再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル

要約

ここでは、としてショウジョウバエ感覚ニューロンの樹状分枝 (da) ニューロン損傷モデルは、体内を組み合わせたライブ イメージング、2 光子レーザー膠/dendriotomy、および強力なハエの遺伝的ツールボックス,を使用してプロトコルを提案します。潜在的なプロモーターと再生に関する阻害物質をスクリーニングするためのプラットフォームです。

要約

破損した細胞の再生能力には、神経系の外傷後支配する再生に関すると機能回復が。過去数十年間、さまざまな組み込みと外因性抑制に関与する因子軸索再生の制限が特定されています。しかし、単にこれらの抑制のキューを削除する再生が成功する、追加規制機械の存在を示すため不十分です。キイロショウジョウバエ、フルーツ フライは、ヒトを含む脊椎動物の進化上保存された遺伝子とシグナル伝達経路を共有します。2 光子レーザー膠/dendriotomy とハエの遺伝子の強力なツールボックスを組み合わせること、ここで述べたいショウジョウバエ感覚ニューロン-樹状分枝 (da) ニューロン損傷モデル体系的に小説のスクリーニングのためのプラットフォームとして再生レギュレータ。簡単に言えば、このパラダイムには) dendrite(s) または axon(s) 2 光子レーザー、c) ライブの共焦点イメージング受傷後、d) データ分析を使用する幼虫、巣 b) 誘導の準備が含まれます。私たちのモデルにより、末梢および中枢神経系の適切に定義された神経細胞の樹状突起、軸索、単一標識細胞の再現性の高い傷害です。

概要

軸索の中枢神経系 (CNS) への損傷の後で再生することができない患者では、永続的な障害につながる可能性があります、また神経変性疾患^{1,2 で不可逆的な神経障害の役割を果たしています。 ,3,4,5}。神経細胞の本質的な成長能力と同様に、中枢神経系の環境では、軸索が外傷の後で再生することができるかどうかを決定します。神経成長^4,6,7、8、しかし、これらの分子の除去を阻害するオリゴデンドロ サイト、グリア、および線維芽ソースから細胞外の要因が示されています。発芽⁵限定のみことができます。本質的な再生信号することができます再生成功^5,9に影響し、潜在的な治療上のターゲットを表すが、これらのプロセスは分子レベルでまだよく定義されていません。栄養因子の役割や Pten のホスファターゼ¹⁰などの内因性のブレーキの除去の増加は、特定の状況における軸索再生で起因できます。個別に有効にする別のメソッドの組み合わせはまた、唯一^11,12,13,14まで限られた全体的な回復を提供します。そのため、標的療法の追加の経路を識別するために絶望的な必要性があります。軸索再生の開始、かどうか、および軸索再改革シナプス特異性、正しいターゲットに線を達成するためにどのように機能回復も重要な未解答の質問。

要約すると、軸索の再生を口述機械の現在の理解は非常に断片的です。問題の部分は軸索の勉強が困難であったリアルタイムで哺乳類の再生がかかり、時間がかかり、大規模な遺伝子スクリーニングを実施するために挑戦的なアプローチ。その一方で、キイロショウジョウバエは複雑な生物学的問題の研究のための非常に強力なシステムであると証明しました。ショウジョウバエの遺伝子を定義し、人間の驚くほど保存されているパスウェイに尽力されているし、広大な分子遺伝学ツールを介して、神経変性疾患など、人間の条件の調査のための成功モデルをされています。遺伝子機能¹⁵の操作に使用できます。特に、ショウジョウバエは、神経損傷と再生^15,16にかかわる遺伝子の発見のための理想的なツールと見なされます。大人頭または幼虫 VNC または鉗子、幼虫ニューロン レーザー膠、嗅覚受容ニューロンの除去、脳外植体損傷と神経ときめきの針で刺すような幼虫の腹側神経コード (VNC) を含むいくつかのフライ神経障害モデルを開発されています。翼退職^{15,17,18,19,20,21,22,23}によって末梢神経病変。最近仕事利用したショウジョウバエ傷害モデルが哺乳類^{24 に保存されると示されているいくつかの神経損傷に応答する神経システムで使用される細胞と遺伝経路の私達の理解を高度な興奮して、 ,25}。繰り返しますが、これは神経修復の識別機構のこのモデル有機体の有用性を強調します。

ショウジョウバエ幼虫の感覚ニューロン損傷モデルをレーザーを用いた 2 光子は、ここで説明しました。2 光子レーザーは、ゼブラフィッシュのの体内2003年²⁶軸索を切断する最初に使用されました。同じ年、最初のレーザー dendriotomy はショウジョウバエパルス窒素レーザー²⁷を使用で行われました。まもなく、いくつかc. の elegansのラボは、軸索再生²⁸のモデルを確立するのにフェムト秒レーザーを使用しました。2007 年に呉と同僚は比較、各種レーザー²⁹による線虫のレーザー損傷間の相違点を報告します。2010 年レーザー膠後軸索再生最初ショウジョウバエ³⁰で発生する示されました。この豊富なレーザー損傷文献上に構築された開発した隣接する組織の最小限の摂動による対象サイトへの損傷の正確な誘導を可能にする 2 光子レーザーを用いたフライ神経損傷モデル比較的きれいなを提供すること単一セルの解像度で再生に関するの組み込みと外因性の両方の特性を調査するシステムです。具体的には、我々 両方末梢神経系 (PNS) の感覚ニューロンは樹状パターン形成 (da) の傷害メソッドのセットを設け、中枢神経系。Da ニューロンが、樹状突起の分岐の複雑さによって主に 4 つのクラスにグループ化できます: IV³¹種します。私たちの出版された仕事は da ニューロン再生表現型および分子レベルで哺乳類の損傷モデルに似ている示しています: da ニューロン クラス IV のクラス特定の再生プロパティを表示がないクラス III da 細胞で再生するか、PNS;クラス IV da ニューロン軸索再生周辺で力強く、従って哺乳類; 後根神経節 (DRG) ニューロンに似た中枢神経系の再生の可能性を大幅に削減Pten による mTOR の活性を促進させる削除や Akt の発現は、飛ぶ CNS¹⁹軸索の再生を向上させます。遺伝子スクリーニングを行っている私たち細胞ストレスおよび RNA の修飾^{20 へ軸索損傷のリンク軸索再生、進化上保存された阻害要因として RNA プロセシング酵素 Rtca を識別したこの損傷モデルを活用し、}.

提示のパラダイムでは、傷害がレーザー膠/幼虫クラス IV または III da ニューロン、 ppk CD4 tdGFPまたは19-12-Gal4、UAS-CD4-tdGFP、レポ Gal80、それぞれラベルの dendriotomy を介して誘導されます。傷害、2^nd約 48-72 時間で 3^rdの幼虫に産卵 (h AEL) 後に実行されます。PNS の膠病変は、VNC で交連交差点 ~ 20 μ m の領域に中枢神経系膠と主樹状突起分岐ポイントに dendriotomy の細胞体から軸索 20 ~ 50 μ m のセクション ターゲットです。8-24 h 完全断裂を確認する (AI) の負傷後、48-72 時間再生を評価するために AI を使用して同じニューロンのイメージを作成します。タイムラプス顕微鏡を用いたイメージングを通じて、変性および生体内で負傷されている個々 の軸索/樹状の再生時間の経過と共に監視できます。

プロトコル

1. 培養皿とボトルの準備

1. グレープ ジュース寒天プレートの準備
   1. ビーカー、寒天が完全に溶解するまで断続的に攪拌しながら、約 4-5 分電子レンジに 192 mL ddH₂O、200 mL グレープ ジュース、粉寒天 10 g を追加します。
   2. 約 60 ° C への解決策をクールな発煙のフード4.2 mL 95% エタノールと 4.0 mL の氷酢酸を追加します。よく ddH₂o ・ ミックスと 400 mL にソリューションの総量を調整します。
   3. 各 35 mm プレート ソリューションの約 2-3 mL を追加します。400 mL グレープ ジュース寒天液の合計は約 120-150 プレートを作る。
   4. プレートを冷やす寒天液を固化して 10 分待ちます。自己密封ジップロック袋に寒天グレープ ジュースをパックし、将来の使用のための 4 ° C で保存します。
2. ショウジョウバエ培養ボトルの準備
   1. ショウジョウバエ培養ボトルの 1 つの壁に 1.5 cm 側長さ三角穴を開けるし、換気のための綿の 2 〜 2.5 cm 径のボールの穴を記入するブレードを使用します。
   2. 酵母ペーストの 0.5 cm³程度を添加したグレープ ジュース寒天プレートにボトルを差し込みます。

2。ショウジョウバエ幼虫のコレクション

1. 成虫の十字架を設定します。
   1. 場所 10 処女の女性と 5 成人男性はグレープ ジュースの寒天と差し込まれる培養ボトルに一緒に飛ぶ。
   2. ハエはグレープ ジュースの寒天に卵を産むので、上 25 ° c、ボトルの底に置きます。一日に少なくとも一回酵母ペーストでプレートを変更します。均一な発育段階の幼虫の収穫を可能にする 2 h コレクション期間の以上 20 の処女雌と 2.1.1 の手順で 10 の男性で開始します。
   3. 文化 25 ° c、ウェットティッシュで 60 mm のペトリ皿でプレートは、たとえば、0.5% プロピオン酸溶液に浸漬します。酸素の流れを妨げないように組織を配置します。
      注: 皿の中の湿度を維持し、カビの成長を避けるプロピオン酸溶液を使用します。
2. 特定の年齢の幼虫を収穫します。
   1. たとえば、2^nd (AEL) 産卵後 48-72 時間で 3^rdの幼虫に必要なステージの幼虫を転送するのに酵母貼り付けることがなく新しいグレープ ジュース寒天プレートに鉗子のペアを使用します。
   2. 酵母幼虫の皮膚からして削除させるレーザー膠とイメージングと酵母の潜在的な干渉を防ぐために、新しいプレートの周りのクロール。また、PBS の皿にそれらを洗浄し、ティッシュ ペーパーの部分を簡潔に乾燥幼虫を徹底的に掃除します。

3. 2 光子傷害および共焦点レーザー顕微鏡

1. 顕微鏡のセットアップ
   メモ: 2 光子レーザー顕微鏡共焦点レーザーを用いてこの実験が同等のセットアップの他のシステムも十分です。2 光子レーザー (930 nm) 傷害とアルゴン レーザーを提供するために使用された (488 nm) GFP の共焦点イメージ投射のために使用されました。
   1. 各セッションの初めに、2 光子レーザーや共焦点の laser(s) と顕微鏡を入れます。イメージング ソフトウェアを開きます。
   2. 930 で二光子励起レーザーを用いた GFP をイメージングの次のパラメーターを設定 2 光子傷害の nm (1,950 mW)。
      1. ライン スキャン モードを選択します。すべての方法をピンホールを開きます。〜 20% のレーザー強度を高める (390 mW)。
      2. フレーム スキャンとして 512 x 512 を選択します。(通常は 0.77 μ s にピクセル滞留時間) 最大走査速度を使用します。数の平均値は 1 ビット深度 8 ビットであることを確認します。
      3. 〜 750、およびオフセット 0 にするゲイン。
      4. 2 P GFP 930 アブレーション、簡単に再利用は将来的に実験することとして、この事前に設定実験的プロトコルを保存します。
   3. 488 でアルゴン レーザーと GFP をイメージングの次のパラメーターを設定共焦点イメージングの nm。
      1. 取得] タブと [ Z スタックを選択します。
      2. 「レーザー」の下には、488 nm のアルゴン レーザーの電源を入れます。
      3. チャンネル、488 mm レーザーを選択し、5-10% にレーザー パワーを上げて行きます。ピンホール 1 2 風通しの良い単位 (AU) を使用します。650 にゲインを調整します。
      4. アクイジション ・ モード、フレーム スキャンとして 1024 x 1024 を選択、最大スキャン速度、2 の平均数、8 ビットのビット深度を使用します。
      5. GFP イメージングとして事前に設定この実験的プロトコルを保存します。
2. ジエチル エーテルと取付幼虫麻酔
   1. ヒューム フードで 15 cm のプラスチック シャーレ 60 ミリメートルのガラス皿を置きます。倍とレイ紙切れガラス皿の下部組織で組織にグレープ ジュース寒天プレートを配置します。ガラス皿にティッシュ ペーパーがはつポイントにジエチル エーテルを追加し、皿に残りの液体エーテルの層があります。すべての回で蓋をしてください。
   2. 中心部で 27 日、石油一滴ハロカーボンのスライド グラスを準備します。後、coverslip をサポートするスライドの 4 つのコーナーに真空用グリースの 4 点を追加します。
   3. 鉗子を使用して、洗浄幼虫をピックアップし、60 mm のガラス皿に寒天プレート上に配置します。その蓋とガラスの皿をカバーし、幼虫が移動しなくなるまで待ちます。PNS 傷害/イメージング、しっぽがけいれんを停止すぐに幼虫を取り出します。全体の幼虫が動かず、なるまで待ちます、中枢神経系、特に頭のセグメント。
      注: エーテルの暴露のタイミングは重要です。ディスカッションを参照してください。
   4. 慎重に麻酔下の幼虫をピックアップし、スライドのハロカーボン油滴に頭アップライトに配置。スライド上に coverslip を追加します。それが幼虫 (図 1 a) に触れるまで、coverslip のプッシュ ダウンする穏やかな圧力を使用します。
   5. 興味のニューロン/軸索・樹状突起が上部と顕微鏡レンズに最も近いなるよう優しく、幼虫をロールバックする左右に向かって coverslip を押すことによって幼虫の位置を調整します。
   6. PNS の傷害のため、両方の気管が見えるように、幼虫の背側をマウントします。クラス III の da のニューロンの軸索 (図 1 b と 1 C) やクラス IV の da のニューロンの軸索 (図 1 b ・ 1 e) が負傷のため 90 度 〜 30 度クラス IV da ニューロン樹状突起 (が負傷したために負傷、左に 〜 30 度、幼虫を回してください。図 2 a)。
   7. 中枢神経損傷の関心領域は z 平面の顕微鏡のレンズに最も近い (図 3 a) を完全に腹側に幼虫を配置します。
3. 2 光子励起による傷害
   1. 顕微鏡下で幼虫とスライドを配置し、ステージ上にスライド ホルダー付け場所に固定します。幼虫を見つけるに使用、10 X (0.3 NA) 目的。
   2. Coverslip の上に目的のオイルを 1 滴を追加、(1.3 NA) X 40 に切り替える目的とフォーカスを調整します。
   3. スキャン モードに切り替えるし、 2 P GFP 930 アブレーションの実験のプロトコルを再利用します。ピンホールの開いたすべての方法を確認します。
      注: 構成を最適化する個々 のシステムに基づく必要があります。
   4. 利益率 (ROI) の地域を検索するLiveモードを起動し、適切なズームと良いイメージ品質を達成するために設定を微調整します。
      注: この手順の目的は、最高品質の画像を撮影するのではなくには怪我、ニューロン/軸索・樹状突起を見つけることです。したがって、露出オーバーまたは退色を避けるためにターゲット領域を視覚化するのにのに十分な最低限の設定を使用します。
   5. ライブスキャンを停止して、[トリミング] ボタンが利用可能になります。ロードマップとして静止画をしましょう。クロップ機能を選択し、負傷することターゲットに焦点を当てるスキャン ウィンドウを調整します。
   6. 傷害の将来のサイトのサイズに投資収益率を減らします。たとえば、軸索や樹状突起、傷害の精度を確保し、隣接組織への損傷を減らすの幅をちょうどカバーします。必要な場合にズームイン ROI トリミングする前により正確な損傷を可能にします。
   7. 新しい画像ウィンドウを開きます。スキャン速度を低減し、レーザー強度を高めます。Liveモードでスキャンされた組織蛍光信号を用いたレーザー光源の強度の増加を確認します。
   8. 通常、PNS の傷害のための 25% と VNC 傷害のための 50-100% から始まって 2 光子レーザーの強度を設定します。PNS 軸索損傷 〜 480 mW とピクセル レーザー強度があることを確認のドウェル時間は 8.19 μ s。VNC の軸索損傷、レーザー強度とピクセルの滞留時間は、通常 965-1930 年 mW 8.19 32.77 μ s、それぞれを確認します。
   9. 連続スキャンを開始します。連続ボタンの上にマウスを移動するカーソルをまま。画像を注視し続けるし、蛍光性の大幅な増加が観察されるとすぐにスキャンを停止します。
      注: 蛍光スパイクの外観は傷害のサイトで自動蛍光によるものです。
   10. 設定を再利用する、ライブ モードに切り替えます。フォーカスを調整することによって、ターゲットにだけ興味の領域を見つけます。
       注: 成功した傷害の良い指標は、小さなクレーター、リングのような構造、または傷害のサイトでローカライズされた破片の外観です。
   11. 次のニューロンに移動し、単一動物の複数のニューロンを傷つける 3.3.5、ステップからを繰り返します。または、徐々 に能力を高めることおよび/または初期傷害が十分でなかった場合、スキャン速度を下げる、3.3.5 の手順を繰り返します。
       注: レーザー パワーがあまりにもケースで高、大規模な被災地に表示されます受傷後ライブ スキャン画像。あまりにも多くの傷害は、幼虫の死亡を引き起こす可能性があります。
   12. 慎重に、coverslip の取り外しと酵母ペーストで新しい板に負傷した幼虫を転送して幼虫を回復します。寒天プレートに鉗子; いくつかの洞窟を溝します。また、プレートの中のクロール幼虫の可能性を減らすために、全体の板を使用する代わりに板で寒天培地の島を行います。
   13. 60 mm のペトリ皿にウェットティッシュ (0.5% プロピオン酸溶液に浸した) と部屋の温度または 25 ° C で培養皿を置く
       メモ: (22 ° C) 室温 25 ° C でに比べてで余分 1 日約幼虫の段階でその幼虫のまま、
4. 受傷後の共焦点レーザー顕微鏡
   1. 麻酔と、共焦点レーザー イメージング手順 3.2 のように取り付けの手順を同じ幼虫を準備することによって必要な時点で負傷した幼虫の画像。
      注: 軸索損傷を確認する (AI) 受傷後 24 h、48 h AI (クラス IV da ニューロン) または 72 h 再生を評価する AI (クラス III da ニューロン) 幼虫をイメージします。
   2. (0.8 NA) X 25 に切り替えて対物レンズ 10 倍を使用して幼虫を見つける目的。GFP のイメージング実験的プロトコルを再利用します。
   3. Liveボタンをクリックし、以前に負傷した同じニューロンを見つけます。
   4. ライブ スキャン ウィンドウ内の最初と最後の Z 位置を設定します。停止を押し Z スタックのイメージを取得する開始の実験ををクリックします。
      注: は、再生の定量化が可能なイメージをキャプチャするときに正規化ポイント (軸索収束ポイント) が含まれることを確認してください (図 1、1 階)-詳細については、データ分析セクションで詳しく。
   5. 画像処理に切り替える、ちょうど撮影した画像を選択し、最大強度投影を生成します。Z スタックと最大強度投影画像を保存します。

4. データ解析

1. 処理してイメージング ソフトウェアや ImageJ のいずれかを使用してイメージを定量化します。
2. PNS の軸索再生の定量化
   1. 再生率、破壊されたすべての軸索の間で軸索の再生のパーセントを参照するを計算します。限り、それは損傷部位を超えて剥げを再生として軸索をスコアします。
   2. メジャーの再生の長さ、軸索の長さの増加であります。ImageJ の定量化、再生軸索をトレースする分割線] ツールを使用し、分析のドロップ ダウン メニューで再生軸索を表す線の長さを取得するメジャーを使用します。
   3. 計算再生インデックス、正規化された軸索の長さの増加であります。
      注: 軸索の長さは、細胞体と軸索収束ポイント (航空機)-軸索の長さ/DCAC (図 1および1 f) の間の距離によって正規化されます。この値は、幼虫のスケーリングのため、任意の軸索成長のためアカウントをのに役立ちます。正の値は、再生を表す、 0の値は、再生を意味、撤回を意味する負の値。
3. 樹状突起再生の定量化
   1. 再生割合計算、それらのすべての切断の間の da ニューロンのパーセントである明白な樹状突起再生を示す。
      注: 樹状突起再生にスコア撤回の樹状の幹から、損傷部位を超えて場合新しい肯定的な樹状突起を再生するとします。傷害のサイト歴史的建造物、およびいくつかのケースでは、残留傷害による蛍光のため容易に目に見える。
   2. ブランチ ポイントの増加が傷害の後新しい樹状突起分岐ポイントの加算カウントを計算します。
   3. 計算総樹状突起の長さの増加負傷後に追加すべての新しい樹状突起の長さは合計であります。
4. 中枢神経系の軸索再生の定量化
   注: 病変のサイトは、最初の時間のポイントでイメージ (図 3 b) 変性を示している場合は、再生の長さとレートの分析に含まれるが。
   1. メジャーの再生の長さ、刈株の軸索の長であります。
      メモ: 単一病変サイトの刈株の軸索は、怪我する前に元の軸索ルートを発してとして識別されました。
   2. 正規化再生長、交連セグメント - 交連 (図 3 aと3 bでは"Y") の間の縦方向の間隔の長さと再生の長さを正規化を計算します。
      注: この値幼虫サイズの違いの影響の正しいことができます。
   3. 再生率、特定遺伝子型の再生能力を反映するように、破壊されたすべてのセグメント間でセグメントを再生の割合を計算します。

結果

Da ニューロンの差動再生クラス特異性と同様、末梢および中枢神経系の可能性を示し。これは、画面の再生 (クラス IV 中枢神経損傷とクラス III PNS 傷害) の抑制と同様、(クラス IV PNS 傷害を使用)、軸索再生に必要な新規の要因にユニークな機会を提供します。

PNS の軸索再生

た?...

ディスカッション

フライのセットアップを通過するとき女性と男性の使用数、遺伝子型と特定の実験に必要な幼虫の数によって異なります。WT ハエには、典型的なクロスは、女性 10 名、男性 5 を使用します。コレクション ウィンドウは、必要な幼虫時代の精度によって絞り込まれる可能性があります。たとえば、2 h コレクション期間より同種の人口の幼虫が得られます。この場合、十字架を設定する 20 また...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L	VWR	97062-948
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Grape juice	Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)	VWR	64-17-5
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent