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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit der Drosophila sensorischen Neuron - dendritischen Arborization (da) Verletzungen Modell Neuron, das in Vivo verbindet live imaging, zwei-Photonen-Laser Axotomie/Dendriotomy und die mächtigen fliegen genetische Toolbox, als eine Plattform für das screening potenzieller Projektträger und Inhibitoren der Neuroregeneration.

Zusammenfassung

Die nachwachsen Kapazität des beschädigten Nervenzellen regelt Neuroregeneration und funktionelle Wiederherstellung nach Trauma Nervensystem. In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene intrinsische und extrinsische hemmende Faktoren bei der Einschränkung der Axon Regeneration identifiziert. Jedoch reicht nicht einfach entfernen diese hemmenden Hinweise für erfolgreiche Regeneration, zeigt das Vorhandensein von zusätzlichen regulatorischen Maschinen. Drosophila Melanogaster, Drosophila, teilt sich evolutionär konservierte Gene und Signalwege mit Wirbeltiere, einschließlich des Menschen. Die Kombination der starke genetische Toolbox von Fliegen mit zwei-Photonen-Laser Axotomie/Dendriotomy, beschreiben wir hier die Drosophila sensorischen Neuron – dendritischen Arborization (da) Verletzungen Modell Neuron als Plattform für das screening von systematisch für Roman Regeneration-Regulatoren. Kurz, beinhaltet dieses Paradigma (a) die Vorbereitung der Larven, (b) Läsion Induktion, Dendrite(s) oder Axon(s) mit einem zwei-Photonen-Laser, c) lebende confocal imaging posttraumatischen und (d) Datenanalyse. Unser Modell ermöglicht hoch reproduzierbare Verletzungen single beschrifteten Neuronen Axone und Dendriten der klar definierte neuronale Subtypen im peripheren und zentralen Nervensystems.

Einleitung

Die Unfähigkeit der Axone nach einer Schädigung des Zentralnervensystems (ZNS), regenerieren kann zu dauerhaften Behinderungen bei Patienten führen, und spielt auch eine Rolle in der irreversiblen neurologischen Defiziten in Neurodegenerative Krankheiten1,2 ,3,4,5. Die CNS-Umwelt, sowie die Fähigkeit der inneren Wachstum von Neuronen, bestimmt, ob Axone sind in der Lage, nach dem Trauma zu regenerieren. Extrazelluläre Faktoren von Oligodendrozyt, Astroglial und handelt Quellen haben gezeigt, dass neuronale Wachstum4,6,7,8, sondern die Beseitigung dieser Moleküle zu behindern nur ermöglicht für begrenzte sprießen5. Intrinsische Regeneration Signale beeinflussen regenerativen Erfolg5,9 und mögliche therapeutische Ziele zu vertreten, aber diese Prozesse auf molekularer Ebene noch nicht gut definiert sind. Erhöhung der trophischen Faktor Signalisierung oder Beseitigung von endogenen Bremsen, wie z. B. die Pten Phosphatase10können bei axonalen Regeneration unter bestimmten Umständen führen. Kombinationen verschiedener Methoden individuell wirksam erwiesen bieten auch nur begrenzte allgemeine Erholung bisher11,12,13,14. Deshalb dringend zusätzliche Wege für eine gezielte Therapie zu identifizieren. Neben der Einleitung eines Axon Regrowth ob und wie die Axone umverdrahtet werden an das richtige Ziel, Reform Synapse Spezifität und erreichen Funktionelle Wiederherstellung sind wichtige Fragen unbeantwortet.

Zusammenfassend lässt sich sagen ist Stand der Erkenntnisse über die Maschinen diktieren Axon Regeneration noch sehr lückenhaft. Ein Teil des Problems ist die technische Schwierigkeit des Studiums Axon Regeneration bei Säugetieren in Echtzeit, ein Ansatz, kostspielig, zeitaufwändig und anspruchsvoll für die Durchführung von umfangreichen genetischen Bildschirme ist. Drosophila Melanogaster, andererseits, erweist sich ein außerordentlich leistungsfähiges System für die Untersuchung von komplexen biologischen Fragen. Die Fruchtfliege war maßgeblich an der Definition von Genen und Signalwege, die auffallend beim Menschen konserviert sind und wurde ein erfolgreiches Modell für die Erforschung der menschlichen Bedingungen, z. B. neurodegenerativer Erkrankungen, durch die riesige Molekulargenetik-Werkzeuge gen Funktion15bearbeiten zur Verfügung. Insbesondere gelten Fruchtfliegen als ein ideales Werkzeug für die Entdeckung von Genen, die in den neuronalen Verletzungen und nachwachsen15,16. Mehrere Fliegen neuronalen Verletzung Modelle wurden entwickelt, einschließlich der Erwachsenen-Kopf oder Larven ventrale Nerv Schnur (VNC) stechen mit Nadeln, larval VNC oder Nerv Crush mit Zange, larval Neuron Laser Axotomie, olfaktorischen Rezeptor Neuron Entfernung Explantaten Hirnverletzungen, und peripheren Nerven Läsion durch Flügel Abfindung15,17,18,19,20,21,22,23. Aufregend, haben neuere Arbeit mit Drosophila Verletzungen Modelle erweitert unser Verständnis der zellulären und genetischen Wege durch das Nervensystem zum reagieren auf neuronalen Verletzungen, von denen einige gezeigt worden, um bei Säugetieren24 konserviert werden ,25. Wieder betont dies das diesem Modellorganismus für die Identifizierung neuartiger Mechanismen der neuronalen Reparatur-Dienstprogramm.

Hier beschriebene ist ein zwei-Photon Laser-basierten Drosophila Larven sensorischen Neuron Verletzungen Modell. Ein zwei-Photonen-Laser wurde zuerst verwendet, um Axone im Zebrafisch in Vivo in 200326geschnitten. Im selben Jahr wurde der erste Laser-Dendriotomy in Drosophila mit einem gepulsten Stickstoff Laser27aufgeführt. Kurz danach verwendet mehrere C. Elegans Labore Femtosekundenlaser, um Modelle von Axon Regeneration28zu etablieren. Im Jahr 2007 Wu und Kollegen verglichen und die Unterschiede zwischen Laser Verletzungen in C. Elegans induziert durch verschiedene Arten von Laser-29gemeldet. Im Jahr 2010 wurde Axon Regeneration nach Laser Axotomie erstmals gezeigt in Drosophila30auftreten. Aufbauend auf dieser umfangreichen Laser Verletzungen Literatur, entwickelten wir eine Fliege neuronalen Verletzungen-Modell mit der zwei-Photonen-Laser, der präzise Induktion Verletzungsgefahr für Ziel-Websites mit minimaler Störung benachbarter Gewebe ermöglicht, bietet eine relativ saubere System, die inneren und äußeren Eigenschaften der Neuroregeneration mit einzelligen Auflösung zu studieren. Insbesondere haben wir sowohl im peripheren Nervensystem (PNS) eine Reihe von Verletzungen Methoden zur sensorischen Neuronen dendritischen Arborization (da) gegründet und ZNS. Da Neuronen können in vier verschiedene Klassen zeichnen sich in erster Linie durch ihre Dendriten verzweigen Komplexität gruppiert werden: Klasse I bis IV31. Unsere veröffentlichten Arbeiten zeigen, dass da Neuron Regeneration Säugetier-Verletzungen Modelle phänotypische und molekulare Ebene ähnelt: da Neuronen spezifische Regeneration Klasseneigenschaften mit Klasse IV angezeigt, aber nicht Klasse I oder III da Neuronen ausstellenden Regeneration in der PNS; Klasse IV da Neuronen Axone regenerieren robust in der Peripherie, sondern ihr regeneratives Potential wird deutlich reduziert, im ZNS, so ähnlich Dorsal Root Ganglion (DRG) Neuronen bei Säugetieren; Verbesserung der mTOR Aktivität über Pten verbessert Löschung oder Akt Überexpression Axon Regeneration in der Fliege CNS19. Mit Hilfe dieser Verletzung Modell, wir haben Durchführung von genetischen Bildschirme und identifiziert RNA Verarbeitung Enzym Rtca als evolutionär konservierte hemmenden Faktor für Axon Regeneration, Verknüpfung von Axon Verletzungen mit zellulären Stresses und RNA-Modifikation20 .

Im vorgestellten-Paradigma wird die Verletzung per Laser Axotomie/Dendriotomy Larven Klasse IV oder III da Neuronen, gekennzeichnet durch Ppk-CD4-TdGFP oder 19 12 Gal4, UAS-CD4-TdGFP, Repo-Gal80, bzw. induziert. Die Schädigung erfolgt auf 2Nd , 3rd Instar Larven bei rund 48-72 h nach der Eiablage (h AEL). PNS richtet Axotomie Läsion zum Abschnitt Axon ~ 20-50 µm vom Zellkörper, CNS Axotomie auf einer Fläche von ~ 20 µm im Durchmesser an der Kommissur-Kreuzung in die VNC und Dendriotomy zu den primären dendritische Verzweigung Punkten. Die gleichen Neuron abgebildet in 8-24 h nach einer Verletzung (AI), vollständige Durchtrennung zu bestätigen und in 48-72 h AI Regeneration zu beurteilen. Durch Time-Lapse confocal Imaging können die Degeneration und Regeneration der einzelnen Axone/Dendriten, die verletzten in Vivo wurden im Laufe der Zeit überwacht werden.

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Protokoll

1. Vorbereitung des Kultur-Platten und Flaschen

  1. Herstellung von Traubensaft Agarplatten
    1. Fügen Sie 10 g Agar Pulver, 200 mL Traubensaft Saft und 192 mL DdH2O in ein Becherglas und eine Mikrowelle für ca. 4-5 min, rühren, zeitweise bis Agar vollständig gelöst ist.
    2. In einer Dampfhaube Abkühlen der Lösung auf ca. 60 ° C. Fügen Sie 4,2 mL 95 % igem Ethanol und 4,0 mL Eisessig. Das Gesamtvolumen der Lösung 400 mL mit DdH2O. Mix gut anpassen.
    3. Fügen Sie für jede 35-mm-Platte ca. 2-3 mL der Lösung. Ca. 120-150 Platten für insgesamt 400 mL Traubensaft Agar Lösung zu machen.
    4. 10 min. abkühlen lassen die Platten und festigen die Agar-Lösung warten. Der Traubensaft Agarplatten in selbst verschlossenen Ziplock Beutel packen und bei 4 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.
  2. Vorbereitung von Drosophila -Kultur-Flaschen
    1. Verwenden Sie eine Klinge, um ein 1,5 cm Seite Länge dreieckiges Loch an der Wand der Drosophila -Kultur-Flasche und füllen das Loch mit einer 2-2,5 cm Durchmesser Kugel aus Baumwolle für die Belüftung.
    2. Schließen Sie die Flasche mit einem Traubensaft Agarplatte mit etwa 0,5 cm3 Hefe Paste ergänzt.

2. Sammlung von Drosophila -Larven

  1. Richten Sie die Kreuze der Erwachsenen fliegen
    1. Platz 10 jungfräulichen Weibchen und 5 männlichen Erwachsenen fliegt zusammen in einer kulturflasche mit einem Traubensaft nährbodenplatte angeschlossen.
    2. Legen Sie die Flaschenböden oben bei 25° C, so dass fliegen auf den Traubensaft nährbodenplatte Eiablage werden. Ändern Sie die Platte mit Hefe Paste mindestens einmal am Tag. Beginnen Sie für einen Zeitraum von 2-h-Sammlung, der erlaubt, die Ernte der Larven von einem homogenen Entwicklungsstadium mit mehr als 20 jungfräulichen Frauen und 10 Männer im Schritt 2.1.1.
    3. Kultur der Platte bei 25° C in einer 60 mm Petrischale mit einem feuchten Tuch, z. B. in 0,5 % Propionsäure Lösung getränkt. Ordnen Sie das Gewebe, so dass es keine Sauerstoffzufuhr blockiert.
      Hinweis: Die Propionsäure-Lösung dient zur Luftfeuchtigkeit in die Schüssel und das Wachstum von Schimmel zu vermeiden.
  2. Larven von einem bestimmten Alter zu ernten
    1. Verwenden Sie ein paar Zangen Larven der gewünschten Stufe, z. B. 2Nd , 3rd Instar Larven in 48-72 h nach der Eiablage (AEL) übertragen, um eine neue Traubensaft nährbodenplatte ohne Hefe einfügen.
    2. Entfernen der Hefe aus den Larven Haut indem man sie kriechen um auf die neue Platte, um potenzielle Störungen der Hefe Laser Axotomie und Bildgebung zu verhindern. Alternativ reinigen Sie gründlich die Larven durch in eine Schüssel mit PBS waschen und Trocknen kurz auf ein Stück Seidenpapier.

3. zwei-Photon Verletzungen und Confocal Imaging

  1. Mikroskop-setup
    Hinweis: Ein konfokale Laser-scanning-Mikroskop mit einem zwei-Photonen-Laser wurde für dieses Experiment verwendet, aber andere Systeme mit einer gleichwertigen Einrichtung werden auch genügen. Die zwei-Photonen-Laser (930 nm) diente für die Bereitstellung von Verletzungen und ein Argonlaser (488 nm) diente für die konfokale Bildgebung der GLP.
    1. Schalten Sie zu Beginn jeder Sitzung die zwei-Photonen-Laser und/oder die konfokale Laser und das Mikroskop. Öffnen Sie die imaging-Software.
    2. Für zwei-Photonen-Verletzungen, richten Sie die folgenden Parameter für imaging GFP mit der zwei-Photonen-Laser bei 930 nm (1.950 mW).
      1. -SELECT-Kanal-Scan-Modus. Das Loch ganz eröffnen. Laserintensität auf ~ 20 % zu erhöhen (390 mW).
      2. Wählen Sie den Frame Scan 512 x 512. Maximale Scan-Geschwindigkeit (in der Regel mit der Pixel-Verweilzeit auf 0,77 µs) verwenden. Stellen Sie sicher, dass die durchschnittliche Anzahl 1 und Bit-Tiefe 8 Bit ist.
      3. Verstärkung bis ca. 750 und den Versatz auf 0 festlegen.
      4. Speichern Sie diese voreingestellte experimentelle Protokoll als 2P GFP 930 Ablation, erlaubt einfache Wiederverwendung in Zukunft experimentiert.
    3. Für die konfokale Bildgebung, richten Sie die folgenden Parameter für imaging-GLP mit dem Argon-Laser bei 488 nm:
      1. Wählen Sie die Registerkarte " Erwerb " und dann Z-Stapel.
      2. Schalten Sie unter "Laser" für den 488 nm Argonlaser.
      3. Gehen Sie auf Kanäle, wählen Sie den Laser 488 mm, und die Laserleistung auf 5-10 % zu erhöhen. Benutzen Sie für das Loch, 1-2 luftig (AU). Passen Sie die Verstärkung auf 650.
      4. Wählen Sie im Akquisitionsmodus1024 x 1024 als Frame Scan aus, verwenden Sie die maximale Scan-Geschwindigkeit, eine durchschnittliche Anzahl von 2 und Bittiefe von 8 Bit.
      5. Speichern Sie diese voreingestellte experimentelle Protokoll als GFP Imaging.
  2. Larven Narkose mit Diethylether und Montage
    1. Legen Sie unter einem Abzug einer 60 mm Glasschale in einem 15 cm Kunststoff Petrischale. Falten und legen ein Stück Seidenpapier am unteren Rand der Glasschale, dann legen Sie eine Agarplatte Traubensaft auf das Gewebe. Fügen Sie Diethylether in der Glasschale, bis zu dem Punkt wo das Seidenpapier ist durchnässt und gibt eine Schicht flüssigen Äther noch in die Schüssel. Halten Sie den Deckel auf, zu allen Zeiten.
    2. Bereiten Sie einen Objektträger mit einem Tropfen Halocarbon 27 Öl in der Mitte. Fügen Sie 4 Spots Vakuum Fett auf den vier Ecken der Folie, um später das Deckglas zu unterstützen.
    3. Verwenden Sie Zange zu holen eine gereinigte Larve und legen Sie es auf der Agarplatte in 60 mm Glasschale. Bedecken Sie die Glas Schüssel mit Deckel und warten Sie, bis die Larve nicht bewegt mehr. Nehmen Sie für PNS Verletzungen/Imaging die Larve, sobald seine Rute zucken aufhört. Für die CNS warten, bis die gesamte Larve bewegungslos und wird vor allem der Kopf Segmente.
      Hinweis: Das Timing der Äther Exposition ist entscheidend. Siehe Diskussion.
    4. Vorsichtig den narkotisierten Larve abholen und Kopf aufrecht in den Tropfen Öl Halocarbon auf die Folie legen. Fügen Sie ein Deckglas auf der Folie. Verwenden Sie sanften Druck auf das Deckglas nach unten drücken, bis es die Larve (Abbildung 1A) berührt.
    5. Passen Sie die Larve Position durch leichten Druck das Deckglas in Richtung links oder rechts, die Larve zu Rollen, damit das Neuron/Axon/Dendriten von Interesse auf der Oberseite und am nächsten an das Mikroskop-Objektiv ist.
    6. Montieren Sie für PNS Verletzungen die Larve dorsalen Seite, so dass beide die Tracheas sichtbar sind. Dann Rollen Sie die Larve ~ 30 Grad nach links, um verletzte Klasse III da Neuronen Axone (Abbildung 1 b und 1 C), 90 Grad für Klasse IV da Neuronen Axone (Abbildung 1 b und 1E) zu verletzen oder ~ 30 Grad für Klasse IV da Neuron Dendriten (zu verletzen Abbildung 2A).
    7. Positionieren Sie für CNS Verletzungen die Larve zu perfekt ventralen Seite nach oben (Abb. 3A), so, dass die Region von Interesse am nächsten an das Mikroskop-Objektiv in der Z-Ebene ist.
  3. Verletzungen durch zwei-Photonen-laser
    1. Legen Sie die Folie mit der Larve unter dem Mikroskop und befestigen Sie es mit den Diahalter auf der Bühne. Verwendung der 10 X (0,3 NA) Ziel der Larve zu finden.
    2. Geben Sie 1 Tropfen des objektiven Öl auf das Deckglas, wechseln Sie zu den 40 X (1,3 NA) Ziel und den Fokus einzustellen.
    3. Wechseln Sie in den Scan-Modus und wiederverwenden Sie das experimentelle Protokoll 2P GFP 930 Ablation. Stellen Sie sicher, dass das Loch ganz geöffnet ist.
      Hinweis: Die Konfiguration muss optimiert werden, basierend auf einzelnen Systemen.
    4. Starten Sie den Live -Modus, um die Region of Interest (ROI) zu finden und die Feinabstimmung der Einstellungen um gute Bildqualität mit den entsprechenden Zoom zu erreichen.
      Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist das Neuron/Axon/Dendrit zu verletzen, anstatt die bestmögliche Bildqualität zu finden. Verwenden Sie daher die minimalen Einstellungen ausreichen, um das Zielgebiet zu visualisieren, zur Vermeidung von Überbelichtung oder Immunofluoreszenz.
    5. Live Scan zu stoppen, so dass die Schaltfläche Zuschneiden verfügbar sein werden. Lassen Sie das Standbild als Fahrplan dienen. Wählen Sie die Crop -Funktion und passen Sie das Scanfenster zu konzentrieren das Ziel verletzt werden.
    6. Verringern Sie den ROI die Größe des zukünftigen Standortes Verletzungsgefahr. Zum Beispiel nur decken Sie die Breite von einem Axon oder einem Dendriten, die Präzision der Verletzung zu gewährleisten und Schäden an benachbarten Geweben zu reduzieren. Falls gewünscht, vergrößern Sie den ROI vor dem Ausschnitt, ermöglicht eine präzisere Verletzungen.
    7. Öffnen Sie ein neues imaging Fenster. Reduzieren Sie die Scangeschwindigkeit und steigern Sie Laserintensität. Bestimmen Sie die Erhöhung in Laserintensität basierend auf das Gewebe-Fluoreszenz-Signal im Live -Modus gescannt.
    8. In der Regel stellen Sie die zwei-Photonen-Laserintensität ab 25 % für PNS Verletzungen und 50-100 % für VNC Verletzungen. Für PNS Axon Verletzungen, sicherzustellen, dass die Laserstärke ~ 480 mW und Pixel Verweilzeit beträgt 8,19 μs. Sicherzustellen Sie für den VNC Axon Verletzungen, dass die Laser Intensität und Pixel Verweilzeit in der Regel 965-1930 mW und 8.19-32,77 μs, beziehungsweise.
    9. Starten Sie kontinuierliches Scan. Lassen Sie den Cursor über die Schaltfläche " Continuous " schweben. Halten Sie ein wachsames Auge auf das Bild und stoppen Sie den Scan zu, sobald eine drastische Zunahme der Fluoreszenz beobachtet wird.
      Hinweis: Die Darstellung der Fluoreszenz-Spike ist durch Auto-Fluoreszenz am Verletzung Aufstellungsort.
    10. Wechseln Sie zurück zu den Live-Modus durch die Wiederverwendung der Einstellungen. Finden Sie die Region von Interesse, die nur durch eine Anpassung des Fokus bestimmt waren.
      Hinweis: Ein guter Indikator für erfolgreiche Verletzungen ist das Aussehen eines kleinen Krater, ringförmige Struktur oder lokalisierte Schmutz direkt am Verletzung Aufstellungsort.
    11. Verschieben Sie an die nächste Nervenzelle und wiederholen Sie ab Schritt 3.3.5, um mehrere Neuronen in ein einziges Tier zu verletzen. Oder wiederholen Sie Schritt 3.3.5 und schrittweise Erhöhung der Leistung und/oder Scan-Geschwindigkeit verringern, wenn die ursprüngliche Verletzung nicht ausreichte.
      Hinweis: In dem Fall, dass die Laserleistung zu hoch, beschädigte großflächig in der posttraumatischen live Bild sichtbar werden. Zuviel Verletzungen verursachen den Tod von der Larve.
    12. Wiederherstellen Sie die Larve durch sorgfältig herausnehmen das Deckglas und die verletzte Larve auf eine neue Platte mit Hefe Paste. Graben Sie mehrere Höhlen auf der Agarplatte mit Zange; Stellen Sie alternativ eine Insel der Agar in der Platte anstatt die ganze Platte, um die Möglichkeit, die Larve kriecht aus der Platte zu reduzieren.
    13. Setzen Sie die Platte in einer 60 mm Petrischale mit feuchten Tuch (mit 0,5 % Propionsäure Lösung getränkt) und Kultur bei Raumtemperatur oder 25° C.
      Hinweis: Die Larve bleibt im Larvenstadium ungefähr einen Tag bei Raumtemperatur (22 ° C) im Vergleich zu bei 25 ° C.
  4. Nach der Verletzung konfokale Bildgebung
    1. Bild der verletzten Larve zu gewünschten Zeitpunkten durch die Vorbereitung der Larve mit dem gleichen Verfahren der Anästhesie und Montage wie in Schritt 3.2, dann mit der konfokalen Laser imaging.
      Hinweis: Bild die Larve bei 24 h nach einer Verletzung (AI), axonale Schädigung zu bestätigen und in 48 h AI (Klasse IV da Neuronen) oder 72 h AI (Klasse III da Neuronen) Regeneration zu beurteilen.
    2. Suchen Sie die Larve mit der 10 X-Objektiv, dann wechseln Sie zu einem 25 X (NA 0,8) Ziel. Wiederverwenden Sie das experimentelle Protokoll GFP Imaging.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche " Live " und finden Sie die gleichen Neuron zuvor verletzt.
    4. Legen Sie die ersten und letzten Z-Positionen im Fenster "live-Bild". Drücken Sie Stopp, und klicken Sie auf Start zu experimentieren , um ein Z-Stapel-Bild zu erhalten.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass ein Normalisierung Punkt (dem Axon konvergierenden) enthalten ist, wenn Bilder zu erfassen, so dass Quantifizierung der Regeneration möglich ist (Abbildung 1, 1F) – Dies wird diskutiert weiter im Datenabschnitt-Analyse.
    5. Wechseln Sie zur Bildverarbeitung, wählen Sie das Bild einfach genommen und generieren Sie eine maximale Intensität Projektion zu. Speichern Sie die Z-Stapel und die maximale Intensität Projektion von Bildern.

(4) Datenanalyse

  1. Verarbeiten und Quantifizierung der Bilder mit der imaging-Software oder ImageJ.
  2. Quantifizierung der Axon Regeneration im PNS
    1. Prozentsatz der Regeneration, der bezieht sich auf den Prozentsatz der regenerierende Axone unter die Axone, die lesioned waren zu berechnen. Punkten Sie einem Axon als regenerieren, solange es über Verletzung Aufstellungsort nachwächst.
    2. Maßnahme Regeneration Länge, die die Zunahme der Axon Länge ist. Wenn mit ImageJ quantifizieren, verwenden Sie Segmentierte Linien -Werkzeug, um die regenerierten Axon verfolgen und verwenden Sie Messen in die Analyze -Drop-Down-Menü, um die Länge der Linie, die die regenerierte Axon zu erhalten.
    3. Regeneration-Index, ist die Zunahme der normalisierten Axon Länge zu berechnen.
      Hinweis: Axon Länge wird durch den Abstand zwischen den Zellkörper und Axon konvergierenden Punkt (DCAC) – Axon Länge/DCAC (Abbildung 1 und 1F) normalisiert. Dieser Wert hilft jedem axonale Wachstum durch Larven Skalierung. Ein positiver Wert steht Regeneration, ein Wert von 0 bedeutet keine Regeneration und ein negativer Wert bedeutet einfahren.
  3. Quantifizierung der Dendrit regeneration
    1. Berechnen Sie Regeneration Prozentsatz, der den Prozentsatz der da Neuronen unter all jenen durchtrennt ist, die offensichtlich Dendrit Nachwachsen zu zeigen.
      Hinweis: Dendrit nachwachsen wird bewertet, wie positive, wenn neue Dendriten, aus den eingefahrenen dendritischen Stamm und darüber hinaus die Verletzung Aufstellungsort nachwachsen. Verletzung Aufstellungsort ist bestimmt von Sehenswürdigkeiten und in einigen Fällen, ist gut sichtbar durch die restliche Verletzungen-induzierte Autofluoreszenz.
    2. Berechnen Sie der Verzweigungspunkte zu erhöhen, die die Hinzufügung der neuen dendritische Verzweigungspunkte nach Verletzung zählt.
    3. Berechnung der gesamten Dendrit Länge zu erhöhen, ist die kumulative Länge die neue Dendriten, die nach einer Verletzung hinzugefügt.
  4. Quantifizierung der Axon Regeneration im ZNS
    Hinweis: Ein läsionsort Degeneration am ersten Zeitpunkt abgebildet (Abb. 3 b) zeigt, werden bei der Analyse der Regeneration Länge und Höhe aufgenommen werden.
    1. Maßnahme Regeneration Länge, die die Länge der nachwachsenden Axon ist.
      Hinweis: Die nachwachsenden Axon einer einzigen Läsion Website wird identifiziert, da es von der ursprünglichen Route der Axon vor der Verletzung entsteht.
    2. Normalized Regeneration Länge, die die Regeneration Länge auf die Länge des Segments Kommissur - der longitudinalen Abstand zwischen Kommissuren ("Y" in Abbildung 3A und 3 b) normalisiert zu berechnen.
      Hinweis: Dieser Wert hilft für die Wirkung der Larven Größenunterschiede korrekt.
    3. Regeneration-Rate, die den Prozentsatz der regenerierenden Segmente zwischen den Segmenten, die lesioned, entsprechend das Regenerationsvermögen von einem bestimmten Genotyp waren zu berechnen.

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Ergebnisse

Da Neuronen weisen differenzielle Regeneration zwischen den peripheren und zentralen Nervensystems sowie Klasse Spezifität. Dies bietet einzigartige Möglichkeiten für neue Faktoren auf den Bildschirm, die für Axon-Regeneration (mit Klasse IV PNS Verletzungen) sowie die hemmenden zur Regeneration (mit Klasse IV CNS Verletzung und Klasse III PNS Verletzungen) erforderlich sind.

Axon Regeneration im PNS

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Diskussion

Beim Einrichten von Fly kreuzt, variieren je nach den Genotypen und die Anzahl der Larven für bestimmte Experimente benötigt die Anzahl der Weibchen und Männchen verwendet. Für WT fliegen nutzt typische Kreuz 10 Hündinnen und 5 Rüden. Das Sammlungsfenster kann eingeschränkt werden, abhängig von der Genauigkeit der Larven Alter erforderlich. Beispielsweise wird ein 2-h Abholfrist Larven einer homogeneren Bevölkerung Ausbeute. In diesem Fall hilft mit 20 oder mehr jungfräulichen Weibchen die Kreuze einrichten aus...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken Jessica Goldshteyn für den technischen Support. Arbeit im Labor Song wird von der NIH Grant R00NS088211, und die intellektuelle und Developmental Disabilities Research Center (IDDRC) neue Program Development Award finanziert.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrousAcros OrganicsAC615080010
Halocarbon 27 OilGenesee Scientific59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1LVWR97062-948 
Agar powder, Alfa Aesar, 500GMVWRAAA10752-36
Grape juiceWelch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)VWR64-17-5
Acetic acidSigma-AldrichA6283
Propionic AcidJ.T.BakerU33007
Cover Glasses: RectanglesFisher Scientific12-544-D50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscopeZeiss
Zen softwareZeiss
Chameleon Ultra IICoherent

Referenzen

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