שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

Summary

כתב יד זה מדגים דלדול של ביטוי גנים ב פיתול של המקק הגרמני באמצעות בליעה דרך הפה של זוגיות גדילי RNA במארז ליפוזומים.

Abstract

התערבות ב RNA (RNAi) הוחל באופן נרחב על חשיפת בפונקציות ביולוגיות של גנים רבים, יש כבר וליטוש של המזיק שליטה בכלי הפועלים על ידי הפרעה של ביטוי גנים חיוניים. למרות שיטות שונות, כגון זריקה, האכלה, ההשרייה דווחו על מסירה מוצלחת של זוגיות גדילי RNA (dsRNA), היעילות של RNAi דרך משלוח אוראלי של dsRNA זה משתנה מאוד בין קבוצות חרקים שונים. המקק הגרמני, במיוחד גרמנית, היא רגישה מאוד ההזרקה של dsRNA, כפי שמוצג על ידי מחקרים רבים שפורסמו בעבר. המחקר הנוכחי מתאר שיטה כדי להדגים כי dsRNA אנקפסולציה עם נשאים ליפוזום מספיקה מפגר ההשפלה של dsRNA מאת מיץ פיתול. ראוי לציין, ההזנה רציפה של dsRNA אנקפסולציה באמצעות ליפוזומים משמעותית מפחית את הביטוי טובולין, פיתול, והוביל למוות של מקקים. לסיכום, ניסוח וניצול מיטבי של dsRNA lipoplexes, אשר להגן dsRNA נגד nucleases, יכול להיות שימוש מעשי של RNAi הדברת חרקים בעתיד.

Introduction

RNAi הוכח בתור שיטה יעילה כדי ביטוי גנים תמונות ציפורים באמצעות מנגנון של שביל שתיקה post-transcriptional מופעלות על ידי מולקולות dsRNA פרוקריוטים רבים¹. בעשור האחרון של המחקר, RNAi הפך להיות כלי שימושי כדי ללמוד את הפונקציות של גנים מפיתוח להתנהגות depleting הביטוי של גנים ספציפיים באמצעות הזרקת ו/או האכלה של dsRNA ב taxa שונים של חרקים^2,3. בשל ירידה לפרטים החוסן של אפקט depleting, היישום של RNAi הוא להיות נחשב כיום כאסטרטגיה פוטנציאליים על המזיק בקרת ניהול^4,5. עם זאת, היעילות של RNAi משתנה מאוד בין מיני חרקים, בהתאם של גנים שונים מהווים מטרה ואת שיטות משלוח. גוף גדל והולך של הראיות עולה כי חוסר היציבות של dsRNA, אשר נפגמים בשל ribonucleases, הוא גורם קריטי היעילות המוגבלת של RNAi^5,6. למשל, הרגישות RNAi הנמוכה בסקסטה Manduca יש כבר מוסברת על ידי העובדה dsRNA מעורבב עם hemolymph היה מפורק במהירות בתוך שעה⁷. באופן דומה, הנוכחות של אלקליין nucleases ב פיתול, אשר ביעילות לבזות dsRNA בלע, הוא בחריפות מתואם עם יעילות נמוכה RNAi הזמנות חרקים שונים^8,9,10.

מסירת dsRNA אוראלי הוא מעניין במיוחד עבור היישום של RNAi אסטרטגיה בקרת מזיקים, אבל שיטה מפגר ההשפלה של dsRNA מאת nucleases ב פיתול לא עדיין פותחה, אשר היה פוטנציאל כדי להבטיח אפקטיביות RNAi באמצעות האכלה. עם זאת, בעיית חוסר של RNAi כדי משלוח אוראלי של dsRNA דווחה על-ידי להאכיל כמות גדולה של dsRNA, למשל 50 µg, טוואי המשי, או האכלה ברציפות במשך 8 ימים (8 dsRNA µg סה כ) בהמין המדומה. המקק הגרמני, במיוחד germinica, היא רגישה מאוד RNAi על ידי ההזרקה של dsRNA^11,12,13,14, אך לא מגיבים dsRNA באמצעות האכלה. לאחרונה, לין. et al. (2017) הדגימו כי dsRNA במארז עם תוצאות נושאות ליפוזום RNAi מוצלחת כדי נוקאאוט בביטוי הגן α-טובולין התמותה משמעותי פיתול והקו הדק של תיקן גרמני¹⁵. כמו ההשפלה של dsRNA בפיתול הגורם המגביל של RNAi אוראלי, נושאות ליפוזום לשמש רכב על dsRNA מפני השפלה, אשר זה רלוונטי ברצון ושאר חרקים עם פעילויות נוקלאז חזק בבטן. ראוי לציין, הסיבה לבחירת הכימית תרביות תאים מסוים (ראה טבלה של חומרים) היינו כמו מנשא ליפוזום בפרוטוקול הנוכחי הוא זה נבדק על תרביות תאים קו תא חרקים עם רעילות פחות, על פי הוראות היצרן. לפי ההשוואה של תרביות תאים ליפוזום שונים במערכות Gharavi. ואח (2013) ¹⁶, היעילות של RNA מפריעות קטן transfecting (siRNA) הוא כ זהה בין זה לבין מערכות אחרות זמינים מסחרית אשר שימשו dsRNA מערכות אספקה אחר חרקים^17,18 . יתר על כן, שיטת האכלה שלנו הוא זהיר מספיק כדי להבטיח שהכמות הנכונה של dsRNA בליעתו על ידי כל מקק, כי התוצאות אינן מאושרות ועמיד. לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי לבין תוצאות מדגימים כי השימוש dsRNA lipoplexes משפר את יציבות dsRNA ופותח את הדלת בעיצוב של משלוח אוראלי האסטרטגיה של RNAi, אשר הינה גישה מבטיחה להדברה של עתיד.

Protocol

1. סינתזה והכנה של dsRNA

1. לזהות את האתרים היעד dsRNA באזור 3' לא מתורגם של גנים היעד. DsTub משמש עבור מיקוד הגן α-טובולין (באמבטיה) (מספר גישה GenBank: KX228233), dsEGFP כמו פקד dsRNA שלילי מתוכנן מרצף משופר פלורסצנטיות ירוק חלבון (EGFP; מספר גישה GenBank: LC311024).
2. לבצע הגברה סטנדרטי PCR לסנתז את התבניות dsRNA עם גנים ספציפיים תחל המכיל את רצף יזם T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). ה-PCR הגברה תנאים ומידע פריימר להשתמש הם אלה דיווח מאת לין ואח. (2017) ¹² (ראה טבלה של חומרים).
3. להמשיך עם הכנה dsRNA באמצעות תיעוד T7 קיט (ראה טבלה של חומרים), ההוראות של היצרן.
   הערה: להניב כמות גבוהה dsRNA, לערבב שני בתגובות שפופרת אחת (ב µL 40 סה כ), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
4. להוסיף 2 µL של DNase (ראה טבלה של חומרים) לתוך dsRNA דגימות למשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לתבניות DNA תקציר.
5. להוסיף 200 ריאגנט החילוץ µL (ראה טבלה של חומרים), 40 µL כלורופורם, ואז מערבולת.
6. צנטריפוגה 10 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C, ואז לאסוף את תגובת שיקוע (150 µL) צינור microcentrifuge חדש.
7. לזרז dsRNA ע י הוספת אלכוהול איזופרופיל µL 150 המקננת למשך 15 דקות על קרח.
8. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע.
9. להוסיף 200 µL של האתנול 70% לשטוף dsRNA כדורי. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס.
10. הסר האתנול, חזור על השלבים שטיפת אתנול.
11. להסיר את אתנול וביו -גלולה dsRNA יבש על ידי ריכוז ואקום צנטריפוגלי למשך 3 דקות, ולאחר מכן resuspend dsRNA עם RNase ללא מים.
12. לקבוע את כמות dsRNA מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח (ראה טבלה של חומרים) לפי הוראות היצרן ולהתאים לריכוז הרצוי (לדוגמה, µg/µL 0.25 עבור הכנת dsRNA lipoplexes).
13. אחסן את הדגימות dsRNA ב-20 ° C עד 3 חודשים.

2. הכנת dsRNA Lipoplexes

1. µL 4 מהתרכובת תרביות תאים למהול (ראה טבלה של חומרים) על-ידי הוספת 4 µL של תמיסת גלוקוז 5%. לדלל 4 µL של dsRNA (1 µg) על-ידי הוספת 4 µL של תמיסת גלוקוז 5%.
2. להוסיף את הפתרון ריאגנט ליפוזום מדולל מיד לתוך הפתרון מדולל dsRNA בבת אחת. מערבולת בקצרה כדי לערבב אותם, ואז תקופת דגירה של 15 דקות ב 25 º C.
   הערה: לא מערבבים את הפתרונות בסדר הפוך.
3. Lipoplexes dsRNA מוכנים לשימוש. בתוך שעה של הכנה ושימוש למחוק לאחר 1 שעה.
   הערה: על פי הוראות היצרן, lipoplexes אמור לשמש בהקדם האפשרי.

3. אוסף של אנזימים חוץ-תאית מ Hemolymph ומיץ פיתול

1. מאגר מלוחים חרקים (מניות x 10)
   1. מערבבים את 900 מ"ל מים מזוקקים כפול עם 109.3 g NaCl, 15.7 גרם אשלגן כלורי, 6.3 g CaCl₂ו- 8.3 g MgCl₂·6H₂O.
   2. להתאים את ה-pH את 6.8, ולמלא עד 1,000 מ.
2. אוסף hemolymph
   1. עזים ומתנגד הג'וקים על הקרח עד שהם לא זזים במשך 3 דקות.
   2. החזק את הג'וק עם שתי אצבעות (באגודל ובאצבע) ולאחר תגביר את הצד הבטני של המקק.
   3. השתמש את המספריים ויבתר כדי לחתוך את הקצה של coxa של רגל אחורית.
      הערה: חותכים לצומת המחובר בין coxa לבין תל הירך. הכריתה של החלק השני של coxa היה פחות יעיל כדי לאסוף את hemolymph.
   4. לסחוט את הבטן בעדינות עם האצבע האמצעית, ולאסוף את hemolymph לדמם החתך עם micropipette 10 µL.
   5. מאגר של hemolymph של כמה ג'וקים (5 אנשים) צינור microcentrifuge.
      הערה: שמור את צינורות microcentrifuge על הקרח כדי למנוע melanization. נפח ממוצע של hemolymph המתקבל מקק זכר הוא 2-3 µL.
   6. ספין למטה hemolymph בקצרה עם צנטריפוגה benchtop 10 s.
   7. העברת לנפח הרצוי של hemolymph (כלומר, 10 µL), ערבב את זה עם µL 50 x 1 מאגר מלוחים חרקים.
   8. צנטריפוגה 10 דקות ב g x 1,000 ב 4 ° C עד שיהיו תוצאות hemocytes. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי microcentrifuge.
   9. לכמת את ריכוז חלבון הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח על ידי מדידת A280¹⁵.
   10. התאם כל מדגם יש ריכוז חלבון זהה (6 מ ג/µL של חלבון סה כ).
3. אוסף מיץ פיתול
   1. עזים ומתנגד הג'וקים על קרח. לשדך הג'וקים בצד הגחוני על הצלחת ניתוח קר 1 x מאגר מלוחים חרקים באמצעות סיכות חרקים.
   2. לנתח את הבטן עם פינצטה משובחים. הסר את הבטן כולה (כולל הבטן הקדמי, אמצע, האחוריות) כדי מאכל טריים עם 1 x מאגר מלוחים חרקים.
   3. להסיר את הבטן הקדמי ואת האחוריות, העבר במהירות את פיתול לרכבת התחתית microcentrifuge המכיל 100 µL מאגר מלוחים חרקים.
   4. מאגר של midguts של מקקים 6 באותו צינור ו מערבולת 10 s.
   5. צנטריפוגה 10 דקות ב g x 1,000 ב 4 ° C כדי לסובב את hemocytes ואת הבטן רקמות. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי microcentrifuge.
   6. לכמת את ריכוז חלבון הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח על ידי מדידת A280¹⁵.
   7. התאם כל מדגם יש ריכוז חלבון זהה (6 מ ג/µL של חלבון סה כ).

4. dsRNA Assay השפלה

1. להכין טרי 4 µL של dsRNA עירום או dsRNA lipoplexes (1 µg).
2. מערבבים מיץ dsRNA אנזימים פתרונות עם µL 10 מאגר מלוחים חרקים (בקרה), שחולצו מן hemolymph, או פיתול.
3. להוסיף 2 µL של EGTA (20 מ מ) או מים נטולי RNase כדי להפריד בין דגימות כפקדי עבור עיכוב של אנזים פעילויות.
4. תקופת דגירה של שעה אחת או יותר (6, 12 או 24 שעות) ב 25 º C.
5. להוסיף 200 ריאגנט החילוץ µL ו- 40 µL כלורופורם, ואז מערבולת.
6. צנטריפוגה 10 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C, ואז לאסוף את תגובת שיקוע (150 µL) צינור microcentrifuge חדש.
7. לזרז dsRNA ע י הוספת אלכוהול איזופרופיל µL 150 המקננת למשך 15 דקות על קרח.
8. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע.
9. להוסיף 200 µL של האתנול 70% לשטוף dsRNA כדורי. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס.
10. הסר האתנול, חזור על השלבים שטיפת אתנול.
11. להסיר את אתנול צניפה dsRNA יבש על ידי ריכוז ואקום צנטריפוגלי עבור 3 מינימלית dsRNA Resuspend עם מים ללא RNase µL 10.
12. בדוק את תקינות dsRNA שטופלו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל על 1.5% agarose ג'ל.

5. אוראלי מינהל dsRNA

1. לשמור על ג'וקים בדיאטה ad libitum של מזון יבש (מזון). לשלול אספקת מים המקקים יום אחד לפני dsRNA בליעה ניסויים.
2. החזק מקק על ידי גרירה כנפיו עם המלקחיים גמיש (איור 1, שלב 5).
   הערה: לא אתפוס את חלקי הגופות של ג'וקים.
3. להכין את dsRNA lipoplexes, וכן dsRNA עירום, האכלה, כמתואר בסעיף 2.
   הערה: Lipoplexes dsRNA צריך להיות מוכן טרי לפני האכלה.
4. להאכיל µL 4 של dsRNA lipoplexes או dsRNA עירום (250 ng) עם micropipette.
5. לאט לאט pipet ה-droplet של הפתרון dsRNA לסגור mouthparts של מקקים ולתת את הג'וקים להבלע ה-droplet לחלוטין.
6. ביצוע הניסויים בליעה פעמיים ביום (h 1 לאחר אורות ו- h 1 לפני האורות) עבור 8 ימים או 16 ימים ברציפות.
   הערה: כל המקקים רכשה מים רק באמצעות האכלה ידנית עם dsRNA ריאגנטים פתרון או שליטה (למשלמים חינם נוקלאז, תמיסת גלוקוז, ריאגנט ליפוזום) במהלך הניסויים בליעה.
7. לספק בקבוקי מים המקקים לאחר 16 ימי בליעה של dsRNA ניסויים.

6. להעריך את נוקאאוט

1. בזמן שבחרת נקודות (2, 9, 17 ימים לאחר assay בליעה dsRNA), לאסוף את החרקים dsEGFP - או dsTub-מתייחסים ומנתחים הרקמות שבחרת (למשל, פיתול).
2. לבצע PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). לרביעיית-PCR הגברה התנאים והמידע תחל כפי שדווח על ידי לין ואח. (2017) ¹².
3. להעריך את הבקרה וחרקים שטופלו dsRNA מדי יום כדי לבדוק את התמותה ולהסיר את הג'וקים כי הם כבר לא נעים.

תוצאות

ערכה פשוטה של הפרוטוקול למסירה אוראלי של dsRNA מוצג באיור 1, שבו מוצגים השלבים המפתח עבור הכנת dsRNA lipoplexes.

על מנת לחקור את ההגנות המוקנות על ידי ליפוזום נושאות על השפלה dsRNA במיץ פיתול של גרמנית דרבוזמינותו של ex-vivo שבו ?...

Discussion

פרוטוקול זה מציג שיטה עבור RNAi יעיל באמצעות משלוח אוראלי של dsRNA lipoplexes, הכוללת הגנה מפני עיכול ribonuclease במיץ פיתול המקק הגרמני. כפי שמוצג מחקרים אחרים במינים חרקים שונים, האפקט RNAi המסכן דרך משלוח אוראלי של dsRNA בעיקר מהצהוב מאת ההשפלה של dsRNA^8,9,10. ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent	SignaGen	SL100499	for lipoplexes preparation
Blend Taq plus	TOYOBO	BTQ-201	for PCR
Fast SYBR Green Master Mix	ABI	4385612	for qPCR
FirstChoice RLM-RACE Kit	Invitrogen	AM1700	for 3' UTR identification
MEGAscript T7 Transcription Kit	Invitrogen	AMB13345	for dsRNA synthesis
TURBO DNase	Invitrogen	AM2239	remove DNA template from dsRNA
TRIzol	Invitrogen	15596018	for dsRNA or total RNA extraction
RQ1 RNase-Free Dnase	Promega	M6101	remove DNA template from total RNA
chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	for dsRNA or total RNA extraction
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516	for dsRNA or total RNA extraction
ethanol	Sigma-Aldrich	24102	for dsRNA or total RNA extraction
Diethyl pyrocarbonate, DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	for RNase free water preparation
glucose solution	Sigma-Aldrich	G3285	for lipoplexes preparation
Sodium chloride, NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	insect saline buffer formula
Potassium chloride, KCl	Sigma-Aldrich	P9333	insect saline buffer formula
Calcium chloride, CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016	insect saline buffer formula
Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O	Sigma-Aldrich	M2670	insect saline buffer formula
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	enzyme inhibitor
dissecting scissor	F.S.T.		cockroach dissection
fine tweezers	F.S.T.		cockroach dissection
flexible tweezer	F.S.T.		cockroach holding
pipetman	RAININ	P10	sample preparation
microcentrifuge tube	Axygen	MCT175C, PCR02C	sample preparation
pipette tip	Axygen		sample preparation
vortexter	Digisystem	vm1000	sample preparation
Minispin centrifuge	The Gruffin Group	GMC 206	for liquid spin down
Centrifuge	ALC	PK121R	sample preparation
pH meter	JENCO	6071	for pH adjust
micro-volume spectrophotometer	Quawell	Q3000	nucleic acid quantitative
PCR Thermal cycler	ABI	2720	for template PCR or  dsRNA synthesis incubation
quantitative real-time PCR	ABI	StepOne plus	gene expression quantitative
Centrifugal Vacuum Concentrators	eppendorf	5301	for dsRNA or total RNA extraction
Multipette	eppendorf	xstream	for real-time PCR sample loading
Agarose I	amresco	0710	for nucleic acid electrophoresis
tub gene specfifc forward preimer	tri-I biotech		GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA
tub gene specfifc reverse preimer	tri-I biotech		TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA
dsTub template forward primer	tri-I biotech		TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG
dsTub template reverse primer	tri-I biotech		TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG
dsEGFP template forward preimer	tri-I biotech		TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG
dsEGFP template reverse preimer	tri-I biotech		TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC
tub qPCR forward primer	tri-I biotech		GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC
tub qPCR reverse preimer	tri-I biotech		CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC
ef1 qPCR forward primer	tri-I biotech		CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A
ef1 qPCRreverse preimer	tri-I biotech		CCT GCA GAG GAA GAC GAA G