Utilisation pratique de l’interférence d’ARN : l’administration orale d’ARN Double brin dans Liposome transporteurs pour les blattes

Résumé

Ce manuscrit montre l’épuisement d’expression de gène dans l’intestin moyen de la blatte germanique par ingestion orale de l’ARN double brin encapsulée dans des liposomes.

Résumé

L’interférence ARN (ARNi) a été largement appliqué pour découvrir les fonctions biologiques de nombreux gènes et il a été envisagé comme un outil de contrôle antiparasitaire marche par perturbation de l’expression des gènes essentiels. Bien que différentes méthodes, telles que l’injection, d’alimentation et de trempage, ont été signalés pour la mise en œuvre réussie de l’ARN double brin (dsRNA), l’efficacité de l’ARNi par administration orale de dsRNA est très variable entre les différents groupes d’insectes. La blatte germanique, Blattella germanica, est très sensible à l’injection d’ARNdb, comme en témoignent de nombreuses études publiées précédemment. La présente étude décrit une méthode pour démontrer que dsRNA encapsulé avec des transporteurs de liposome est suffisant pour retarder la dégradation de l’ARNdb par jus de l’intestin moyen. Notamment, l’alimentation continue des dsRNA encapsulé de liposomes significativement réduit l’expression de la tubuline dans l’intestin moyen et a causé la mort de cafards. En conclusion, la formulation et l’utilisation de lipoplexes dsRNA, qui protègent les ARNdb contre nucléases, pourraient être une utilisation pratique de l’ARNi pour le contrôle des insectes nuisibles à l’avenir.

Introduction

Arni a été démontrée comme une méthode efficace pour l’expression des gènes knockdown au moyen d’un mécanisme d’une voie de silencieux post-transcriptionnelle déclenchée par les molécules de dsRNA dans nombreux eucaryotes¹. Ces dix dernières années d’étude, l’ARNi est devenu un outil utile pour étudier les fonctions des gènes du développement au comportement en appauvrissant l’expression de gènes spécifiques par injection et/ou alimentation d’ARNdb dans divers taxons d’insectes^2,3. En raison de la spécificité et la robustesse de l’appauvrissant la couche d’effet, l’application de l’ARNi est actuellement considérée comme une stratégie potentielle de pest control management^4,5. Cependant, l’efficacité de l’ARNi varie considérablement entre les espèces d’insectes, selon les différents gènes ciblés et les méthodes de livraison. Un corps croissant d’évidence suggère que l’instabilité des ARNdb, qui est dégradée par les ribonucléases, est un facteur critique dans l’efficacité limitée des Arni^5,6. Par exemple, la faible sensibilité de l’ARNi dans Manduca sexta a été expliquée par le fait que l’ARNdb mélangé à l’hémolymphe était rapidement dégradé dans 1 heure⁷. De même, la présence des nucléases alcalines dans l’intestin moyen, qui efficacement dégrader dsRNA ingéré, est fortement corrélée à faible efficacité de RNAi dans des ordres différents insectes^8,9,10.

L’administration orale de dsRNA est particulièrement intéressante pour l’application de l’ARNi dans une stratégie de lutte antiparasitaire, mais une méthode pour retarder la dégradation de l’ARNdb par les nucléases dans l’intestin n'a pas encore été développée, qui aurait le potentiel d’assurer efficacement ARNi en se nourrissant. Toutefois, le problème de blocage de l’ARNi pour administration orale de dsRNA a été signalé par la grande quantité de dsRNA, par exemple 50 µg du Bombyx mori, d’alimentation ou d’alimentation sans interruption pendant 8 jours (8 µg dsRNA au total) chez les espèces de criquets. La blatte germanique, Blatella germinica, est très sensible aux Arni par l’injection d’ARNdb^11,12,13,14, mais ne répondre pas aux ARNdb en se nourrissant. Récemment, Lin et al. (2017) ont démontré que dsRNA encapsulés avec résultats porteurs liposome dans RNAi réussie à knockdown l’expression du gène α-tubuline dans l’intestin moyen et déclencher une mortalité significative de la blatte germanique¹⁵. Comme la dégradation des ARNdb dans l’intestin moyen est le facteur limitant pour RNAi orale, les transporteurs de liposome servent de véhicule pour protéger dsRNA de dégradation, qui est facilement applicable chez d’autres insectes avec activités nucléase forte dans le tube digestif. À noter, la raison d’avoir choisi le réactif de transfection particulière (voir Table des matières), nous avons utilisé comme transporteur de liposome dans le protocole actuel, c’est qu’il a été testé pour la transfection de cellules insectes ligne avec moins de toxicité, conformément à la instructions du fabricant. D’après la comparaison des systèmes de transfection différentes liposome Gharavi et al. (2013) ¹⁶, l’efficacité de transfection des petits ARN interférents (siARN) est approximativement la même entre ceci et d’autres systèmes disponibles dans le commerce qui ont été utilisés pour les systèmes de livraison de dsRNA dans autres insectes^17,18 . De plus, notre méthode d’alimentation est assez prudent afin d’assurer une quantité suffisante de dsRNA est ingérée par chaque cafard, et que les résultats sont robustes et confirmés. En résumé, le présent protocole et les résultats démontrent qu’à l’aide de dsRNA lipoplexes améliore la stabilité de l’ARNdb et ouvre la voie à la conception de l’administration orale de stratégie de l’ARNi, qui est une approche prometteuse pour la lutte contre les ravageurs à l’avenir.

Protocole

1. synthèse et préparation d’ARNdb

1. Identifier les sites dsRNA de cibles dans la région non traduite en 3' des gènes cibles. Le dsTub est utilisé pour cibler le gène α-tubuline (tub) (numéro de GenBank accession : KX228233), et dsEGFP comme un contrôle négatif dsRNA est conçu à partir de la séquence d’une protéine de fluorescence verte (EGFP ; Numéro d’accession GenBank : LC311024).
2. Effectuer l’amplification par PCR standard pour synthétiser les modèles dsRNA avec des amorces de gène-spécifique contenant la séquence du promoteur T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). Les conditions d’amplification PCR et les informations d’apprêt utilisé sont celles rapportées par Lin et al. (2017) ¹² (voir Table des matières).
3. Procéder à la préparation de dsRNA utilisant une Transcription T7 Kit (voir Table des matières), suivant les instructions du fabricant.
   Remarque : Pour obtenir la quantité élevée de dsRNA, mélanger deux réactions dans un tube (au total 40 µL) et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
4. Ajouter 2 µL de DNase (voir Table des matières) dans des échantillons de dsRNA pendant 15 min à 37 ° C à digérer l’ADN modèles.
5. Ajouter 200 µL de réactif d’extraction (voir Table des matières) et chloroforme 40 µL, puis vortexer.
6. Centrifuger pendant 10 min à 13 000 x g à 4 ° C, puis recueillir le surnageant (150 µL) dans un nouveau tube de microcentrifuge.
7. Précipiter les ARNdb en ajoutant 150 µL isopropanol et incuber pendant 15 minutes sur la glace.
8. Centrifuger à 13 000 x g à 4 ° C pendant 15 minutes, puis enlever le surnageant.
9. Ajouter 200 µL de l’éthanol à 70 % à laver dsRNA granulés. Centrifugation pendant 10 min à 13 000 x g à 4 ° C.
10. Enlever l’éthanol et répéter les étapes de lavage de l’éthanol.
11. Supprimer l’éthanol et les granulés secs dsRNA par centrifuges concentrateurs sous vide pendant 3 min, puis remettre en suspension les ARNdb eau exempte de RNase.
12. Déterminer la quantité de l’ARNdb purifiée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis de micro-volume (voir Table des matières) selon les instructions du fabricant et de s’adapter à la concentration désirée (par exemple, 0,25 µg/µL pour la préparation de dsRNA lipoplexes).
13. Stocker les échantillons de dsRNA à-20 ° C pendant 3 mois.

2. préparation d’ARNdb Lipoplexes

1. Diluer 4 µL de réactif de la transfection (voir Table des matières) en ajoutant 4 µL de solution de glucose à 5 %. Diluer 4 µL de l’ARNdb (1 µg) en ajoutant 4 µL de solution de glucose à 5 %.
2. Ajouter la solution de réactif dilué liposome immédiatement dans la solution diluée de dsRNA tout à la fois. Vortex brièvement pour mélanger, puis incuber pendant 15 min à 25 ° C.
   Remarque : Ne pas mélanger les solutions dans l’ordre inverse.
3. Les lipoplexes ARNdb sont prêts à l’emploi. Utiliser dans 1 heure de préparation et mettre au rebut après 1 heure.
   Remarque : Selon les instructions du fabricant, les lipoplexes doit être utilisé dès que possible.

3. perception des Enzymes extracellulaires de l’hémolymphe et Midgut jus

1. Insecte tampon salin (stock de x 10)
   1. Mélanger 900 mL eau bidistillée à 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g de CaCl₂et 8,3 g MgCl₂·6H₂O.
   2. Ajuster le pH à 6,8 et compléter à 1 000 mL.
2. Collection de l’hémolymphe
   1. Anesthésier les cafards sur la glace jusqu'à ce qu’ils ne bougent pas pendant 3 min.
   2. Maintenez la blatte avec deux doigts (pouce et index) et augmentez la face ventrale de la blatte.
   3. Le ciseaux de dissection permet de couper l’extrémité d’une coxa d’une patte arrière.
      Remarque : Couper l’intersection connectée entre la coxa et trochanter. L’excision de l’autre partie de coxa était moins efficace pour collecter l’hémolymphe.
   4. Presser l’abdomen doucement avec le doigt du milieu et recueillir l’hémolymphe des saignements de l’incision avec une micropipette 10 µL.
   5. Piscine de l’hémolymphe de plusieurs cafards (5 personnes) dans un tube de microcentrifuge.
      Remarque : Garder les tubes de microcentrifuge sur glace pour empêcher la mélanisation. Le volume moyen de l’hémolymphe provenant d’un cafard masculin est 2-3 µL.
   6. Tournez en bas l’hémolymphe brièvement avec une centrifugeuse de paillasse pendant 10 s.
   7. Transférer le volume souhaité de l’hémolymphe (c.-à-d., 10 µL) et le mélanger avec 50 µL de tampon saline au x insectes 1.
   8. Centrifuger pendant 10 min à 1 000 x g à 4 ° C, pour filer vers le bas hémocytes. Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifuge propre.
   9. Quantifier la concentration de protéines totales à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis de micro-volume en mesurant A280¹⁵.
   10. Ajuster chaque échantillon pour avoir la même concentration de protéine (6 µL/mg de protéine totale).
3. Collection de jus strié
   1. Anesthésier les cafards sur la glace. Fixer les cafards face ventrale vers le haut sur la plaque de dissection avec tampon saline au insectes froid 1 x à l’aide d’épingles à insectes.
   2. Disséquer l’abdomen avec des pinces fines. Enlever l’intestin entier (y compris l’intestin avant, milieu et arrière) pour un plat frais avec 1 x tampon saline insecte.
   3. Enlever l’intestin avant et arrière et transférer rapidement l’intestin moyen dans un tube de microcentrifuge qui contient 100 µL de tampon saline insectes.
   4. La piscine de l’intestin moyen de six cafards dans le même tube et vortexer pendant 10 s.
   5. Centrifuger pendant 10 min à 1 000 x g à 4 ° C, pour filer vers le bas les hémocytes et les tissus de l’intestin. Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifuge propre.
   6. Quantifier la concentration de protéines totales à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis de micro-volume en mesurant A280¹⁵.
   7. Ajuster chaque échantillon pour avoir la même concentration de protéine (6 µL/mg de protéine totale).

4. dsRNA dégradation Assay

1. Fraîchement préparer 4 µL de l’ARNdb nu ou dsRNA lipoplexes (1 µg).
2. Mélanger dsRNA enzymes de solutions avec 10 µL de tampon saline insecte (contrôle), extraites de l’hémolymphe, ou de l’intestin moyen le jus.
3. Ajouter 2 µL de EGTA (20 mM) ou de l’eau exempte de RNase pour séparer les échantillons sous forme de contrôles pour l’inhibition de l’activité enzymatique.
4. Incuber pendant 1 heure ou plus long (6, 12 ou 24 heures) à 25 ° C.
5. Ajouter 200 µL de réactif d’extraction et de 40 µL chloroforme, puis vortexer.
6. Centrifuger pendant 10 min à 13 000 x g à 4 ° C, puis recueillir le surnageant (150 µL) dans un nouveau tube de microcentrifuge.
7. Précipiter les ARNdb en ajoutant 150 µL isopropanol et incuber pendant 15 minutes sur la glace.
8. Centrifuger à 13 000 x g à 4 ° C pendant 15 minutes, puis enlever le surnageant.
9. Ajouter 200 µL de l’éthanol à 70 % à laver dsRNA granulés. Centrifugation pendant 10 min à 13 000 x g à 4 ° C.
10. Enlever l’éthanol et répéter les étapes de lavage de l’éthanol.
11. Supprimer l’éthanol et les granulés secs dsRNA par centrifuges concentrateurs sous vide pour 3 min. remettre dsRNA avec de l’eau exempte de RNase 10 µL.
12. Vérifier l’intégrité des traités dsRNA par électrophorèse sur un gel d’agarose de 1,5 %.

5. orale d’ARNdb

1. Maintenir les cafards sur une alimentation ad libitum de nourriture sèche (dog ChowMD). Priver d’eau les blattes un jour avant les expériences de dsRNA ingestion.
2. Tenez un cafard en saisissant ses ailes avec la pince flexible (Figure 1, échelon 5).
   Remarque : Ne prenez pas les parties du corps de cafards.
3. Préparer les lipoplexes dsRNA, ainsi que dsRNA nu, destinés à l’alimentation, tel que décrit à l’article 2.
   Remarque : Les lipoplexes dsRNA devrait être fraîchement préparées avant la tétée.
4. 4 µL d’ARNdb lipoplexes ou dsRNA nu d’alimentation (250 ng) avec une micropipette.
5. Lentement pipette la goutte de la solution de dsRNA à proximité les pièces buccales de cafards et laissez les cafards ingèrent la gouttelette complètement.
6. Réaliser les expériences de l’ingestion deux fois par jour (1 h après s’allume et 1 h avant les lumières) pour 8 jours ou 16 jours en continu.
   Remarque : Tous les cancrelats acquis l’eau que par le biais d’une alimentation manuelle avec dsRNA réactifs de solution ou de contrôle (par exemple, eau gratuite nucléase, solution de glucose et réactif aux liposomes) au cours d’expériences de l’ingestion.
7. Fournir des bouteilles d’eau pour les cafards après 16 jours d’ingestion d’ARNdb expériences.

6. évaluer le Knockdown

1. Au moment choisi points (2, 9 et 17 jours après l’essai d’ingestion de dsRNA), collecter les insectes traités dsEGFP et dsTub et disséquer les tissus choisis (par exemple, de l’intestin moyen).
2. Effectuer une PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR). Les qRT-PCR amplification conditions et les informations d’apprêt tel que rapporté par Lin et coll.. (2017) ¹².
3. Évaluer le contrôle et les insectes de dsRNA-traités quotidiennement pour vérifier la mortalité et supprimer les cafards qui ne sont plus mobiles.

Résultats

Un schéma simplifié du protocole pour l’administration orale de dsRNA est présenté dans la Figure 1, où figurent les principales étapes pour la préparation de dsRNA lipoplexes.

Afin d’étudier la protection accordée par les transporteurs aux liposomes à la dégradation de l’ARNdb dans le jus de l’intestin moyen de b. germanica, un test ex vivo où dsTub lipoplexes ...

Discussion

Ce protocole présente une méthode pour RNAi efficace par administration orale de dsRNA lipoplexes, impliquant la protection contre la digestion de la ribonucléase dans le jus de l’intestin moyen de la blatte germanique. Comme indiqué dans d’autres études dans diverses espèces d’insectes, l’effet de RNAi pauvre par administration orale de dsRNA est principalement expliquée par la dégradation de l’ARNdb^8,9,10. Ce...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent	SignaGen	SL100499	for lipoplexes preparation
Blend Taq plus	TOYOBO	BTQ-201	for PCR
Fast SYBR Green Master Mix	ABI	4385612	for qPCR
FirstChoice RLM-RACE Kit	Invitrogen	AM1700	for 3' UTR identification
MEGAscript T7 Transcription Kit	Invitrogen	AMB13345	for dsRNA synthesis
TURBO DNase	Invitrogen	AM2239	remove DNA template from dsRNA
TRIzol	Invitrogen	15596018	for dsRNA or total RNA extraction
RQ1 RNase-Free Dnase	Promega	M6101	remove DNA template from total RNA
chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	for dsRNA or total RNA extraction
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516	for dsRNA or total RNA extraction
ethanol	Sigma-Aldrich	24102	for dsRNA or total RNA extraction
Diethyl pyrocarbonate, DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	for RNase free water preparation
glucose solution	Sigma-Aldrich	G3285	for lipoplexes preparation
Sodium chloride, NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	insect saline buffer formula
Potassium chloride, KCl	Sigma-Aldrich	P9333	insect saline buffer formula
Calcium chloride, CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016	insect saline buffer formula
Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O	Sigma-Aldrich	M2670	insect saline buffer formula
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	enzyme inhibitor
dissecting scissor	F.S.T.		cockroach dissection
fine tweezers	F.S.T.		cockroach dissection
flexible tweezer	F.S.T.		cockroach holding
pipetman	RAININ	P10	sample preparation
microcentrifuge tube	Axygen	MCT175C, PCR02C	sample preparation
pipette tip	Axygen		sample preparation
vortexter	Digisystem	vm1000	sample preparation
Minispin centrifuge	The Gruffin Group	GMC 206	for liquid spin down
Centrifuge	ALC	PK121R	sample preparation
pH meter	JENCO	6071	for pH adjust
micro-volume spectrophotometer	Quawell	Q3000	nucleic acid quantitative
PCR Thermal cycler	ABI	2720	for template PCR or  dsRNA synthesis incubation
quantitative real-time PCR	ABI	StepOne plus	gene expression quantitative
Centrifugal Vacuum Concentrators	eppendorf	5301	for dsRNA or total RNA extraction
Multipette	eppendorf	xstream	for real-time PCR sample loading
Agarose I	amresco	0710	for nucleic acid electrophoresis
tub gene specfifc forward preimer	tri-I biotech		GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA
tub gene specfifc reverse preimer	tri-I biotech		TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA
dsTub template forward primer	tri-I biotech		TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG
dsTub template reverse primer	tri-I biotech		TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG
dsEGFP template forward preimer	tri-I biotech		TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG
dsEGFP template reverse preimer	tri-I biotech		TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC
tub qPCR forward primer	tri-I biotech		GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC
tub qPCR reverse preimer	tri-I biotech		CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC
ef1 qPCR forward primer	tri-I biotech		CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A
ef1 qPCRreverse preimer	tri-I biotech		CCT GCA GAG GAA GAC GAA G