JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של האפנון של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac, את ההערכה של השפעתה על בסיסי אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis מחנה dynamics באמצעות התקנה Langendorff ex-vivo .

Abstract

מאז ההמצאה שלו במאהה 19 מאוחר, Langendorff ex-vivo הלב זלוף המערכת ממשיכה להיות לכלי רלוונטי לומד קשת רחבה של פרמטרים פיזיולוגיים, ביוכימי, מורפולוגיים תרופתי ב לבבות denervated מרכזי. כאן, אנו מתארים הכנה של האפנון של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac והערכת השפעתה על בסיסי אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis dynamics אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה). מערכת העצבים האוטונומית intracardiac הוא מווסת על ידי ניתוח מכני פרפור השומן רפידות-גרעיני מאתר שבו ממוקמים בעיקר — או ע י השימוש הכללית, כמו גם יישוב התערבויות תרופתי. קטטר אלקטרופיזיולוגיות octapolar מוחדרים אטריום ימין של החדר הימני, ומשמשים epicardial הציב אלקטרודה מרובה מערכים (מאה) למיפוי ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע אלקטרופיזיולוגיה הלב ואת arrhythmogenesis. פורסטר תהודה העברת אנרגיה (סריג) הדמיה מתבצע ניטור בזמן אמת של רמות מחנה באזורים הלב השונים. Neuromorphology הוא למד באמצעות נוגדן מבוססי מכתים כל לבבות באמצעות סמנים עצביים כדי להדריך את זיהוי אפנון של מטרות ספציפיות של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac במחקרים שבוצעו. ההגדרה Langendorff שמחוץ מאפשר מספר רב של ניסויים לשחזור בתוך זמן קצר. למרות זאת, הטבע פתוחה חלקית של ההתקנה (למשל., במהלך המדידות MEA) מקשה על בקרת טמפרטורה קבועה, יש לשמור עד למינימום. בשיטה המתוארת זו מאפשרת לנתח, לווסת את מערכת העצבים האוטונומית intracardiac בלבבות מבוזרת.

Introduction

Langendorff ex-vivo הלב זלוף המערכת ממשיכה להיות כלי רלוונטי לביצוע קשת רחבה של פיזיולוגיים, ביוכימי, מורפולוגיים, מחקרים ב מרכזי denervated לבבות1,2 ,3,4,5 מאז ההמצאה שלו ב מאוחר 19th המאה6. נכון להיום, מערכת זו נמצאת בשימוש עדיין נרחב על נושאים שונים (למשל., פגיעה reperfusion איסכמיה) או ללמוד דום לב תרופתי אפקטים7,8, הוא כלי בסיסי מחקר הלב וכלי הדם. תוחלת החיים של שיטה זו היא תוצאה של מספר יתרונות (למשל., מדידות מבוצעות ללא השפעת מערכת העצבים המרכזית או אחרים איברים, מחזור מערכתי, או במחזור הורמונים). אם יש צורך, תרופות ושניתן להוסיף בצורה מבוקרת את המאגר זלוף או חלה על מבנים ספציפיים ישירות. ניסויים לשחזור, מספר גבוה יחסית של ניסויים יכול להתבצע תוך תקופה קצרה של זמן. אופי פתוח (באופן חלקי) ההתקנה יכול להפוך לוויסות טמפרטורת קשה ואני צריכה להילקח בחשבון. למרות שהמערכת Langendorff משמש גם מינים גדולים יותר9, חיות קטנות יותר משמשות בעיקר הגדרת הניסוי הוא פחות מורכב, השתנות ביולוגי גדול יותר (למשל., הטרנסגניים העכבר מודלים) יכול לשמש.

בכיוונון ניסיוני של פרוטוקול זה, היא ההשפעה של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac על פרמטרים בסיסיים אלקטרופיזיולוגיות, arrhythmogenesis חדרית, הולכה epicardial dynamics אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה) הערכה. מספר גדול של הגרעינים intracardiac, אשר ממוקמים בעיקר רפידות השמן פרפור, ידועים כעת לשליטה עצמאית של בקרה עצבית מרכזי הלב אלקטרופיזיולוגיה, הם שגם נשאר שלם או הוסר באופן ידני עם מכונות זהיר הקרע אפנון תרופתי של מערכת העצבים האוטונומית מתבצע באופן גלובלי על-ידי הוספת תרופות למאגר זלוף או באופן מקומי על-ידי אפנון יישוב של הגרעינים פרפור. לאחר הניסויים, הלבבות מתאימים היטב הערכה immunohistological כמו כל תאי הדם הוסר עקב זלוף מתמשך, אשר יכול להגביר את איכות מכתים.

המטרה הכוללת של טכניקות המתואר הוא להציע פרספקטיבות הרומן ללימודי מפורט לגבי ההשפעה של מערכת העצבים האוטונומית על הלב אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis בלב העכבר. סיבה להשתמש בטכניקה זו היא שניתן ללמוד ולשנות את מערכת העצבים האוטונומית ללא ההשפעה של מערכת העצבים המרכזית. אחד היתרונות העיקריים להעסקת קל ניסויים תרופתי, במאפייני איזה פוטנציאל pro - או תרופות ישנות, סוכנים חדשים יכול להיבדק. בנוסף, העכבר הטרנסגניים נוקאאוט מודלים של מחלות לב שונות זמינים לחקור את המנגנונים שבבסיס הפרעות קצב, אי ספיקת לב או מחלות מטבוליות. גישה זו יש משופרת הבנתנו כיצד מערכת העצבים האוטונומית על רמת פרוזדורים יכולים להשפיע אלקטרופיזיולוגיה לב חדרית ומעגל של הפרעות בקצב הלב.

Protocol

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על-ידי הרשויות המקומיות של המדינה של המבורג, טיפול בבעלי חיים אוניברסיטת המבורג שימוש ועדות.

1. הכנת המנגנון Langendorff

הערה: מערכת זמינים מסחרית זלוף Langendorff משמש.

  1. להכין פתרון קרבס-Henseleit שונה (119 מ מ של נתרן כלורי, 25 מ מ של סודיום ביקרבונט, 4.6 מ מ 1.2 מ מ של אשלגן פוספט monobasic, 1.1 מ מ מגנזיום גופרתי, 2.5 מ מ של סידן כלורי, 8.3 מ"מ של גלוקוז, ו 2 מ מ של נתרן, אשלגן כלורי פירובט). להוסיף תערובת של 95% oxygen/5% פחמן דו חמצני הפתרון זלוף למניעת משקעים סידן. לסנן את המאגר עם גודל הנקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
  2. הוסף סוכן תרופתי המאגר כדי לחקור את השפעתו על הלב אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis לפי הצורך.
  3. להתחיל את המים הרותחים ומניחים הפתרון זלוף כולל תערובת של 95% oxygen/5% פחמן דו חמצני בתוכו. להתאים את הטמפרטורה של האמבט במים, כך הטמפרטורה הפתרון זלוף ישירות לפני הצינורית הלעפה תרוטרפמט ~ 37.
  4. . הפעל את המשאבה רולר ולמלא את המנגנון עם הפתרון זלוף ברגע מתמלאת בטמפרטורה הנכונה.
  5. להתאים את קצב משאבת לפני שתצרף את הלב, כך אין בועות אוויר נותרו ב הצינורית כאשר זה גובר על המנגנון.

2. קשה - והכנות תוכנה

  1. חבר מערכת רכישת נתונים דיגיטליים והתוכנה המתאימה שלה Langendorff מכשירי הקלטה רציפה של הלחץ זלוף, קצב הזרימה, קצב הלב.
    1. הגדר את הלחץ זלוף יישוב ב'הגדרות כלליות עד 80 מ מ כספית.
    2. . תתחיל להקליט
  2. השתמש של קטטר electrophysiology (טבלה של חומרים) עם אלקטרודות הפלטינה, על פני האלקטרודה 0.5 x 0.5 מ מ מרווח אלקטרודה של 0.5 מ מ כדי להפוך את נתוני ההקלטה גירוי עם גנרטור גירוי דיגיטלי ייעודי.
    1. מניחים את הצנתר קרוב לאזור שבו ימוקמו הלב לאחר הקובץ המצורף המנגנון.
    2. להכין את הגירוי על-ידי בחירה 2 אלקטרודות הקטטר ולהשתמש באורך המחזור של-100 מילישניות.

3. הכנה של הלב

  1. הוסף את הקור (הלעפה תרוטרפמט ~ 2-4) מאגר זלוף (10-20 mL ו- 40-50 מל ', כך המנה כולה מכוסה) 2 פטרי (קוטר 6 ס"מ, 10 ס"מ), המנה עם בצינורית ואת המקום אותם על קרח ישירות הבאה, תחת המיקרוסקופ. להכין קשר כפול סביב הצינורית.
  2. במהירות לסלק את הלב לאחר נקע בצוואר הרחם באמצעות פתיחת בית החזה בעזרת מספריים מאיו ומלקחיים דפוס צרים. לאחר מכן לאחוז את העורקים ואת הווריד הנבוב מעל הסרעפת עם המלקחיים לונדון, לסלק את הבלוק לב-ריאה על ידי חיתוך כל כלי של רקמת חיבור עמוד השדרה עם המספריים פזילה.
  3. להעביר את גוש לב-ריאה לתוך המנה הראשונה (קוטר 6 ס"מ) מלא עם המאגר הקר, הסר בזהירות את הריאות ללא פגיעה בלב באמצעות מספריים פזילה ומלקחיים לונדון. אז במקום הלב מתחת למיקרוסקופ, הסר בזהירות בלוטת התימוס, ושט קנה הנשימה באמצעות מספריים האביב ומלקחיים דומונט האס. אס.
  4. השתמש את המספריים האביב כדי לחתוך חור של 1.5-2 מ מ בחלק העליון של אטריום ימין על החדרת הקטטר. לחתוך חור בעורק הריאה. לאחר מכן חותכים את העורקים ישירות תחת הענפים supraaortic, להסיר את הרקמה של אבי העורקים, כך הקשר יכול להיות מצורף בקלות.
  5. לשמור את רפידות השמן פרפור, כולל סרן atrially ממוקם plexi ganglionated, סביב אטריום שמאל תקין או להסיר אותם לחלוטין על ידי ניתוח זהיר.
  6. להעביר המנה עם הצינורית בלב ולמקם אותו מתחת למיקרוסקופ. תעצור העורקים הצינורית עם המלקחיים דומונט האס. אס, יהדקו מוכן בחוזקה אבי העורקים. ודא כי הצינורית אינם ממוקמים עמוק מדי באבי העורקים כך את שסתום אבי העורקים ואת כלי הדם הכליליים נותרו ללא תשלום.
  7. לצרף את הצינורית במהירות המנגנון Langendorff. ודא כי ישנם אין בועות עזב את הצינורית.
  8. לעבור את הלחץ זלוף 80 מ מ כספית, ומאפשר זלוף לחץ קבוע.
  9. להוסיף את הצנתר בזהירות לתוך העלייה הימנית ואת החדר הימני בלי לגעת או לפגוע בלב ולצרף את הצנתר הצינורית עם קלטת.
  10. להתחיל הגירוי עם אורך מחזור מוכן 100 ms לתקופה equilibration הראשונית 20 דקות.
  11. סגור את התא כדי לאפשר על טמפרטורה יציבה.

4. אלקטרופיזיולוגיות פרמטרים ו- Arrhythmogenesis

  1. להחיל על גירוי מתוכנת באמצעות האלקטרודות דיסטלי או מקורב של הקטטר פעמיים על מפתן פרפור או חדרית pacing כדי להעריך את הפרמטרים אלקטרופיזיולוגיות כפי שתואר בשלבים הבאים.
    1. לקבוע את זמן ההחלמה של סינוס צומת כמו אורך מרבי מחזור החזרה אחרי 10 s של בריבית קבועה צועד על S1S1 מחזור אורך 120 ms, 100 ms ו- 80 ms.
    2. לקבוע את הנקודה Wenckebach כמו אורך מחזור S1S1 הארוך ביותר (8 גירויים; S1S1: 100 ms; 2 ms הפחתת stepwise) עם הפסד של 11 הולכה קטרי AV. לקבוע את תקופות עקשן קטרי atrioventricular כמו S1S2 הארוך ביותר (12 גירויים; S1S1: 120 ms, 110 ms, בהפרשי; אחד קצר בשילוב extrastimulus עם הפחתה של 2 מילי-שניות stepwise S1S2) עם הפסד של הולכה קטרי AV.
    3. לקבוע התקופות פרפור, חדרית עקשן כמו S1S2 הארוך ביותר (12 גירויים; S1S1: 120 ms, 110 ms, בהפרשי; אחד קצר בשילוב extrastimulus עם הפחתה של 2 מילי-שניות stepwise S1S2) עם מענה נעדר פרפור או חדרית10,11.
  2. לבצע extrastimulation מתוכנתים (S1S1: 120 ms, 100 ms ו- ms 80, ואחריו עד 3 פעימות נוספות; 60-20 ms עם הפחתה של 2 מילי-שניות stepwise) או פרץ צועד פרוטוקולים (5 s ב S1S1: 50-10 ms עם ירידה stepwise 10 ms) בקו אחד עם האמנות ארל'ס קורט כדי אווה luate11,10,12arrhythmogenesis חדרית.

5. מדידות הולכה epicardial

הערה: שיא unipolar epicardial electrograms באמצעות מערכת הקלטה 128 ערוצים, המחשב בסיוע עם קצב הדגימה של 25 קילו-הרץ עבור מיפוי ברזולוציה גבוהה. השתמש מערך מרובה אלקטרודה 32 (MEA; המרחק בין אלקטרודה: מיקרומטר 300; 1.8 x 1.8 מ"מ). שים לב כי הנתונים היו bandpass מסוננים (50 הרץ), דיגיטציה עם 12 סיביות ומגוון אות של 20 mV.

  1. מקום כר הדשא באזור המיועד של הלב ולהוסיף את ההארקה לחלק אחר של הלב13,14,15.
  2. המקום של קטטר גירוי epicardial קרוב כר הדשא ולהתחיל עם גירוי מתמיד.
  3. . תתחיל להקליט לאחר האישור של קשר טוב של האלקטרודות על-ידי בדיקת איכות אות ו משרעת
  4. השתמש ניתוח במצב לא מקוון עבור קביעת מהירות התפשטות הגל, פיזור בכיוון הולכה.

6. פורסטר תהודה להעביר אנרגיה סריג מחזורית אדנוזין Monophosphate (מחנה) דימות מבוסס

הערה: למדידות מבוסס סריג, לקצור לבבות מ חטיבתי-Epac1-מחנות העכברים הטרנסגניים16.

  1. השתמש מערכת הדמיה העצמי נבנה סביב15,stereomicroscope17.
  2. מניחים את stereomicroscope כנגד הלב ולהתאים אותו עבור חדות.
  3. לרגש את החיישן המחנה עם מקור אור [למשל, להשתמש יחיד-גל אור דיודה (440 ננומטר)]. לפצל את פליטת אור לתוך ערוצי התורם ואת מקבל משתמש במפצל קרן (עבור זוג חלבון פלואורסצנטי החלבון הניאון ציאן/צהוב, שימוש 565dcxr מראה ודיקרואיק זוהר, מסננים פליטה D480/30 ו- D535/40).
  4. ודא טמפרטורה יציבה על ידי לשים ניילון נצמד סביב החדר.
  5. קח תמונות באמצעות מצלמה מדעי משלימים מתכת--מוליך למחצה (sCMOS). לתאם את מקור האור ואת לכידת תמונה מצלמה עם מקור פתוח הדמיה תוכנה כמו מיקרו-מנהל.
  6. כדי להתחיל את רכישת התמונה, לדחוף את Multi-D Acq. כפתור ולהגדיר זמן לשגות, אשר רוכש תמונה כל 10 s, עם הזמן החשיפה המתאים, אשר תלוי על כוחו של האות פלורסנט (בסביבות 100 ms).
  7. השתמש בעבר תיאר וזמין תדאג באינטרנט , תדאג 2 באינטרנט תוספים17 כדי לפצל את התמונה שני ערוצים, בחר את האזורים של עניין ולאחר לנטר את העקיבה יחס.
  8. במהלך רכישת, perfuse את הלב עם הפתרון קרבס-Henseleit שונה המכילה חומרים שונים, בהתאם לאופי הניסוי.
  9. בסוף הניסוי, לכבות את הרכישה על-ידי לחיצה על לחצן עצור ולשמור על הערימה של תמונות.
  10. לנתח את הנתונים סריג במצב לא מקוון באמצעות תוכנה ייעודית ניתוח ניתן לפצל לשני חלקים זהים עבור הערוצים התורם ואת מקבל תמונות, באפשרותך לבצע ניתוח סריג לטובת מרובות אזורים-של.
    הערה: ייעודי plug-in (דאגה במצב לא מקוון) נדרשת, אשר ניתנת ספרנג'ר. et al. 17.
    1. הפעל את התוכנה. פתח את הניתוח על-ידי מעבר לתפריט תוספים ולאחר מכן לחץ על MicroManager, ולאחר מכן על פתח קובץ מיקרו-מנהל.
    2. להפעיל את התוסף תדאג במצב לא מקוון כדי לפצל מואץ שתי תמונות זהות עבור הערוצים CFP ו YFP.
    3. השתמש בכלי בחירות חופשיות כדי לסמן את האזור של עניין בתמונה YFP. לחצו על כפתור הוסף כדי להוסיף את הבחירה לחלון מידה מרובה .
    4. בחר אזור עניין בחלון מרובה מידה ולחץ רב להשיג שולחן עם ערכי אפור כלומר עבור כל מסגרת ואזור. העתק והדבק את כל הנתונים לתוך גיליון Excel.
    5. לחץ על אוסף תמונות CFP. לבצע את אותן פעולות כמו שלב 6.10.4 עבור המחסנית CFP ולהדביק את ערכי אפור כלומר באותו גיליון Excel.
  11. לתקן את הנתונים הגולמיים במצב לא מקוון עבור הגורם בליד-דרך של התורם לתוך ערוץ מקבל17.
    1. השתמש הנוסחה הבאה, כאשר B הוא הגורם בליד-דרך:
      יחס = (YFP - B x CFP) / CFP
    2. לקבוע את הגורם בליד-דרך B על ידי הדמיה לב לבטא CFP רק ולמדוד את האחוז של קרינה פלואורסצנטית התורם בערוץ YFP (B = YFP / CFP).

7. Neuromorphology

הערה: ניתוח של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac באמצעות immunostainings כולה-הר לב מאתר ללא פגע. שימו לב כי הרוב המכריע של הגרעינים intracardiac מותאמים את רקמת שומן epicardial קרוב הוורידים ריאתי.

  1. השתמש stainings שונים על תיאור של neurofilament (מבנים עצביים כללי; עוף אנטי-NF-H, 1:3, 000), hydroxylase טירוזין (TH, סימפטי מבנים עצביים; ארנב α TH, 1:1, 000), ו acetyltransferase כולין (צ'אט, הפארא-סימפתטי מבנים עצביים; α עז צ'אט, 1:50).
  2. לאחר זלוף במנגנון Langendorff, לתקן את הלבבות העכבר 10 מ"ל של פורמלין במשך 24 שעות ביממה, לאחסן אותם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 הלעפה תרוטרפמט.
  3. מלבין את הלבבות אקונומיקה של דנט (מתנול 4:1:1: מימן על-חמצני פתרון 30% (w/w) ב- H2o: דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) עבור שבוע 1-4 הלעפה תרוטרפמט, נתרענן אותם לאחר מכן כדי PBS בסדרת יורד מתנול ב- PBS (100%, 75%, 50%, 25%; 1 h) 18.
  4. לבצע את incubations הבאים בתבנית 24-ובכן-צלחת עם עצבנות עדין-הלעפה תרוטרפמט 4:
    1. Permeabilize הלבבות 1% טריטון-X-100/PBS (PBS-T) עבור 3 x 1 h בטמפרטורת החדר לפני חסימת אותם בן לילה במאגר חסימה [5% אלבומין שור (BSA) / PBS-T + אזיד הנתרן 0.2%].
    2. לדלל את הנוגדנים כדלקמן: עז α צ'אט (1:50), ארנב α TH (1:1, 000), עוף α neurofilament (1:3, 000); נוגדנים משניים עבור תוויות פלורסנט (שבערך; או על פי הוראות היצרן); biotinylated נוגדנים משניים עבור תוויות הדפסות כסף (1:200; או על פי הוראות היצרן).
  5. דגירה דגימות של נוגדנים העיקרי מדולל במאגר חסימה לשבוע 1-4 הלעפה תרוטרפמט.
  6. רחץ את ליבם במשך 3 x 15 min ב- PBS-T לפני הדגירה נוגדנים משניים במאגר חסימה למשך 4 ימים.
  7. לשטוף את ליבם במשך 3 x 15 min ב- PBS-T ו לאחסן אותם במדיום הרכבה עבור צביעת פלורסנט עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר או להשתמש ערכת זיהוי מורכבים אבידין-ביוטין בהתאם להוראות היצרן.
  8. מראש דגירה הלבבות עבור h 1 במאגר מסחרי בשביל 3, 3'-diaminobenzidine (DAB), לפני לפתח אותם תחת שליטה ויזואלית מאגר המכיל DAB בהתאם להוראות היצרן.
  9. אחסן את דגימות מים מזוקקים כפול.
  10. עבור מקטעים פרפין, מייבשים, להטביע את הלבבות פרפין.
    1. לחתוך חלקים בעובי 4-מיקרומטר ו deparaffinize אותם על פי הנהלים שגרתית של המעבדה. וכיצד אנטיגן אחזור צריך לבצע צריך שתוקם עבור כל התקנה בודדים כיוון שהוא תלוי על השילוב נוגדן.
    2. Permeabilize הסעיפים 10 דקות ב- 0.2% טריטון X-100/טריס-באגירה מלוחים (TBS), ואחריו 3 x 5 דקות שוטף ב- TBS.
    3. לחסום אותם עם 3% BSA/TBS לשעה בטמפרטורת החדר.
    4. דגירה אותם בן לילה-הלעפה תרוטרפמט 4 [נוגדנים ראשי: עז α צ'אט (1:50), ארנב α TH (שבערך), עוף neurofilament α (1:1, 000)] או 2 h בטמפרטורת החדר (נוגדנים משניים מתויג פלורסצנטיות, שבערך) 1% BSA/TBS עם 3 x 5 דקות שוטף TBS שביניהם.
    5. להוסיף 1 µg/mL של bisbenzimide H33342 trihydrochloride הפתרון נוגדנים משניים או להשתמש בשיטה שונה מכתימים גרעינית.
    6. לטעון את השקופיות במדיום הרכבה עבור צביעת פלורסנט.

תוצאות

איור 1 מציג תמונה של ההתקנה Langendorff כולל 2 מערכים רב אלקטרודה (אותי). לפני הניסוי, הקטטר intracardiac ממוקם קרוב הצינורית כדי להקל על הכניסה מהיר וקל בחלל האטריום/ממש ולהבטיח פרק זמן קצר עד equilibration יכולה להתחיל. החלק התחתון של החדר יכול להיות מוגבר כאן (ראו החיצים

Discussion

כתב יד זה, Langendorff ידועים שמחוץ הלב זלוף המערכת מוצג ככלי לחקור את ההשפעה של נוירונים intracardiac על הלב אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis באמצעות מיפוי השונות וטכניקות גירוי כולל גישות endocardial epicardial.

בכמה חלקים של הפרוטוקול מכריעים עבור ההתקנה. ראשית, חשוב להשתמש בטכניקה הכנה בה רפ?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות Hartwig Wieboldt שלו סיוע טכני מעולה, דוק מיקרוסקופ הדמיה המתקן (Umif) של אוניברסיטת רפואי במרכז המבורג-גלאים עבור מיקרוסקופים ותמיכה. מחקר זה היה לפי ממומן Förderverein des Universitären Herzzentrums המבורג e.V. ועל ידי את DZHK (גרמנית מרכז למחקר קרדיו) [FKZ 81Z4710141].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium chlorideSigma-AldrichS3014Modified Krebs-Henleit solution
Sodium hydrogencarbonateSigma-Aldrich401676Modified Krebs-Henleit solution
Potassium chlorideSigma-AldrichP5405Modified Krebs-Henleit solution
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP5655Modified Krebs-Henleit solution
Magnesium sulfate heptahydrateSigma-AldrichM1880Modified Krebs-Henleit solution
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC7902Modified Krebs-Henleit solution
GlucoseSigma-AldrichG5767Modified Krebs-Henleit solution
Sodium pyruvate bioXtraSigma-AldrichP8574Modified Krebs-Henleit solution
Carbogen (95% O2 / 5% CO2)SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, GermanyModified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22EMD MilliporeSCGPT05REModified Krebs-Henleit solution
Atropine sulfateSigma-AldrichA0257Neuromodulation
Hexamethonium chlorideSigma-AldrichH2138Neuromodulation
Nicotine free base 98-100%Sigma-AldrichN3876Neuromodulation
Formalin solution neutral buffered 10%Sigma-AldrichHT501128Whole mount staining
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma-Aldrich252859Whole mount staining
MethanolSigma-Aldrich34860Whole mount staining
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2OMerck, KGA, Darmstadt, GermanyH1009Whole mount staining
Dimethyl sulfoxideMerck, KGA, Darmstadt, GermanyD8418Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tabletsGibco / Invitrogen18912-014Whole mount staining
Triton-x-100Sigma-AldrichT8787Whole mount staining
Albumin bovine fraction VBiomol, Hamburg, Germany11924.03Whole mount staining
Chicken anti neurofilamentEMD MilliporeAB5539Whole mount staining
Rabbit anti tyrosine hydroxylaseEMD MilliporeAB152Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferaseEMD MilliporeAP144PWhole mount staining
Donkey α rabbit IgG Alexa 488Thermo Fisher ScientificA21206Whole mount staining
Donkey α goat IgG Alexa 568Thermo Fisher ScientificA11057Whole mount staining
Donkey α chicken IgY Alexa 647Merck, KGA, Darmstadt, GermanyAP194SA6Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α rabbit igGR&D SystemsAP182BWhole mount staining
Biotin-conjugated donkey α goat igGR&D SystemsAP192PWhole mount staining
Biotin-conjugated goat α chicken igYR&D SystemsBAD010Whole mount staining
Vectashield mounting mediumVector laboratories, Burlingame, CA, USAH-1000Immunohistochemistry
Vectastain ABC kitVector laboratories, Burlingame, CA, USAPK-4000Immunohistochemistry
Steady DAB/PlusAbcam plc, Cambridge, UKab103723Whole mount staining
HistoClearDiaTec, Bamberg, GermanyHS2002Immunohistochemistry
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB2261Immunohistochemistry
Vectashield HardSet mounting mediumVector laboratories, Burlingame, CA, USAVEC-H-1400Immunohistochemistry
Perfusion systemHUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany 73-4343Langendorff apparatus
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameterPowerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New ZealandPL3508 PowerLab 8/35Langendorff setup
Octapolar catheterCIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USAcustomLangendorff setup
Stimulus generatorSTG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, GermanySTG4002-160µAStimulation setup
Stimulation softwareMulti Channel Systems, Reutlingen, GermanyMC_Stimulus IIStimulation setup
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrogramsME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, GermanyUSB-ME128-SystemMEA setup
Multi-electrode arrayMEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, GermanyEcoFlexMEA36MEA setup
Multi-electrode array recording softwareMulti Channel Systems, Reutlingen, GermanyMC_RackMEA setup
Spring scissorsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany15003-08Heart Preparation
Strabismus ScissorsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany14575-09Heart Preparation
Mayo ScissorsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany14110-15Heart Preparation
Dumont SS ForcepsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany11203-25Heart Preparation
London ForcepsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany11080-02Heart Preparation
Narrow Pattern ForcepsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany11003-13Heart Preparation
Plastic WrapParafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United StatesConsumable Materials
StereomicroscopeLeica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, GermanyFRET
LEDCoolLED, Andover, UKpE-100FRET
DualViewPhotometrics, Tucson, AZ, USADV2-SYSFRET
DualView filter setPhotometrics, Tucson, AZ, USA05-EMFRET
optiMOS scientific CMOS cameraQimaging, Surrey, BC, Canada01-OPTIMOS-R-M-16-CFRET
Imaging software  Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USAFRET
Analysis SoftwareImage J software; Public Domain, NIH, USAFRET

References

  1. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
  2. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  3. Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
  4. Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
  5. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
  6. Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
  7. Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
  8. Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
  9. Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
  10. Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
  11. Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
  12. Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
  13. Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
  14. Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
  15. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
  16. Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
  17. Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
  18. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
  19. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
  20. Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
  21. Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
  22. Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
  23. Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135intracardiac

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved