Praktische Anwendung der RNA-Interferenz: mündliche Lieferung von Double-Stranded RNA in Liposomen Träger für Schaben

Zusammenfassung

Diese Handschrift zeigt die Erschöpfung der Gen-Expression in den Mitteldarm der deutschen Schabe durch orale Einnahme von doppelsträngige RNA in Liposomen verkapselt.

Zusammenfassung

RNA-Interferenz (RNAi) hat für die Aufdeckung der biologischen Funktionen von zahlreichen Genen weit angewendet worden und hat als eine Pest Control Tool betriebliche durch Störung der wesentlichen Genexpression vorgesehen. Obwohl verschiedene Methoden, wie Injektion, füttern und Tränken, für die erfolgreiche Durchführung der doppelsträngige RNA (DsRNA) gemeldet worden sind, ist die Effizienz der RNAi durch mündliche Lieferung von DsRNA hochvariablen unter verschiedenen Insektengruppen. Die Deutsche Schabe, Blattella Germanica, ist sehr empfindlich auf die Injektion von DsRNA, wie von vielen bisher veröffentlichten Studien gezeigt. Die vorliegende Studie beschreibt eine Methode, um nachzuweisen, dass die DsRNA gekapselt mit Liposomen Träger ausreichen, um den Abbau von DsRNA Mitteldarm Fruchtsaft zu verzögern. Vor allem die kontinuierliche Beschickung der DsRNA deutlich von Liposomen verkapselt reduziert den Tubulin-Ausdruck in den Mitteldarm und führte zum Tod von Kakerlaken. Abschließend könnte die Formulierung und Verwendung von DsRNA Lipoplexes, die DsRNA gegen Nukleasen zu schützen, eine praktische Anwendung der RNAi für Schädlingsbekämpfung in der Zukunft.

Einleitung

RNAi ist durch einen Mechanismus eines Posttranskriptionale stummschaltungs-Signalwegs, ausgelöst durch DsRNA Moleküle in viele Eukaryonten¹als eine wirksame Methode, Knockdown Genexpression nachgewiesen. Im letzten Jahrzehnt Studie geworden RNAi ein nützliches Werkzeug, um die Funktionen von Genen aus Entwicklung, Verhalten zu studieren, durch Abbau der Expression bestimmter Gene mittels Injektion und/oder Fütterung von DsRNA in verschiedenen Taxa Insekten^2,3. Aufgrund der Spezifität und Robustheit der abbauende Wirkung ist die Anwendung der RNAi derzeit als mögliche Strategie zur Pest Control Management^4,5geprüft. Jedoch sehr unterschiedlich die Effizienz der RNAi Insektenarten, je nach den verschiedenen Genen angestrebt und die Versandmethoden. Eine wachsende Zahl von beweisen deutet darauf hin, dass die Instabilität der DsRNA, die durch Ribonuclease abgebaut wird, ein kritischer Faktor bei der begrenzten Wirksamkeit von RNAi^{5,6 ist}. Zum Beispiel hat die geringe Sensitivität der RNAi in Manduca Sexta durch die Tatsache erklärt worden, dass die DsRNA gemischt mit Hämolymphe innerhalb von 1 Stunde⁷schnell abgebaut wurde. Ebenso ist die Anwesenheit von Alkali Nukleasen in den Mitteldarm die aufgenommenen DsRNA effizient zu degradieren, stark korreliert mit geringe RNAi-Effizienz in verschiedenen Insektenordnungen^8,9,10.

Die mündlichen Lieferung von DsRNA ist besonders interessant für die Anwendung der RNAi in einer Pest Control-Strategie, sondern eine Methode, um den Abbau von DsRNA durch Nukleasen in den Mitteldarm verzögern nicht noch entwickelt wurde, die hätten des Potenzials, wirksam sichern RNAi durch Fütterung. Jedoch wurde die Teilnahmslosigkeit der RNAi mündlichen Lieferung von DsRNA berichtet, durch große Menge an DsRNA, z. B. 50 µg in Bombyx Mori, Fütterung oder kontinuierlich füttern für 8 Tage (8 µg DsRNA insgesamt) in der Locust-Spezies. Die Deutsche Schabe, Blattella Germinica, reagiert sehr empfindlich auf RNAi durch die Injektion von DsRNA^11,12,13,14, aber ist nicht ansprechend auf DsRNA durch Fütterung. Vor kurzem, Lin Et al. (2017) haben gezeigt, dass die DsRNA mit Liposomen Träger führt zu erfolgreichen RNAi, Zuschlag die α-Tubulin -gen-Expression in den Mitteldarm und Trigger erhebliche Mortalität der deutschen Schabe¹⁵gekapselt. Wie der Abbau von DsRNA in den Mitteldarm der limitierende Faktor für mündliche RNAi ist, dienen die Liposomen-Träger als Vehikel DsRNA vor Erniedrigung, zu schützen, die bei anderen Insekten mit starken Nuklease Aktivitäten im Darm leicht anwendbar ist. Der Hinweis, der Grund für die Wahl des bestimmten Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) wir verwendet wie Liposomen Träger in das aktuelle Protokoll ist, dass es für Insekten Zelle Zeile Transfektion mit weniger Toxizität getestet wurde nach dem Anweisungen des Herstellers. Nach dem Vergleich der verschiedenen Liposom Transfection Systeme in Gharavi Et al. (2013) ¹⁶, ist die Effizienz der transfecting kleine interferierende RNA (SiRNA) ungefähr gleich zwischen diesem und anderen handelsüblichen Systemen, die für DsRNA-Delivery-Systeme in anderen Insekten^{17,18 verwendet wurden} . Darüber hinaus ist unsere Fütterung Methode vorsichtig genug, um die richtige Menge an DsRNA von jeder Schabe eingenommen wird, und dass die Ergebnisse sind robust und bestätigten zu gewährleisten. Zusammenfassend lässt sich sagen zeigen die dieses Protokolls und die Ergebnisse, dass mit DsRNA Lipoplexes DsRNA Stabilität verbessert und die Tür für das Design der Strategie mündlichen Lieferung von RNAi öffnet, die ist ein vielversprechender Ansatz zur Schädlingsbekämpfung in der Zukunft.

Protokoll

(1) Synthese und Vorbereitung der dsRNA

1. DsRNA-Ziel-Sites in der 3' untranslatierten Region der Zielgene zu identifizieren. Die DsTub dient zur Ausrichtung auf das α-Tubulin (Wanne) Gen (GenBank Zbl-Nummer: KX228233), und DsEGFP wie ein negativer DsRNA-Steuerelement aus der Abfolge von konzipiert ist grüne Fluoreszenz-Protein (EGFP; GenBank Zbl-Nummer: LC311024).
2. Führen Sie standard PCR Verstärkung um die DsRNA-Vorlagen mit Gen-spezifische Primer, enthält die T7 promotorsequenz synthetisieren (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 "). Die PCR-Amplifikation Zustände und Primer-Informationen verwendet sind die gemeldeten Lin Et Al. (2017) ¹² (siehe Tabelle der Materialien).
3. Fahren Sie mit DsRNA Vorbereitung mit einer T7 Transkription Kit (siehe Tabelle der Materialien), nach den Anweisungen des Herstellers.
   Hinweis: Hohe Quantität DsRNA, mischen zwei Reaktionen in einem Rohr (in insgesamt 40 µL), und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
4. Fügen Sie 2 µL DNase (siehe Tabelle der Materialien) in DsRNA Proben für 15 min bei 37 ° C zu verdauen DNA-Vorlagen.
5. Fügen Sie 200 µL Extraktion Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) und 40 µL Chloroform, dann Wirbel.
6. Zentrifugieren Sie für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C, dann sammeln Sie überstand (150 µL) in einem neuen Microcentrifuge Schlauch.
7. Überstürzen Sie DsRNA durch Hinzufügen von 150 µL Isopropanol und Inkubation für 15 min auf Eis.
8. Für 15 min bei 13.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert, dann entfernen Sie überstand.
9. Fügen Sie 200 µL 70 % Ethanol DsRNA Pellets zu waschen. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.
10. Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie die Schritte Ethanol waschen.
11. Entfernen Sie das Ethanol und trockenen DsRNA Pellet durch zentrifugale Vakuum-Konzentratoren für 3 min, dann Aufschwemmen Sie DsRNA mit RNase-freies Wasser.
12. Bestimmen Sie die Menge der gereinigten DsRNA mit einem Mikro-Volume UV-Vis Spektralphotometer (siehe Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers und Anpassung an die gewünschte Konzentration (z.B., 0,25 µg/µL für Zubereitung von DsRNA Lipoplexes).
13. Speichern Sie die DsRNA Proben bei-20 ° C für bis zu 3 Monaten.

2. Vorbereitung des DsRNA Lipoplexes

1. Verdünnen Sie 4 µL des Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) durch Zugabe von 4 µL 5 % Glukoselösung verdünnt werden. Verdünnen Sie 4 µL DsRNA (1 µg) durch Zugabe von 4 µL 5 % Glukoselösung.
2. Hinzufügen der verdünnten Liposomen Reagenzlösung unmittelbar in die verdünnte DsRNA-Lösung auf einmal. Vortex kurz zu vermischen, dann 15 Minuten bei 25 ° c inkubieren
   Hinweis: Verwechseln Sie nicht die Lösungen in umgekehrter Reihenfolge.
3. DsRNA Lipoplexes sind einsatzbereit. Innerhalb von 1 Stunde Vorbereitung, und verwerfen nach 1 Stunde.
   Hinweis: Nach den Anweisungen des Herstellers sollte so bald wie möglich den Lipoplexes verwendet werden.

3. Sammlung von extrazellulären Enzyme vom Hämolymphe und Mitteldarm Saft

1. Insekt-saline-Puffer (10 X verfügbar)
   1. Mischen Sie 900 mL mit 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl und 6,3 g CaCl₂8,3 g MgCl₂·6H₂O. Doppeltes destilliertes Wasser
   2. Passen Sie pH-Wert auf 6,8 an, und füllen Sie bis zu 1.000 mL.
2. Hämolymphe Sammlung
   1. Betäuben Sie die Kakerlaken auf Eis, bis sie sich 3 Minuten lang nicht bewegen.
   2. Halten Sie die Schabe mit zwei Fingern (Daumen und Zeigefinger) und auftauchen Sie der Bauchseite die Schabe.
   3. Verwenden Sie die sezierenden Scheren aus der Spitze von einer Coxa ein Hinterbein abgeschnitten.
      Hinweis: Schneiden Sie die angeschlossenen Schnittpunkt zwischen Coxa und Trochanter. Die Exzision des anderen Teils Coxa war weniger effizient, Hämolymphe zu sammeln.
   4. Drücken Sie den Bauch sanft mit Mittelfinger und sammeln Sie die Hämolymphe Blutungen aus der Schnitt mit einer 10 µL Mikropipette.
   5. Die Hämolymphe aus mehreren Kakerlaken (5 Personen) in einem Microcentrifuge Schlauch zu bündeln.
      Hinweis: Halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, Melanization zu verhindern. Das durchschnittliche Volumen der Hämolymphe erhalten von einem männlichen Schabe ist ca. 2-3 µL.
   6. Spin-down der Hämolymphe kurz mit einem Benchtop-Zentrifuge für 10 s.
   7. Übertragen Sie gewünschte Lautstärke der Hämolymphe (d.h. 10 µL) zu, und mischen Sie es mit 50 µL 1 X Insekt saline Puffer.
   8. Zentrifuge für 10 min bei 1.000 x g bei 4 ° C, unten Hemocytes zu spinnen. Übertragen Sie den überstand auf eine saubere Microcentrifuge Schlauch.
   9. Die Gesamt-Protein-Konzentration mit einer Mikro-Lautstärke UV-Vis Spektralphotometer durch Messung A280¹⁵zu quantifizieren.
   10. Passen Sie jede Probe um die gleiche Protein Konzentration (6 mg/µL Gesamt-Protein).
3. Mitteldarm Saft Sammlung
   1. Die Kakerlaken auf dem Eis zu betäuben. Repariere die Kakerlaken Bauchseite auf der Dissektion Platte mit kalten 1 X Insekt saline Puffer mit Insekt Pins.
   2. Zerlegen Sie den Bauch mit einer feinen Pinzette. Gesamte Darm (einschließlich des vorderen Mitte und Hinterbeinen Darms) auf einen frischen Teller mit 1 x Insekt saline Puffer zu entfernen.
   3. Entfernen Sie den vorderen und hinteren Darm und schnelle Übertragung der Mitteldarm zu einem Microcentrifuge Schlauch, der 100 µL Insekt saline Puffer enthält.
   4. Bündeln Sie die Midguts von sechs Kakerlaken im gleichen Rohr und Wirbel für 10 s.
   5. Zentrifuge für 10 min bei 1.000 x g bei 4 ° C, die Hemocytes und Darm Gewebe zu spinnen. Übertragen Sie den überstand auf eine saubere Microcentrifuge Schlauch.
   6. Die Gesamt-Protein-Konzentration mit einer Mikro-Lautstärke UV-Vis Spektralphotometer durch Messung A280¹⁵zu quantifizieren.
   7. Passen Sie jede Probe um die gleiche Protein Konzentration (6 mg/µL Gesamt-Protein).

4. DsRNA Abbau Assay

1. Frisch bereiten Sie 4 µL des nackten DsRNA oder DsRNA Lipoplexes (1 µg zu).
2. Mischen Sie DsRNA Lösungen mit 10 µL Insekt saline Puffer (Kontrolle), extrahiert Enzyme vom Hämolymphe oder Mitteldarm Saft.
3. Fügen Sie 2 µL RNase-freies Wasser oder EGTA (20 mM), Proben als Steuerelemente für die Hemmung der Enzym-Aktivitäten zu trennen.
4. 1 Stunde oder länger (6, 12 oder 24-Stunden) bei 25 ° c inkubieren
5. Fügen Sie 200 µL Extraktion Reagenz und 40 µL Chloroform, dann Wirbel.
6. Zentrifugieren Sie für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C, dann sammeln Sie überstand (150 µL) in einem neuen Microcentrifuge Schlauch.
7. Überstürzen Sie DsRNA durch Hinzufügen von 150 µL Isopropanol und Inkubation für 15 min auf Eis.
8. Für 15 min bei 13.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert, dann entfernen Sie überstand.
9. Fügen Sie 200 µL 70 % Ethanol DsRNA Pellets zu waschen. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.
10. Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie die Schritte Ethanol waschen.
11. Ethanol und trockenen DsRNA Pellet durch zentrifugale Vakuum-Konzentratoren für 3 min. Aufschwemmen DsRNA mit 10 µL RNase-freies Wasser zu entfernen.
12. Überprüfen Sie die Integrität der behandelten DsRNA per Gelelektrophorese auf einem 1,5 % Agarose-Gel.

(5) die orale Verabreichung von dsRNA

1. Kakerlaken auf eine Ad Libitum Ernährung Trockenfutter (Hund Chow) zu erhalten. Wasserversorgung von den Kakerlaken DsRNA Einnahme Experimente am Vortag zu berauben.
2. Halten Sie eine Kakerlake, packte seine Flügel mit der flexiblen Zange (Abbildung 1, Schritt 5).
   Hinweis: Berühren Sie nicht die Körperteile von Kakerlaken.
3. Vorbereiten der DsRNA Lipoplexes sowie nackt DsRNA, Fütterung, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
   Hinweis: DsRNA Lipoplexes sollte vor der Fütterung frisch zubereitet werden.
4. Futter 4 µL DsRNA Lipoplexes oder nackt DsRNA (250 ng) mit einer Mikropipette.
5. Langsam pipettieren der Tropfen der DsRNA-Lösung die Mundwerkzeuge der Kakerlaken in der Nähe und lassen Sie die Kakerlaken aufnehmen des tröpfchens komplett.
6. Durchführen Sie zweimal täglich (1 h nach Lichter auf und 1 h vor dem Licht aus) die Einnahme Experimente, für 8 oder 16 Tage kontinuierlich.
   Hinweis: Alle Kakerlaken erworben Wasser nur durch manuelles zuführen mit DsRNA Lösung oder Kontrolle Reagenzien (z. B.Nuklease freies Wasser, Glukoselösung und Liposomen Reagenz) während der Einnahme Experimente.
7. Die Kakerlaken ermöglichen Sie Wasserflaschen nach 16 Tagen der Einnahme von DsRNA Experimente.

6. beurteilen Knockdown

1. Gewählten Zeitpunkt Punkte (2, 9 und 17 Tage nach DsRNA Einnahme Assay), die DsEGFP und DsTub-behandelten Insekten sammeln und sezieren die gewählten Gewebe (z.B. Mitteldarm).
2. Führen Sie quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR). Die qRT-PCR-Amplifikation Bedingungen und Primer-Informationen wie Lin Et al.berichtet. (2017) ¹².
3. Beurteilen Sie die Kontrolle und DsRNA-behandelte Insekten täglich Sterblichkeit zu überprüfen und entfernen die Kakerlaken, die nicht mehr in Bewegung sind.

Ergebnisse

Ein vereinfachtes Schema des Protokolls für die mündlichen Lieferung von DsRNA präsentiert sich in Abbildung 1, wo die wichtigsten Schritte für die Vorbereitung der DsRNA Lipoplexes gezeigt werden.

Um den Schutz von Liposomen Trägern auf DsRNA Abbau in den Mitteldarm Saft B. Germanica, ein ex-Vivo -Test wo DsTub Lipoplexes mit Mitteldarm Saft inkubiert wurden durchgeführt wur...

Diskussion

Dieses Protokoll stellt eine Methode für wirksame RNAi durch mündliche Lieferung von DsRNA Lipoplexes, denen Schutz gegen Ribonuklease Verdauung in den Mitteldarm Saft der deutschen Schabe. Wie in anderen Studien in verschiedenen Insektenarten gezeigt, der Armen RNAi-Effekt durch mündliche Lieferung von DsRNA vor allem durch den Abbau von DsRNA^8,9,10entfallen. Dieses Protokoll produziert Liposomen, die als schützende Fahrzeu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent	SignaGen	SL100499	for lipoplexes preparation
Blend Taq plus	TOYOBO	BTQ-201	for PCR
Fast SYBR Green Master Mix	ABI	4385612	for qPCR
FirstChoice RLM-RACE Kit	Invitrogen	AM1700	for 3' UTR identification
MEGAscript T7 Transcription Kit	Invitrogen	AMB13345	for dsRNA synthesis
TURBO DNase	Invitrogen	AM2239	remove DNA template from dsRNA
TRIzol	Invitrogen	15596018	for dsRNA or total RNA extraction
RQ1 RNase-Free Dnase	Promega	M6101	remove DNA template from total RNA
chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	for dsRNA or total RNA extraction
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516	for dsRNA or total RNA extraction
ethanol	Sigma-Aldrich	24102	for dsRNA or total RNA extraction
Diethyl pyrocarbonate, DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	for RNase free water preparation
glucose solution	Sigma-Aldrich	G3285	for lipoplexes preparation
Sodium chloride, NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	insect saline buffer formula
Potassium chloride, KCl	Sigma-Aldrich	P9333	insect saline buffer formula
Calcium chloride, CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016	insect saline buffer formula
Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O	Sigma-Aldrich	M2670	insect saline buffer formula
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	enzyme inhibitor
dissecting scissor	F.S.T.		cockroach dissection
fine tweezers	F.S.T.		cockroach dissection
flexible tweezer	F.S.T.		cockroach holding
pipetman	RAININ	P10	sample preparation
microcentrifuge tube	Axygen	MCT175C, PCR02C	sample preparation
pipette tip	Axygen		sample preparation
vortexter	Digisystem	vm1000	sample preparation
Minispin centrifuge	The Gruffin Group	GMC 206	for liquid spin down
Centrifuge	ALC	PK121R	sample preparation
pH meter	JENCO	6071	for pH adjust
micro-volume spectrophotometer	Quawell	Q3000	nucleic acid quantitative
PCR Thermal cycler	ABI	2720	for template PCR or  dsRNA synthesis incubation
quantitative real-time PCR	ABI	StepOne plus	gene expression quantitative
Centrifugal Vacuum Concentrators	eppendorf	5301	for dsRNA or total RNA extraction
Multipette	eppendorf	xstream	for real-time PCR sample loading
Agarose I	amresco	0710	for nucleic acid electrophoresis
tub gene specfifc forward preimer	tri-I biotech		GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA
tub gene specfifc reverse preimer	tri-I biotech		TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA
dsTub template forward primer	tri-I biotech		TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG
dsTub template reverse primer	tri-I biotech		TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG
dsEGFP template forward preimer	tri-I biotech		TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG
dsEGFP template reverse preimer	tri-I biotech		TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC
tub qPCR forward primer	tri-I biotech		GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC
tub qPCR reverse preimer	tri-I biotech		CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC
ef1 qPCR forward primer	tri-I biotech		CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A
ef1 qPCRreverse preimer	tri-I biotech		CCT GCA GAG GAA GAC GAA G