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要約

ここでは、心臓内の自律神経系の変調とその基本的な電気生理学、不整脈原性、および前のヴィヴォ蛍光セットアップを使用してキャンプのダイナミクスに及ぼす影響の評価のためのプロトコルを提案する.

要約

遅く 19 世紀の発明、以来心臓灌流システム前のヴィヴォ蛍光が生理学的、生化学的、形態学的、および薬理学的パラメーターの広範なスペクトルを勉強に関連するツールであり続けます集中的に除神経心。ここでは、心腔内の自律神経系の変調とその基本的な電気生理学、不整脈原性、および環状アデノシン一リン酸 (cAMP) の動態に及ぼす影響の評価のためのセットアップをについて説明します。心臓内の自律神経系はどのマウス大脳基底核が主にあるパッドの心房の脂肪の機械的解離によって調節 — またはターゲットと同様、世界的な薬理学的介入法を用いた。右心房、右心室 octapolar 電気生理学的カテーテルが導入され、高解像度マッピングの心外膜に配置された多電極アレイ (MEA) が心臓電気生理・不整脈原性を決定するために使用されます。蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) をイメージング心臓各地のキャンプ レベルのリアルタイム監視が実行されます。Neuromorphology は全体心を同定と実行の研究で心臓自律神経系の特定のターゲットの変調をガイドする神経細胞のマーカーを使用して抗体を用いた染色を用いて検討しました。前のヴィヴォ蛍光セットアップは短時間で再現性のある実験の数が多いためことができます。セットアップの部分的オープンな性質にもかかわらず、(e.g。、MEA 測定中に) 一定の温度コントロールが難しく、最小限に抑える必要があります。この説明法分析し、分散心の心臓自律神経系を調節することが可能になります。

概要

心臓灌流システム前のヴィヴォ蛍光が生理学的、生化学的、形態学的、広範囲の実行に関連するツールであり続けます、薬理学的研究に集中的に横隔膜心1,2 ,3,4,5後半の 19th世紀6の発明以来。様々 なトピックの日には、このシステムはまだ広く使用されます (e.g。、虚血再灌流) または勉強する心の薬理学的効果を7、8、と心血管研究に基本的なツールであります。このメソッドの寿命に起因するいくつかの利点 (e.g。、中枢神経系または他の臓器、全身の循環やホルモンの影響を受けずに測定が実行されます)。必要な場合、医薬品を制御された方法で灌流バッファーに追加または特定の構造を直接適用できます。、再現可能な実験と実験数が比較的多いが短時間で実行できます。セットアップの部分は () のオープンな性質は、体温調節困難とを考慮する必要があることができます。小さい動物を主に使用する実験装置はより複雑より生物学的変動と蛍光システムはより大きい種9で使用されても、(例えば。、トランスジェニック マウス モデル) 使用することができます。

このプロトコルの実験のセットアップ、環状アデノシン一リン酸 (cAMP) ダイナミクス、心外膜伝導心室不整脈原性基本的な電気生理学的パラメーターに及ぼす心臓自律神経系は、します。評価されます。心房の脂肪パッドの中心に位置する、中央の神経支配から独立した心臓電気生理学を制御する知られている今、心臓内の節の数が多い、そのまままたは慎重な機械と手動で削除された左郭清。自律神経系の薬理学的変調は、グローバルに医薬品を灌流バッファーに追加することによって、または心房基底核のターゲット変調によるローカルに実行されます。実験の後、心は、免疫組織学的評価に適してすべての血液細胞は、染色の品質を高めることができる持続灌流により削除されています。

記載された方法の全体的な目標は、心臓電気生理学、不整脈原性マウスの心臓の自律神経系の影響についての詳細な研究の新しい視点を提供することです。このテクニックを使用する理由は研究し、自律神経系中枢神経系の影響を与えずに変更することが可能です。主要な利点の 1 つは潜在的なプロまたは不整脈プロパティの古いの薬理学的実験の簡単な雇用、新しいエージェントをテストすることができます。さらに、さまざまな心臓病のトランスジェニック、ノックアウト マウス モデルは代謝性疾患や心不全、不整脈の基になるメカニズムを調査承ります。このアプローチは、心房レベルで自律神経が心室の心臓電気生理・不整脈の誘発に影響する可能性がどのように理解を高めた。

プロトコル

動物を含むすべてのプロシージャは、ハンブルク州立、ハンブルク大学のアニマル ・ ケアおよび使用委員会の地方自治体によって承認されました。

1. 蛍光装置の準備

注: 市販蛍光灌流システムが使用されます。

  1. 変更された促進ソリューション (119 mM 塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム一塩基、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、グルコース、8.3 mM とナトリウムの 2 mM の 2.5 mM から 1.1 mM の 1.2 mM の 4.6 mM の 25 mM の準備します。ピルビン酸)。カルシウム沈殿物を防ぐために灌流液に 95 %oxygen/5% 二酸化炭素の混合物を追加します。0.22 μ m の細孔径を持つバッファーをフィルター処理します。
  2. 心臓電気生理学、不整脈原性に応じてへの影響を調査するバッファーに薬理学的エージェントを追加します。
  3. 風呂の水を開始し、95 %oxygen/5% 二酸化炭素の混合物を含む灌流液を配置します。カニューレの前に直接灌流液温度は ~ 37 ° C、風呂の水の温度を調整します。
  4. ローラー ポンプを起動し、適切な温度に達するとすぐに、灌流液で装置を入力します。
  5. 装置にマウントする際の空気の泡がカニューレに残っていないように、中心部を接続する前にポンプの速度を調整します。

2. ハード ・ ソフトウェア等

  1. 灌流圧、流量、および心拍数の連続記録の蛍光装置にデジタル データ集録システムとその対応するソフトウェアを接続します。
    1. 80 mmHg に一般的な設定でターゲットを絞った灌流圧を設定します。
    2. 録音を開始します。
  2. 指定されたデジタル刺激発生器と白金電極、電極表面は 0.5 × 0.5 mm、0.5 mm の電極間隔とデータ記録そして刺激のための電気生理カテーテル (材料表) を使用します。
    1. 装置装着後、心臓の位置の地域の近くにカテーテルを配置します。
    2. カテーテルから 2 つの電極を選択することにより、刺激を準備し、100 ms のサイクルの長さを使用します。

3. 心の準備

  1. 風邪 (2 ~ 4 ° C) を追加灌流バッファー (10-20 mL と 40-50 mL で全体の料理が覆われているように) 氷の上に 2 シャーレ (直径 6 cm と 10 cm の) とカニューレおよび場所が付いている皿に直接次と顕微鏡下で。二重結びカニューレを準備します。
  2. 頚部転位後マヨはさみと狭いパターン鉗子を使用して胸郭を開くことによって心を急速に消費税します。ロンドン鉗子を用いた横隔膜上大静脈と大動脈をグリップし、斜視ハサミのすべての船舶や背骨近くの結合組織を切断することによって心肺ブロックを切除します。
  3. 冷たいバッファーでいっぱい (直径 6 cm) の最初の皿に心臓肺ブロックを転送、斜視はさみとロンドン鉗子を使用して心を損なうことがなく肺を慎重に取り外します。顕微鏡下で心を入れ、春はさみとデュモン SS 鉗子を用いた胸腺、食道と気管を注意深く取り外します。
  4. 春はさみを使用して、カテーテルの挿入のため右心房の上部に 1.5-2 mm の穴をカットします。肺動脈に穴を開けます。Supraaortic 枝の下で直接大動脈を切断し、結び目が簡単に付けることができるように、大動脈から組織を削除します。
  5. 心房の脂肪パッドを維持、atrially ganglionated プレキシ グラス、そのまま左のアトリウムの周りに位置するメジャーを含むまたは慎重な郭清によってそれらを完全に削除します。
  6. カニューレと料理に心を転送し、顕微鏡下に配置。大動脈カニューレを寄せるデュモン SS 鉗子で、大動脈周囲にしっかりと結び目を準備。大動脈弁と冠血管が自由残っているように、カニューレは大動脈に深すぎる配置されませんを確認します。
  7. 蛍光装置に迅速にカニューレを接続します。カニューレに気泡がないことを確認してください。
  8. 灌流圧を 80 mmHg、定圧灌流を許可に切り替えます。
  9. 感動や心を損なうことがなく、右心房と右心室にカテーテルを慎重に挿入し、カテーテルをテープでカニューレに添付します。
  10. 最初の 20 分平衡期間準備周期が 100 ms で刺激を開始します。
  11. 安定した温度を許可するように商工会議所を閉じます。

4 電気生理学的パラメーターと不整脈原性

  1. 2 回心房または心室ペーシング閾値で次の手順で説明するように、電気生理学的パラメーターを評価するカテーテルの遠位端または近位電極を介してプログラムされた刺激を適用します。
    1. 10 後最大戻り周期として洞結節回復時間を決定する固定金利 120 ms、100 ms、80 ms の S1S1 周期でペーシングの s。
    2. 最長 S1S1 サイクルの長さ (8 刺激としてウェンケバッハ ポイントを決定します。S1S1: 100 ms。2 ms の段階ごとの還元) 11 AV 結節伝導の損失と。最長の S1S2 として房室結節不応期を決定 (12 刺激;S1S1: 120 ms、110 ms、100 ms。1 つの短いと相まって 2 ms 段階ごとの S1S2 還元 extrastimulus) AV 結節伝導の損失と。
    3. 最長の S1S2 として心房と心室の不応期を決定 (12 刺激;S1S1: 120 ms、110 ms、100 ms。1 つの短いと相まって 2 ms 段階ごとの S1S2 還元 extrastimulus) 欠席心房または心室応答を10,11。
  2. プログラム extrastimulation を実行 (S1S1: 120 ms、100 ms、80 ミリ秒、最大 3 の余分なビートに続く 60 20 ms と 2 ms の段階ごとの還元) またはバースト プロトコルをペーシング (5 S1S1 s: 50 10 ms 10 ms の段階ごとの還元と) エヴァにランベスそったluate 心室不整脈原性10、11,12。

5. 心外膜伝導測定

メモ: は、128 チャンネル、支援記録システムを使用して高解像度マッピングの 25 の kHz のサンプリング レートで単極心外膜東エレクトロ グラムを記録します。32 多電極アレイを使用 (MEA; 電極間距離: 300 μ m; 1.8 × 1.8 mm)。メモ データをバンドパス フィルター (50 Hz) をされた 12 ビットおよび 20 の信号範囲でデジタル化、mV。

  1. 中心の指定された領域に MEA を配置し、接地を心13,14,15の別の部分に追加します。
  2. MEA の近くに心外膜刺激カテーテルを置き、一定の刺激を開始します。
  3. 電極の良好な接触の確認後振幅信号の品質をチェックして録音を開始します。
  4. 波動伝播速度と伝導の方向に分散の決定のためのオフライン解析を使用します。

6. 蛍光共鳴エネルギー伝達 FRET ベースの環状アデノシン一リン酸 (cAMP) イメージング

注: フレット ベース計測向け CAG Epac1 キャンプ トランスジェニック マウス16から心を収穫します。

  1. 実体顕微鏡15,17周り自作イメージング システムを使用します。
  2. 心の前に実体顕微鏡を置き、視力を調整します。
  3. 励起光源をキャンプのセンサー [例えば、単一波長光発光ダイオードを使用して (440 nm)]。(シアン蛍光タンパク質/黄色蛍光タンパク質ペア、ダイクロイック ミラーを使用、565dcxr および D480/30 と D535/40 の発光フィルター) のビーム ・ スプリッターを使用してドナーとアクセプタのチャンネルに放射光を分割します。
  4. 商工会議所の周りのプラスチック製のラップを置くことにより安定した温度を確保します。
  5. 科学的な相補型金属-酸化物-半導体 (sCMOS) カメラを使用して撮影します。光源とカメラ画像キャプチャ画像マイクロ マネージャーなどソフトウェア オープン ソースで調整します。
  6. 、画像取得を開始するには、 Multi-D Acqをプッシュします。ボタンをクリックし、時間経過を設定イメージを身につけるすべての 10 s 蛍光信号 (約 100 ms) の強さに依存する適切な露光時間を持つ。
  7. 2 つのチャンネルに画像を分割、関心の領域を選択し、比トレースを監視する、以前記載されている、利用可能なオンラインのフレットし、フレット オンライン 2プラグイン17を使用します。
  8. 買収時心を灌流実験の性質によって、さまざまな物質を含む変更促進ソリューション。
  9. 実験の終わりには、電源取得停止ボタンを押して、画像のスタックを保存します。
  10. ドナーとアクセプタのチャンネルの 2 つの同一セクションに画像を分割することができますし、複数地域の利益のために解析を実行できる専用解析ソフトウェアを使用してオフライン フレット データを分析します。
    注: は、スプレンガーらに必要な専用プラグイン (オフライン フレット) は17。
    1. ソフトウェアを起動します。メニューのプラグインに行くことによって解析を開き、たがり、し、マイクロ マネージャー ファイルを開くをクリックします。
    2. CFP と YFP チャンネルの 2 つの同一の画像をコマ撮りを分割するためにオフラインのフレットプラグインを実行します。
    3. フリーハンド選択ツールを使用して、YFP 画像への関心の領域をマークします。マルチ測定ウィンドウに選択内容を追加する [追加] ボタンを押します。
    4. マルチ測定」ウィンドウで目的の地域を選択し、マルチフレームと地域ごとに平均グレー値を持つテーブルを取得するキーを押します。コピーして Excel シートにすべてのデータを貼り付けます。
    5. CFP 画像のスタックをクリックします。CFP スタックのステップ 6.10.4 のように同じ操作を実行し、同じ Excel シートに平均グレー値を貼り付けます。
  11. 受容体チャネル17にドナーの写り要因のオフラインの生データを修正します。
    1. B が写り要因を次の数式を使用します。
      比率 = (YFP - B x CFP)/CFP
    2. イメージングのみ CFP を表現する心、写り要因 B を調べ、YFP チャンネルでドナー蛍光の割合を測定 (B = YFP/CFP)。

7. Neuromorphology

注: は、そのままマウス心の全体マウント immunostainings を使用して心臓内の自律神経系を分析します。心臓神経節の大半は肺静脈の近くに心外膜脂肪組織にローカライズされているに注意してください。

  1. ニューロ フィラメント (一般的な神経構造; 鶏抗 NF-H、1:3, 000) の描写を異なる染色を使用 (チャット、副交感神経チロシンヒドロキシラーゼ (TH、交感神経の神経構造; ウサギ α 日, 1:1, 000)、およびコリン アセチルトランスフェラーゼ神経の構造;ヤギ α チャット、1:50)。
  2. 蛍光装置の灌流後、24 h のホルマリン 10 mL にマウス心を修正し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 4 ° C で保存します。
  3. デントの漂白剤で心を漂白剤 (4:1:1 メタノール: 過酸化水素のソリューション 30% (w/w) H2o: ジメチルスルホキシド (DMSO) で) 4 ° C で 1 週間と PBS でメタノールを降順一連の PBS にその後それらを水分補給 (100%、75%、50%、25%; 1 h)18。
  4. 4 ° C で穏やかな攪拌と 24 ウェル プレート表示形式で次の孵化を実行します。
    1. 1% で心を permeabilize トリトン-X-100/PBS (PBS-T) 一晩ブロック バッファーにそれらをブロックする前に室温で 3 x 1 時間 [5% ウシ血清アルブミン (BSA)/PBS T + 0.2% アジ化ナトリウム]。
    2. 次のように、抗体を希釈: ヤギ α チャット (1:50)、ウサギ α TH (1:1, 000)、鶏 α ニューロ フィラメント (1:3, 000);蛍光分類のための二次抗体 (1: 500; または製造元の指示に従って)。発色性ラベリングのビオチン化二次抗体 (1: 200; または製造元の指示に従って)。
  5. 4 ° C で 1 週間のブロック バッファーで希釈した一次抗体の標本を孵化させなさい。
  6. 4 日間のブロック バッファーで二次抗体の孵化前に PBS T で 3 x 15 分間の心を洗います。
  7. PBS T で 3 x 15 分間の心を洗うと取付中室温で 3 h の蛍光汚損のために保存または製造元の指示に従ってアビジン-ビオチン複合体の検出キットを使用します。
  8. 事前製造元の指示に従って軽打を含むバッファーのビジュアル コントロールの下でそれらを開発する前に、1 h で 3, 3'-ジアミノベンジジン (軽打) の商業バッファーの心を孵化させなさい。
  9. 二重蒸留水に標本を保存します。
  10. パラフィン セクション、脱水およびパラフィンに心を埋め込みます。
    1. 4 μ m 厚いセクションをカットし、研究室のルーチンの手順に従ってそれらを deparaffinize します。抗原検索を実行する必要かどうか、どのように抗体の組み合わせによって異なりますので毎の個別セットアップを確立する必要があります。
    2. TBS で 3 x 5 分洗浄が続く 0.2% トリトン-X-100/トリス-緩衝生理食塩水 (TBS) で 10 分間のセクションを permeabilize します。
    3. 3% とそれらをブロック BSA/TBS 室温で 1 時間。
    4. 4 ° C でそれらを一晩インキュベート [一次抗体: ヤギ α チャット (1:50)、ウサギ α TH (1: 500) チキン α ニューロ フィラメント (1:1, 000)] または 1 %bsa ・ TBS 3 x 5 分で洗う間に TBS に室温 (蛍光標識二次抗体、1: 500) で 2 h。
    5. 二次抗体溶液を 1 μ g/mL bisbenzimide H33342 trihydrochloride を追加または異なる核染色法を使用します。
    6. 蛍光染色用メディアをマウント内のスライドをマウントします。

結果

2 多電極アレイ (Mea) を含む蛍光セットアップのイメージを図 1に示します。実験前に、心臓内のカテーテルを右心房・右心室の速く、容易な挿入を容易にして、平衡が開始できるまでに短い期間を確保するためカニューレの近くに位置します。商工会議所の下の部分を高め (図 1の矢印を参照) ので、商工会議所が完全に閉?...

ディスカッション

別のマッピングと刺激テクニックによる心臓電気生理学、不整脈原性心内ニューロンの影響を研究するためのツールとして本稿では、よく知られている蛍光前のヴィヴォ心臓灌流システムを提案します。心内膜と心外膜アプローチを含みます。

プロトコルのいくつかの部分は、セットアップのために重要です。まず、心房の脂肪パッドはそのまま、または心筋を?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、彼の優秀な技術支援とウケ顕微鏡イメージング施設 (Umif) の大学エッペンドルフ メディカル センター ハンブルク顕微鏡およびサポートを提供するためのハートウィグ目下を感謝したいです。本研究では資金によって Förderverein デ Universitären Herzzentrums ハンブルク e. v.、DZHK (ドイツ語心血管研究センター) [FKZ 81Z4710141]。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium chlorideSigma-AldrichS3014Modified Krebs-Henleit solution
Sodium hydrogencarbonateSigma-Aldrich401676Modified Krebs-Henleit solution
Potassium chlorideSigma-AldrichP5405Modified Krebs-Henleit solution
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP5655Modified Krebs-Henleit solution
Magnesium sulfate heptahydrateSigma-AldrichM1880Modified Krebs-Henleit solution
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC7902Modified Krebs-Henleit solution
GlucoseSigma-AldrichG5767Modified Krebs-Henleit solution
Sodium pyruvate bioXtraSigma-AldrichP8574Modified Krebs-Henleit solution
Carbogen (95% O2 / 5% CO2)SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, GermanyModified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22EMD MilliporeSCGPT05REModified Krebs-Henleit solution
Atropine sulfateSigma-AldrichA0257Neuromodulation
Hexamethonium chlorideSigma-AldrichH2138Neuromodulation
Nicotine free base 98-100%Sigma-AldrichN3876Neuromodulation
Formalin solution neutral buffered 10%Sigma-AldrichHT501128Whole mount staining
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma-Aldrich252859Whole mount staining
MethanolSigma-Aldrich34860Whole mount staining
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2OMerck, KGA, Darmstadt, GermanyH1009Whole mount staining
Dimethyl sulfoxideMerck, KGA, Darmstadt, GermanyD8418Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tabletsGibco / Invitrogen18912-014Whole mount staining
Triton-x-100Sigma-AldrichT8787Whole mount staining
Albumin bovine fraction VBiomol, Hamburg, Germany11924.03Whole mount staining
Chicken anti neurofilamentEMD MilliporeAB5539Whole mount staining
Rabbit anti tyrosine hydroxylaseEMD MilliporeAB152Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferaseEMD MilliporeAP144PWhole mount staining
Donkey α rabbit IgG Alexa 488Thermo Fisher ScientificA21206Whole mount staining
Donkey α goat IgG Alexa 568Thermo Fisher ScientificA11057Whole mount staining
Donkey α chicken IgY Alexa 647Merck, KGA, Darmstadt, GermanyAP194SA6Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α rabbit igGR&D SystemsAP182BWhole mount staining
Biotin-conjugated donkey α goat igGR&D SystemsAP192PWhole mount staining
Biotin-conjugated goat α chicken igYR&D SystemsBAD010Whole mount staining
Vectashield mounting mediumVector laboratories, Burlingame, CA, USAH-1000Immunohistochemistry
Vectastain ABC kitVector laboratories, Burlingame, CA, USAPK-4000Immunohistochemistry
Steady DAB/PlusAbcam plc, Cambridge, UKab103723Whole mount staining
HistoClearDiaTec, Bamberg, GermanyHS2002Immunohistochemistry
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB2261Immunohistochemistry
Vectashield HardSet mounting mediumVector laboratories, Burlingame, CA, USAVEC-H-1400Immunohistochemistry
Perfusion systemHUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany 73-4343Langendorff apparatus
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameterPowerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New ZealandPL3508 PowerLab 8/35Langendorff setup
Octapolar catheterCIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USAcustomLangendorff setup
Stimulus generatorSTG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, GermanySTG4002-160µAStimulation setup
Stimulation softwareMulti Channel Systems, Reutlingen, GermanyMC_Stimulus IIStimulation setup
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrogramsME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, GermanyUSB-ME128-SystemMEA setup
Multi-electrode arrayMEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, GermanyEcoFlexMEA36MEA setup
Multi-electrode array recording softwareMulti Channel Systems, Reutlingen, GermanyMC_RackMEA setup
Spring scissorsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany15003-08Heart Preparation
Strabismus ScissorsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany14575-09Heart Preparation
Mayo ScissorsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany14110-15Heart Preparation
Dumont SS ForcepsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany11203-25Heart Preparation
London ForcepsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany11080-02Heart Preparation
Narrow Pattern ForcepsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany11003-13Heart Preparation
Plastic WrapParafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United StatesConsumable Materials
StereomicroscopeLeica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, GermanyFRET
LEDCoolLED, Andover, UKpE-100FRET
DualViewPhotometrics, Tucson, AZ, USADV2-SYSFRET
DualView filter setPhotometrics, Tucson, AZ, USA05-EMFRET
optiMOS scientific CMOS cameraQimaging, Surrey, BC, Canada01-OPTIMOS-R-M-16-CFRET
Imaging software  Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USAFRET
Analysis SoftwareImage J software; Public Domain, NIH, USAFRET

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