bundas beta-galactosidase coloração (o marcador de senescência) usando um comercialmente disponível kit (veja a tabela de materiais).
   2. Medir a secreção de citocinas pró-inflamatórias, tais como CCL2, empregando kits comercialmente disponíveis (ver tabela de materiais).
   3. Confirme o aumento dos níveis do ciclo celular inibidores p53, p21, p16 por Western Blot.
      Nota: Para controlar adequadamente estes ensaios, ArCK populações devem ser comparadas às células de ciclismo euploid e aneuploid. É a primeira passagem baixa, selvagem-tipo RPE-1 hTERT células crescendo exponencialmente. Este último pode ser obtido por indução mis segregação de cromossomos em RPE-1 hTERT e colheita de células 72 h após a primeira mitose aberrante. Para fazer isso, siga o protocolo descrito acima de passo 1.1 colheita de células bem antes do primeiro tratamento de nocodazole (passo 3.1).
2. Realize o sequenciamento de célula única para avaliar o cariótipo das células presos.
   Nota: O sequenciamento de célula única é um método bem estabelecido para determinar alterações cromossômicas e sub cromossômicas em toda uma população celular na única célula nível¹³. Os procedimentos detalhados de como realizar o sequenciamento de célula única podem ser encontrados em outro lugar¹⁰.

Resultados

Este método utiliza um sistema de cultura de tecidos em vitro para isolar células aneuploid com cariótipos complexos que prendam sua proliferação. Esta população é referida como células ArCK (preso com cariótipos complexos). A figura 1A mostra o esquema do experimento. Selvagem-tipo ciclismo RPE-1 hTERT células são sincronizadas na beira de G1/S com timidina e tratadas com um inibidor de Mps1 para induzir a segregação mis cromossomo. O eixo nocodazole veneno é adicionado às células 72 h após a indução da segregação mis cromossomo. 12 h após o tratamento de nocodazole, as células aneuploid que ainda são capazes de proliferar entre mitose e estão presos neste estágio do ciclo celular devido à interferência com a polimerização do microtúbulo. Estas preso células são então facilmente removidas por agitação suave. O processo de agitação é repetido 3 - 5 vezes para assegurar a remoção completa de células de ciclismo. A figura 1B mostra as imagens representativas de células RPE-1 em cada fase do tratamento.

ArCK células exibem aumento dos níveis de inibidores do ciclo celular, como a p21, p53 e p16 em comparação com euploid e aneuploid ciclismo células, como mostrado na Figura 2A. Além disso, a Figura 2B mostra β-galactosidase positivo mancha nas células ArCK em comparação com células de controle euploid, um marcador bem estabelecido para a senescência celular.

Figura 2: resultados representativos, utilizando células de ArCK. (A) Western blot avaliação níveis de inibidor do ciclo celular em células ArCK, aneuploid ciclismo e euploid. Os níveis de p53, p21, p16 e foram determinados por análise ocidental do borrão. Actina serviu como um controle de carregamento. (B) β-galactosidase, manchando a avaliação do nível de senescência em células ArCK. Atividade associada a senescência β-galactosidase (β-Gal) determinou-se em células euploid e células de ArCK. Escala da barra 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Esta detenção do ciclo celular é uma característica proeminente de células aneuploid com cariótipos complexos, como demonstrado pela análise do cariótipo representativo de célula única sequenciamento na Figura 3, em que células de ArCK exibem Múltiplo, cromossomo aleatório de ganhos e perdas. Esta conclusão está em total acordo com anteriores relatórios¹⁰.

Figura 3: sequenciamento de célula única representante de células ArCK. Segmentação parcelas mostrando o cariótipo de seis células de ArCK representativos. Parcelas de segmentação mostram o número de cópia de todos os cromossomos de 1 a X em relação a uma referência euploid em uma escala de₂ log (tipo selvagem RPE-1 é uma linhagem de células diploides de origem feminina). Ganhos do cromossomo são destacados em vermelho, perdas de cromossomo em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este novo método para gerar e enriquecer para células presas com cariótipos complexos (ArCK) permite o estudo de células que possuem vários cromossomo ganhos ou perdas e deixam de dividir. A configuração do método foi projetada para facilitar o isolamento das células ArCK de forma rápida e confiável.

O passo mais crítico neste ensaio é controlar rigorosamente o cronograma de tratamento medicamentoso e, mais importante ainda, a remoção de células de ciclismo aneuploid. Para obter melhores resultados, o tempo do tratamento nocodazole e agitar-off é de particular importância para garantir que as células de ciclismo são removidas da placa enquanto eles ainda são arredondadas e mitótica, impedindo a possibilidade de morte celular mitótica ou derrapagem em G1, potencialmente, criando uma população tetraploide. Não se recomenda que o timing de agitar-se afasta-se mais de duas horas de incubação recomendada 12-h nocodazole.

Futuros estudos sobre ArCK células têm o potencial de facilitar uma compreensão mais profunda de como complexo cariótipos afetam a fisiologia celular. Em particular, um estudo recente demonstrou que as células do sistema imunológico são capazes de interagir com e gatilho imune apuramento de ArCK células¹⁰. O método descrito aqui fornece um excelente ponto de partida para a caracterização adicional das células ArCK, incluindo o esclarecimento dos mecanismos moleculares subjacentes a autorização imune em células sem transformação e o estudo da transformação oncogênica como pode contornar este mecanismo de vigilância, uma questão crucial no campo^14,15.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Thermofisher	11995-073
Thymidine	Sigma Aldrich	T1859
Reversine	Cayman Chemical Company	10004412
Nocodazole	Sigma Aldrich	M1410
Anti-p53 antibody	Santa Cruz	sc-126
Anti-p21 antibody	Santa Cruz	sc-6246
Anti-p16 antibody	BD	554079
Senescence b-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit	R&D Systems	ARY005B