JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול שימוש דרוזופילה נוירון חישה - דנדריטים arborization (da) נוירון פציעה דגם, אשר משלב ויוו לחיות הדמיה, שני הפוטונים לייזר axotomy/dendriotomy ואת הכלים גנטי לטוס עוצמה, פלטפורמה לסינון היזמים הפוטנציאליים, מעכבי של neuroregeneration.

Abstract

היכולת לצמיחה מחודשת של נוירונים פגום מושלת neuroregeneration ושחזור פונקציונלי אחרי טראומה מערכת העצבים. במהלך העשורים האחרונים, זוהו פנימי ולא חיצוני מעכבות גורמים שונים המעורבים ההגבלה של האקסון התחדשות. עם זאת, הסרת רמזים מעכבות אלה אינו מספיק מוצלח ההתחדשות, המצביע על קיומן של מכונות רגולטוריות נוספות. דרוזופילה melanogaster, זבוב הפירות, חולק גנים שנשמרת אבולוציונית, איתות המסלולים עם בעלי חוליות, כולל בני אדם. שילוב הכלים גנטי רב עוצמה של הזבובים עם שני הפוטונים לייזר axotomy/dendriotomy, נתאר כאן דרוזופילה נוירון חישה – דנדריטים arborization (da) נוירון פציעה דגם כפלטפורמה לסינון באופן שיטתי על הרומן התחדשות הרגולטורים. בקצרה, זו הפרדיגמה כולל a) הכנה של הזחלים, ב) הנגע אינדוקציה dendrite(s) או axon(s) באמצעות לייזר שני הפוטונים, ג) בשידור חי קונאפוקלית הדמיה לאחר פציעה ד) ניתוח ממצאים. המודל שלנו מאפשר פגיעה מאוד לשחזור של נוירונים שכותרתו יחיד, אקסונים ו דנדריטים של תתי סוגים עצביים מוגדרים היטב, הן ציוד היקפי והן במערכת העצבים המרכזית.

Introduction

חוסר היכולת של אקסונים להתחדש לאחר פציעה מערכת העצבים המרכזית (CNS), עלול להוביל נכות קבועה בחולים, גם משחק תפקיד גרעונות בלתי הפיך ניווניות מחלות1,2 ,3,4,5. הסביבה מערכת העצבים המרכזית, כמו גם יכולת גידול מהותי של נוירונים, קובע אם אקסונים מסוגלים להתחדש לאחר טראומה. גורמים חוץ-תאית וממקורות אוליגודנדרוציטים, astroglial, fibroblastic הוכחו לעכב צמיחה עצביים4,6,7,8, אבל חיסול של מולקולות אלה רק מאפשר מוגבלת הלבלוב5. התחדשות פנימית אותות יכול להשפיע על הצלחה משובי5,9 ומייצגים מטרות טיפוליות אפשריות, אך תהליכים אלה הם עדיין לא מוגדר היטב ברמה המולקולרית. העלאות עם מחלות גורם איתות או חיסול של בלמים אנדוגני, כגון פוספטאז Pten10, יכול לגרום התחדשות עצב בנסיבות מסוימות. שילובים של שיטות שונות נמצא יעיל באופן אינדיבידואלי מספקים גם רק ההתאוששות הכללית מוגבל עד כה11,12,13,14. לכן, אין צורך נואש כדי לזהות מסלולים נוספים לטיפול ממוקד. בנוסף אתחול של האקסון לצמיחה מחודשת, אם וכיצד אקסונים תיל מחדש אל המטרה הנכונה, הרפורמה סינפסה, ירידה לפרטים, ולהשיג שחזור פונקציונלי חשוב שאלות בלתי פתורות.

לסיכום, ההבנה הנוכחית של מכונות הכתבת התחדשות האקסון הוא עדיין מאד וכלליות. חלק מהבעיה היא הקושי הטכני של הלומדים האקסון התחדשות ביונקים בזמן אמת, גישה זה יקר, גוזלת זמן, ומאתגר עבור ניצוח מסכי גנטי בקנה מידה גדול. דרוזופילה melanogaster, מצד שני, הוכיחה להיות מערכת חזק לחקר שאלות ביולוגיות מורכבות. זבוב הפירות כבר אינסטרומנטלי הגדרת גנים והאיתות מסלולים זה נשמרים להפליא בבני אדם, היה מודל מוצלח לצורך המחקר של מחלות אנושיות, כמו מחלות ניווניות, דרך הכלים העצום גנטיקה מולקולרית זמין לתמרן ג'ין פונקציה15. בפרט, זבובי פירות, נחשבת כלי אידיאלי עבור גילוי גנים המעורבים פגיעה עצבית ו לצמיחה מחודשת15,16. פותחו מספר מודלים לטוס פגיעה עצבית, כולל ראש-מבוגר או עצב הגחון זחל כבל (VNC) לדקור עם מחטים, זחל VNC או עצב מעוך עם מלקחיים, נוירון זחל axotomy לייזר, הסרת נוירון קולטני ריח, פגיעה מוחית explants, פגיעה במערכת העצבים ההיקפית על ידי אגף פיצויי15,17,18,19,20,21,22,23. . Excitingly, זה התבצעה עבודה ניצול דרוזופילה פציעה מודלים המתקדמת ההבנה שלנו של המסלולים הסלולר ותעשיה בשימוש על ידי מערכת העצבים להגיב לפגיעה עצבית, אשר הוכחו להיות שמור ב יונקים24 ,25. שוב, זה מדגיש את התועלת של זה אורגניזם מודל עבור זיהוי מנגנוני תיקון עצבי הרומן.

המתוארים כאן הוא שני הפוטונים מבוססת לייזר דרוזופילה נוירון חישה זחל פציעה מודל. לייזר שני הפוטונים השימוש הראשון היה לחתוך אקסונים דג זברה ויוו 200326. באותה שנה, dendriotomy לייזר הראשונה בוצעה בשנת דרוזופילה באמצעות לייזר של חנקן פעמו27. זמן קצר לאחר מכן, מספר מעבדות C. elegans להשתמש לייזר הפמטו-שנייה כדי ליצור מודלים של האקסון התחדשות28. ב- 2007, וו ועמיתיו בהשוואה ודיווח על ההבדלים בין פציעות לייזר ב- C. elegans המושרה על ידי סוגים שונים של לייזרים29. בשנת 2010, האקסון חידוש לאחר לייזר axotomy הוצג לראשונה להופיע אצל דרוזופילה30. בהתבסס על ספרות זו פגיעה נרחב לייזר, פיתחנו מודל פגיעה עצבית לעוף באמצעות הלייזר שני הפוטונים, המאפשר אינדוקציה מדויק לפגיעה אתרי יישוב עם ההפרעות מינימלי של רקמות שכנות, מתן יחסית נקי מערכת ללמוד בשני המאפיינים פנימי ולא חיצוני של neuroregeneration עם רזולוציה תא בודד. באופן ספציפי, הקמנו קבוצת שיטות הפציעה arborization דנדריטים (da) החישה הניריונים, הן מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית) ואת מערכת העצבים המרכזית. ניתן לקבץ Da נוירונים ארבע כיתות נפרדות מאופיינת בעיקר המורכבות מסעף שלהם דנדריט: מחלקה אני הרביעי31. עבודתנו שפורסמו מראה כי דה נוירון התחדשות דומה מודלים בתרבית של פגיעה ברמת פנוטיפי ו מולקולרית: da נוירונים להציג מאפייני מחלקה של התחדשות מסוימת, עם מחלקה IV אבל לא כיתה אני או נוירונים da השלישי מפגין התחדשות ב מערכת העצבים ההיקפית; השיעור הרביעי da נוירון אקסונים להתחדש robustly בפריפריה, אבל פוטנציאל הרגנרציה שלהם מופחת באופן דרמטי מערכת העצבים המרכזית, ובכך דמוי שורש העזוב נוירונים גנגליון (DRG) ביונקים; שיפור הפעילות mTOR באמצעות Pten מחיקה או ביטוי Akt משפר האקסון התחדשות של הזבוב CNS19. ניצול מודל זה פגיעה, אנו להיות ביצוע מסכי גנטי, זיהו את האנזים עיבוד RNA rtca ב גורם מעכבות אבולוציונית שנשמרת האקסון ההתחדשות, קישור האקסון פציעת מתח סלולר והסבת RNA20 .

ב התבנית שהוצגו, הפגיעה הנגרמת באמצעות לייזר axotomy/dendriotomy של הזחל class IV או נוירונים da השלישי, הנקרא על-ידי ממ ק-CD4-tdGFP או 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, ריפו-Gal80, בהתאמה. הפגיעה מבוצעת 2nd כדי 3rd הזחלים לחלל כ 48-72 שעות לאחר הנחת (h AEL) ביצה. עבור מערכת העצבים ההיקפית axotomy הנגע מכוון למקטע של האקסון ~ 20-50 מיקרומטר, והגוף תא, CNS axotomy לאזור של ~ 20 מיקרומטר בקוטר בצומת commissure ב VNC, ולכל dendriotomy על נקודות סניף ראשי דנדריטים. באותו הנוירון זה עם תמונה 8-24 שעות לאחר פציעה (AI) כדי לאשר חיתוך מלאה, ובבית 48-72 h AI כדי להעריך את התחדשות. באמצעות הדמיה קונאפוקלית זמן לשגות, ניוון של התחדשות של אקסונים/דנדריטים בודדים שהיו פצועים ויוו ניתן לנטר לאורך זמן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת לוחות תרבות ובקבוקים

  1. הכנת מיץ ענבים פלטות אגר
    1. להוסיף 10 גרם של אבקת אגר, מיץ ענבים 200 mL, 192 mL ddH2O לתוך הספל במיקרוגל במשך כ 4-5 דקות, תוך ערבוב לסירוגין עד אגר היא התפרקה לחלוטין.
    2. בשכונה fume, לקרר את הפתרון כ 60 מעלות צלזיוס. הוספת אתנול 95% 4.2 מ ל ו- 4.0 מ ל חומצה אצטית. להתאים את הנפח הכולל של הפתרון עד 400 מ"ל עם ddH2O. לערבב היטב.
    3. על כל צלחת 35 מ מ, להוסיף בערך 2-3 מ"ל של הפתרון. ודא כ 120-150 לוחות עבור סכום כולל של 400 מ ל מיץ ענבים אגר פתרון.
    4. המתן 10 דקות לקרר את הצלחות, לחזק את הפתרון אגר. לארוז את מיץ ענבים פלטות אגר בתוך שקיות ziplock העצמית אטום ולאחסן ב 4 ° C לשימוש עתידי.
  2. הכנת דרוזופילה תרבות בקבוקים
    1. השתמש בלהב כדי 1.5 ס מ בצד אורך משולש חור בקיר אחד בלבד של הבקבוק תרבות דרוזופילה ולמלא את החור עם כדור בקוטר 2-2.5 ס מ של כותנה לאוורור.
    2. חבר את הבקבוק עם צלחת אגר מיץ ענבים בתוספת על 0.5 ס מ3 של שמרים הדבק.

2. אוסף של הזחלים דרוזופילה

  1. הגדרת חוצה של הזבוב הבוגר
    1. מקום 10 נקבות בתולה עם מבוגר זכר 5 טיסות יחד בבקבוק תרבות מחובר עם צלחת אגר מיץ ענבים.
    2. המקום תחתית הבקבוק עד 25° c, כך זבובים להטיל ביצים בצלחת אגר מיץ ענבים. לשנות את הצלחת עם שמרים הדבק לפחות פעם ביום. לתקופה אוסף 2-h, מה שמקנה קציר של הזחלים בשלב התפתחותי הומוגנית, להתחיל עם יותר מ- 20 בתול נקבות וזכרים 10 בשלב 2.1.1.
    3. תרבות הצלחת 25° c בצלוחית 60 מ מ עם ממחטה רטובה, לדוגמה, ספוג בתמיסה 0.5% חומצה propionic. לסדר את הרקמה כך זה אינו חוסם את זרימת החמצן.
      הערה: הפתרון חומצה propionic משמש כדי לשמור על לחות בצלחת למנוע הצמיחה של עובש.
  2. קציר הזחלים בגיל מסוים
    1. השתמש זוג מלקחיים להעברת הזחלים של השלב הרצוי, לדוגמה, 2nd 3rd לחלל רימות-48-72 שעות לאחר הנחת (AEL), ביצה עד כדי צלחת אגר מיץ ענבים חדש ללא שמרים הדבק.
    2. הסר השמרים העור של הזחלים ולהודיע להם סריקה מסביב על הצלחת חדשה, כדי למנוע הפרעות אפשריות של שמרים עם לייזר axotomy ודימות. לחלופין, ניקוי יסודי הזחלים על ידי שטיפה אותם בתוך קערת PBS וייבוש בקצרה על פיסת נייר טישו.

3. שני הפוטונים פציעה והדמיה קונפוקלי

  1. מיקרוסקופ ההתקנה
    הערה: לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק עם לייזר שני הפוטונים שימשו את הניסוי הזה, אך מערכות אחרות עם התקנה מקבילה גם יספיק. הלייזר שני הפוטונים (930 ננומטר) שימש להעברת פציעה, ללייזר (488 ננומטר) שימש עבור הדמיה קונאפוקלית של GFP.
    1. בתחילת כל מפגש, הפעל את הלייזר שני הפוטונים ו/או את laser(s) קונאפוקלית ולאחר המיקרוסקופ. פתח את תוכנת הדמיה.
    2. עבור שני הפוטונים פציעה, להגדיר את הפרמטרים הבאים הדמיה GFP עם לייזר שני הפוטונים-930 nm (1,950 mW).
      1. בחר במצב סריקה קו. לפתוח את חריר עד הסוף. להגביר את עוצמת הלייזר ~ 20% (390 מגה-וואט).
      2. בחר 512 x 512 הסריקה מסגרת. השתמש מהירות סריקה מקסימלי (בדרך כלל עם הזמן להתעכב פיקסלים ב- 0.77 µs). ודא כי המספר הממוצע הוא 1, עומק סיביות ויש 8 סיביות.
      3. רווח קבוע ~ 750, ההיסט ל- 0.
      4. שמור את נסיוני שנקבע מראש P 2 GFP 930 אבלציה, מתן אפשרות עבור שימוש חוזר בעתיד ניסויים.
    3. עבור הדמיה קונאפוקלית, להגדיר את הפרמטרים הבאים הדמיה GFP עם לייזר ארגון-488 ננומטר:
      1. בחר את הכרטיסיה רכישה ולאחר מכן Z-מחסנית.
      2. תחת "לייזר", להפעיל את הכוח הלייזר ארגון 488 ננומטר.
      3. עבור ערוצים, בחר את הלייזר מ מ 488 ולאחר להגביר את עוצמת הלייזר ל 5-10%. לשימוש חריר, 1-2 ואווריריים היחידה (AU). להתאים את הרווח אל 650.
      4. רכישת מצב, בחר 1024 x 1024 הסריקה מסגרת, השתמש מהירות הסריקה המקסימלי, מספר ממוצע של 2, ואת עומק סיביות של 8 סיביות.
      5. שמור את נסיוני שנקבע מראש GFP הדמיה.
  2. הזחלים הרדמה ועם דיאתיל אתר הרכבה
    1. בשכונה fume, מניחים צלחת זכוכית 60 מ מ ב- 15 ס מ פלסטיק פטרי. מקפלים ומניחים פיסת נייר טישו בתחתית קערה מזכוכית, ואז מניחים צלחת אגר מיץ ענבים על הרקמה. להוסיף דיאתיל אתר לתוך קערה מזכוכית, לנקודה בה ממחטת נייר ספוגה יש שכבה של אתר נוזלי שנותרו בצלחת. לשמור על כל הזמן.
    2. הכנת שקופית מזכוכית עם טיפה אחת של halocarbon שמן 27 במרכז. להוסיף 4 כתמי גריז ואקום על ארבע הפינות של השקופית, כדי לתמוך מאוחר יותר את coverslip.
    3. להשתמש מלקחיים להרים זחל נקי ולמקם אותו על הצלחת אגר בצלחת זכוכית 60 מ מ. מכסים את הכלי זכוכית עם המכסה והמתן עד הזחל יפסיק לזוז. עבור מערכת העצבים ההיקפית פציעה/הדמיה, להוציא הזחל ברגע זנבו מפסיק בפקעת. עבור מערכת העצבים, המתן עד הזחל כולו הופך ללא תנועה, במיוחד את מקטעי ראש.
      הערה: העיתוי של אתר חשיפה היא קריטית. ראה דיון.
    4. בזהירות לאסוף את הזחל anesthetized והנח אותו ראש-זקוף לתוך טיפת שמן halocarbon בשקופית. הוסף את coverslip על גבי השקופית. השתמש לחץ עדין כדי ללחוץ על coverslip, עד שייגע הזחל (איור 1 א').
    5. להתאים המיקום של הזחל דוחפים בעדינות את coverslip לכיוון שמאלה או ימינה כדי לגלגל את הזחל, כך הנוירון/האקסון/פיתוח של עניין הוא בחלק העליון תוך הקרוב המיקרוסקופ.
    6. עבור מערכת העצבים ההיקפית פציעה, הר הצד הגבי זחל, כך tracheas שני גלויים. . אז גלגל הזחל ~ 30 מעלות שמאלה עבור ופצעו class III da נוירון אקסונים (איור 1B וג 1), 90 מעלות עבור ופצעו class IV דה נוירון אקסונים (איור 1B ו- 1E) או ~ 30 מעלות עבור ופצעו class IV דה נוירון דנדריטים ( איור 2A).
    7. עבור פגיעה CNS, מקם הזחל להיות בצד הגחוני לחלוטין למעלה (איור 3 א), כך האזור עניין הוא הקרוב ביותר עדשת המיקרוסקופ ב z-המישור.
  3. פגיעה על ידי שני הפוטונים לייזר
    1. מקם את השקופית עם הזחל מתחת למיקרוסקופ ואבטח אותו במקום עם המחזיק שקופיות על הבמה. שימוש 10 X (0.3 NA) המטרה למצוא הזחל.
    2. להוסיף טיפה 1 של שמן אובייקטיבית coverslip, לעבור 40 X (1.3 NA) המטרה והתאימו את המוקד.
    3. כדי לעבור למצב סריקה ולהשתמש פרוטוקול נסיוני P 2 GFP 930 אבלציה. ודא שחריר פתוח עד הסוף.
      הערה: התצורה צריך להיות מותאם בהתבסס על מערכות נפרדות.
    4. להפעיל את מצב Live כדי לאתר את האזור של הריבית (ROI), לכוונן את ההגדרות כדי להשיג איכות תמונה טובה עם הזום המתאים.
      הערה: מטרתו של שלב זה היא למצוא הנוירון/האקסון/דנדריט לפצוע, במקום לקחת את התמונה באיכות הטובה ביותר. לכן, השתמש בהגדרות מזערית מספיקה כדי להמחיש את אזור המטרה, כדי למנוע חשיפת יתר או photobleaching.
    5. לעצור את הסריקה Live , כך הלחצן חתוך יהפוך לזמין. תן את תמונת הסטילס לשמש מפת הדרכים. בחר בפונקציה חיתוך ולהתאים חלון הסריקה להתמקד המטרה להיפצע.
    6. להפחית את רועי לגודל של אתר פוטנציאליים של פציעה. לדוגמה, רק לכסות הרוחב של האקסון או דנדריט, כדי להבטיח את הדיוק של הפגיעה ולהפחית נזק לרקמות שכנות. אם רצונך בכך, תקריב על רועי לפני חיתוך, התרת פגיעה מדויקת יותר.
    7. פתח חלון חדש הדמיה. להפחית את מהירות סריקה ולהגדיל את עוצמת הלייזר. לקבוע את העלייה בעוצמת לייזר המבוסס על האות פלורסצנטיות רקמות שנסרקו במצב Live .
    8. בדרך כלל, להגדיר את עוצמת הלייזר שני הפוטונים החל מ- 25% על מערכת העצבים ההיקפית הפגיעה ו- 50-100% על הפגיעה VNC. מערכת העצבים ההיקפית האקסון להיפצע, להבטיח עוצמת הלייזר ~ 480 מגה-וואט, פיקסל להתעכב זמן הוא 8.19 μs. עבור הפגיעה האקסון VNC, ודא כי הזמן להתעכב לייזר בעוצמה, פיקסל הם בדרך כלל 965-1930 mW 8.19-32.77 μs, בהתאמה.
    9. הפעל סריקה רציף . השאר את הסמן מרחף מעל הלחצן רציף . להשגיח מקרוב על התמונה ולהפסיק את הסריקה ברגע נצפית עלייה דרסטית בזריחה.
      הערה: המראה של ספייק פלורסצנטיות נובעת אוטומטית-זריחה הפציעה.
    10. לעבור בחזרה למצב בשידור חי על-ידי שימוש חוזר להגדרות. למצוא את האזור של עניין זה רק סומן על-ידי התאמת את המוקד.
      הערה: סימן טוב של פגיעה מוצלחת היא המראה של מכתש קטן, מבנה טבעתי או פסולת מקומי בכניסה לאתר פציעה.
    11. לעבור הנוירון הבא וחזור מ שלב 3.3.5, לפגוע נוירונים מרובים ב- חיים בודד. או חזור על שלב 3.3.5 תוך בהדרגה בהגדלת הכוח ו/או הפחתת מהירות סריקה אם הפגיעה הראשונית הייתה מספיקה.
      הערה: במקרה זה עוצמת הלייזר גם גבוה, אזור נזק גדול יהיה גלוי בתמונה סריקה בשידור חי לאחר פציעה. פגיעה מדי עלולה לגרום למותו של הזחל.
    12. לשחזר הזחל על ידי הסרת את coverslip והעברת הזחל פצועים על צלחת חדשה עם שמרים הדבק בזהירות. לנטוש את מספר מערות בצלחת אגר עם מלקחיים; לחלופין, לבצע אי של אגר בצלחת במקום להשתמש צלחת מלאה, כדי לצמצם את האפשרות של הזחל זוחל מהצלחת.
    13. לשים את הצלחת בצלוחית 60 מ מ עם רקמת רטוב (ספוג עם 0.5% חומצה propionic פתרון) והתרבות בטמפרטורת החדר או 25 º C.
      הערה: הזחל יישאר בשלב הזחל עבור יום נוסף בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) בהשוואה ל- 25° C.
  4. הדמיה קונאפוקלית לאחר פציעה
    1. תמונת הזחל פצוע בנקודות הזמן הרצויים על-ידי הכנת הזחל באמצעות ההליך באותה ההרדמה, הרכבה כמו 3.2 שלב, לאחר מכן הדמיה עם לייזר קונפוקלי.
      הערה: תמונה הזחל 24 שעות לאחר פציעה (AI) כדי לאשר פציעה axonal דיפוזי וכן ב 48 שעות AI (class IV דה נוירונים) או 72 h AI (class III da נוירונים) כדי להעריך את התחדשות.
    2. לאתר הזחל באמצעות המטרה X 10 ולאחר מכן לעבור 25 X (0.8 NA) המטרה. שימוש חוזר פרוטוקול נסיוני GFP הדמיה.
    3. לחץ על לחצן Live ולמצוא אותו נוירון נפגע בעבר.
    4. הגדר את העמדות Z הראשון והאחרון בחלון סריקה בשידור חי. לחץ על stop ולחץ על התחל להתנסות כדי לרכוש תמונה Z-מחסנית.
      הערה: ודא כי נקודת נורמליזציה (נקודת משולבות של האקסון) נכלל בעת לכידת תמונות כך כימות של התחדשות אפשרית (איור 1D, 1F) – זה נדון בהמשך במקטע ניתוח הנתונים.
    5. לעבור עיבוד תמונה, בחר את התמונה פשוט לקחת ולהפיק הקרנה העוצמה המקסימלית. שמור z-מחסנית ואת העוצמה המקסימלית הקרנת תמונות.

4. ניתוח נתונים

  1. תהליך ולכמת תמונות באמצעות הדמיה תוכנה או ImageJ.
  2. כימות של האקסון התחדשות ב מערכת העצבים ההיקפית
    1. חישוב אחוזי התחדשות, המתייחס האחוזים של רגנרציה אקסונים בין כל האקסונים שהיו lesioned. ציון של האקסון כמו רגנרציה כל עוד זה מתחדש מעבר אתר הפציעה.
    2. מדד אורך התחדשות, אשר הגדלת אורך האקסון. אם לכימות עם ImageJ, השתמש בכלי קו מקוטע כדי לאתר את האקסון regenerated, והשתמש מידה בתפריט הנפתח נתח להשגת אורכו של קו המייצג את האקסון מחדש.
    3. חישוב מדד התחדשות, וזו הגדלת אורך האקסון מנורמל.
      הערה: אורך האקסון הוא מנורמל על-ידי המרחק בין גוף התא הדנדריטי לאקסון מתכנס בנקודה (DCAC) – האקסון אורך/DCAC (איור 1D ו- 1F). ערך זה מסייע חשבון עבור כל הצמיחה עצב כי עקב שינוי גודל זחל. ערך חיובי מייצג התחדשות, ערך של 0 פירושו אין התחדשות, וערך שלילי מציין התנצלות.
  3. כימות של התחדשות דנדריט
    1. לחשב התחדשות אחוז, המהווה האחוזים של נוירונים da בין כל אלו ניתקה המציגים דנדריט ברור לצמיחה מחודשת.
      הערה: דנדריט לצמיחה מחודשת הוא הבקיע כפי דנדריטים חיובי אם חדש ולצמיחה מחודשת החוצה מן הגבעול דנדריטים שקועה ומעבר לפציעה באתר. אתר פגיעה נקבע על-ידי-אתרים, ובמקרים מסוימים, גלויות בשל autofluorescence הנוצרות על-ידי פגיעה שיורית.
    2. לחשב עלייה של סניף נקודות, אשר מונה התוספת של נקודות דנדריטים הסניף החדש לאחר פציעה.
    3. לחשב להגדיל אורך דנדריט הכולל, אשר הוא אורך כל דנדריטים חדש הוסיף לאחר פגיעה מצטברת.
  4. כימות של האקסון התחדשות ב מערכת העצבים
    הערה: אם אתר הנגע מראה ניוון בנקודה הראשונה זמן עם תמונה (איור 3B), זה יהיה כלול בניתוח של התחדשות אורך וקצב.
    1. מדד אורך התחדשות, אשר אורך האקסון regrowing.
      הערה: האקסון regrowing של אתר יחיד הנגע מזוהה בתור מוצאה את המסלול האקסון המקורי לפני הפגיעה.
    2. חישוב אורך התחדשות Normalized, אשר מווסת את האורך התחדשות אורך המקטע commissure - המרחק האורך בין commissures ("Y" איור 3A ו- 3B).
      הערה: ערך זה מסייע הנכון עבור האפקט של גודל זחל הבדלים.
    3. לחשב קצב התחדשות, האחוזים של רגנרציה מקטעים בין כל הקטעים שהיו lesioned, כדי לשקף את יכולת התחדשות גנוטיפ מסוים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

Da נוירונים להראות התחדשות דיפרנציאלית פוטנציאלי בין ההיקפית ואת מערכת העצבים המרכזית, וכן מחלקה ירידה לפרטים. זה מספק הזדמנויות ייחודיות על המסך עבור גורמים הרומן הנדרשים עבור התחדשות האקסון (באמצעות הכיתה פגיעה מערכת העצבים ההיקפית הרביעי), כמו גם אלה מעכבות ולשם רגנר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בעת הגדרת הזבוב חוצה, המספר של נקבות וזכרים בשימוש יכולה להשתנות בהתאם אחרים את המספר של הזחלים לצורך ניסויים ספציפיים בבעלי. WT זבובים, הצלב טיפוסי משתמש 10 נקבות וזכרים 5. החלון אוסף עשוי להצטמצם, בהתאם למידת הדיוק של עידן הזחלים נדרש. לדוגמה, פרק 2-h אוסף תניב הזחלים של אוכלוסיה הומוגני יותר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים ג'סיקה Goldshteyn לקבלת תמיכה טכנית. העבודה במעבדה השיר ממומן על ידי המענק-NIH R00NS088211, ואת הקניין הרוחני פרס לפיתוח תוכנית חדשה מרכז מחקר התפתחותיות (IDDRC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrousAcros OrganicsAC615080010
Halocarbon 27 OilGenesee Scientific59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1LVWR97062-948 
Agar powder, Alfa Aesar, 500GMVWRAAA10752-36
Grape juiceWelch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)VWR64-17-5
Acetic acidSigma-AldrichA6283
Propionic AcidJ.T.BakerU33007
Cover Glasses: RectanglesFisher Scientific12-544-D50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscopeZeiss
Zen softwareZeiss
Chameleon Ultra IICoherent

References

  1. Yakura, J. S. Recovery following spinal cord injury. , (1996).
  2. Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury? Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
  3. Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
  4. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
  5. Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
  6. Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
  7. Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
  8. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  9. He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
  10. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
  11. Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
  12. Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
  13. Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074(2015).
  14. Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
  15. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
  16. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  17. Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
  18. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
  19. Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
  20. Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
  21. Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133(2011).
  22. Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
  23. Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
  24. Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
  25. Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
  26. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
  27. Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
  28. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822(2004).
  29. Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
  30. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
  31. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
  32. Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
  33. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
  34. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  35. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
  36. Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32(2009).
  37. McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
  38. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
  39. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104(2007).
  40. Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103(2002).
  41. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963(2008).
  42. O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
  43. Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
  44. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30(2006).
  45. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135arborizationneuroregenerationaxotomydendriotomyCNS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved