Impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica em um sistema de Langendorff Ex Vivo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a modulação do sistema nervoso autonomic intracardíaca e a avaliação da sua influência na eletrofisiologia básica, arritmogênica e acampamento dinâmica usando uma configuração de Langendorff ex vivo .

Resumo

Desde a sua invenção no^{século 19 tarde} , o sistema de perfusão do Langendorff ex vivo coração continua a ser uma ferramenta relevante para o estudo de um amplo espectro de parâmetros fisiológicos, bioquímicos, morfológicos e farmacológicos em corações centralmente desnervadas. Aqui, descrevemos uma configuração para a modulação do sistema nervoso autonomic intracardíaca e a avaliação da sua influência na eletrofisiologia básica, arritmogênica e dinâmica de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP). O sistema nervoso autônomo intracardíaco é modulado pela dissecção mecânica da gordura atrial almofadas-no quais murino gânglios estão localizados principalmente — ou pelo uso de intervenções farmacológicas globais, bem como alvo. Um cateter eletrofisiológicos octapolar é introduzido no átrio direito e o ventrículo direito, e multi eletrodos epicárdico colocado matrizes (MEA) para mapeamento de alta resolução são usados para determinar arritmogênica e Eletrofisiologia cardíaca. Transferência de energia de ressonância Förster (FRET) imagem é realizada para o monitoramento em tempo real dos níveis de campo em diferentes regiões cardíacas. Neuromorphology é estudado por meio de anticorpos-baseado coloração de todo o coração usando marcadores neuronais para orientar a identificação e a modulação de metas específicas do sistema nervoso autonomic intracardíaco nos estudos realizados. A configuração de Langendorff ex vivo permite um elevado número de experimentos reprodutíveis em um curto espaço de tempo. No entanto, a natureza parcialmente aberta da instalação (ex., durante as medições de MEA) dificulta o controle de temperatura constante e deve ser mantida a um mínimo. Esse método descrito torna possível analisar e modulam o sistema nervoso autônomo intracardíaco em corações descentralizadas.

Introdução

O sistema de perfusão do Langendorff ex vivo coração continua a ser uma ferramenta relevante para a realização de um amplo espectro de fisiológicas, bioquímicas, morfológicas e estudos farmacológicos em centralmente desnervados corações^{1,2 ,3,4,5} , desde a sua invenção no final 19^th do século⁶. Até à data, este sistema é ainda amplamente utilizado para vários tópicos (EG., reperfusão de isquemia) ou estudar cardíaco farmacológico efeitos^7,8e é uma ferramenta básica em pesquisa cardiovascular. A longevidade deste método resulta de várias vantagens (ex., as medições são realizadas sem a influência do sistema nervoso central ou outros órgãos, circulação sistêmica ou hormônios circulantes). Se necessário, produtos farmacêuticos podem ser adicionados de forma controlada para o buffer de perfusão ou aplicados diretamente às estruturas específicas. Experimentos são reprodutíveis, e um número relativamente elevado de experiências pode ser executado em um curto período de tempo. A natureza aberta (em parte) da instalação do pode tornar difícil de regulação da temperatura e precisa ser levado em conta. Embora o sistema de Langendorff também é usado em maior espécie⁹, animais menores são usados principalmente como a instalação experimental é menos complexo e uma maior variabilidade biológica (EG., transgénicos mouse modelos) podem ser usados.

No menu configuração experimental do presente protocolo, a influência do sistema nervoso autonomic intracardíaca de parâmetros eletrofisiológicos básicos, arritmogênica ventricular, condução Epicárdica e dinâmica de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) é avaliada. Um grande número de gânglios intracardíacos, que localizam-se principalmente nas almofadas de gordura atrial e agora são conhecidos para controlar Eletrofisiologia Cardíaca independente de controle neural central, é que também deixou intacta ou removido manualmente com cuidado mecânica dissecação. Uma modulação farmacológica do sistema nervoso autonomic é realizada globalmente pela adição de produtos farmacêuticos para o buffer de perfusão ou localmente pela modulação alvo de gânglios atrial. Após os experimentos, os corações são adequados para uma avaliação reagidos como todas as células do sangue foram removidas devido a perfusão contínua, que pode aumentar a qualidade da coloração.

O objetivo geral das técnicas descritas é oferecer novas perspectivas para estudos detalhados sobre o impacto a nível do sistema nervoso autônomo na eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica no coração do mouse. Uma razão para usar essa técnica é que é possível estudar e alterar o sistema nervoso autônomo sem o impacto do sistema nervoso central. Uma grande vantagem é o fácil emprego de experimentos farmacológicos, em quais pro - ou antiarrítmicas Propriedades potenciais de velhos e novos agentes podem ser testados. Além disso, modelos de rato transgénico e nocaute de várias doenças cardíacas estão disponíveis para investigar os mecanismos subjacentes a arritmias, insuficiência cardíaca ou doenças metabólicas. Esta abordagem tem reforçado a nossa compreensão de como o sistema nervoso autônomo no nível atrial podem afetar Eletrofisiologia Cardíaca ventricular e a indução de arritmias.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelas autoridades locais das comissões de uso, cuidados com animais da Universidade de Hamburgo e o estado de Hamburgo.

1. preparação do aparato de Langendorff

Nota: Um sistema de perfusão de Langendorff comercialmente disponível é usado.

1. Preparar uma solução de Krebs-Henseleit modificada (119 mM de cloreto de sódio, 25 mM de bicarbonato de sódio, 4,6 mM de cloreto de potássio, 1,2 mM de fosfato de potássio monobásico, 1,1 mM de sulfato de magnésio, 2.5 mM de cloreto de cálcio, 8,3 mM de glicose e 2 mM de sódio piruvato). Adicione uma mistura de 95% de dióxido de carbono de oxygen/5% para a solução de perfusão para evitar a precipitação do cálcio. Filtre o buffer com um tamanho de poros de 0,22 µm.
2. Adicione um agente farmacológico para o buffer para investigar seu efeito na eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica conforme necessário.
3. Comece o banho de água e coloque a solução de perfusão, incluindo uma mistura de 95% de dióxido de carbono de oxygen/5% nele. Ajuste a temperatura do banho de água, para que a temperatura de solução de perfusão diretamente antes da cânula é ~ 37 ˚ c.
4. Inicie a bomba de roletes e encher o aparelho com a solução de perfusão assim que atingir a temperatura correta.
5. Ajuste a taxa de bomba antes de anexar o coração, para que nenhuma bolha de ar é deixada na cânula quando montá-lo para o aparelho.

2. hard - e Software de preparação

1. Ligar um sistema de aquisição de dados digitais e seu software correspondente ao aparelho de Langendorff para uma gravação contínua da pressão de perfusão, taxa de fluxo e frequência cardíaca.
   1. Ajustar a pressão de perfusão alvo nas configurações gerais para 80 mmHg.
   2. Inicie a gravação.
2. Use um cateter de eletrofisiologia (Tabela de materiais) com eléctrodos de platina, uma superfície de eletrodo de 0,5 x 0,5 mm e um espaçamento de eletrodo de 0,5 mm para a gravação de dados e estimulação com um gerador de estímulo digital designado.
   1. Coloque o cateter perto da área onde o coração será posicionado após o acessório para o aparelho.
   2. Preparar a estimulação selecionando 2 eléctrodos do cateter e usar um comprimento de ciclo de 100 ms.

3. preparação do coração

1. Adicionar o frio (~ 2-4 ˚ c) buffer de perfusão (10-20 mL e 40-50 mL, para que todo o prato está coberto) para os 2 pratos de Petri (diâmetro de 6 cm e 10 cm) e o prato com a cânula e o local-los no gelo diretamente próxima e sob o microscópio. Prepare um nó duplo ao redor da cânula.
2. Excisar rapidamente o coração após deslocamento cervical, abrindo o tórax usando uma tesoura de Mayo e fórceps estreito padrão. Então segure a aorta e a veia cava acima do diafragma usando a pinça de Londres e excisar o bloco de coração-pulmão cortando todos os vasos e tecido conjuntivo perto da espinha com a tesoura de estrabismo.
3. Transferir o bloco de coração-pulmão para o primeiro prato (6 cm de diâmetro) preenchido com o buffer de gelada e remova cuidadosamente os pulmões sem danificar o coração usando estrabismo tesoura e pinça de Londres. Em seguida, coloque o coração sob o microscópio e remova cuidadosamente o timo, o esôfago e a traqueia por usando mola tesoura e pinça Dumont SS.
4. Use a tesoura de mola para abrir um buraco de 1,5-2 mm na parte superior da aurícula direita para a inserção do cateter. Corte um buraco na artéria pulmonar. Então cortou a aorta diretamente sob os ramos de supraaortic e remover o tecido da aorta, para que o nó pode ser conectado facilmente.
5. Mantenha as almofadas de gordura atrial, incluindo o major atrially localizado ganglionated plexi, ao redor do átrio esquerdo intacto ou removê-los completamente por dissecção cuidadosa.
6. Transferir o coração para o prato com a cânula e colocá-la sob o microscópio. Encostar a aorta da cânula com a pinça de Dumont SS e preparado o nó firmemente em torno da aorta. Certifique-se de que a cânula não é colocada muito fundo na aorta, para que a válvula da aorta e os vasos coronarianos são deixados livre.
7. Anexe a cânula rapidamente ao aparelho de Langendorff. Certifique-se de que não há nenhuma bolha na cânula.
8. Alterne a pressão de perfusão para 80 mmHg, permitindo uma perfusão de pressão constante.
9. Insira o cateter cuidadosamente o átrio direito e ventrículo direito sem tocar ou danificar o coração e fixe o cateter à cânula com fita.
10. Começa a estimulação com a duração do ciclo preparado de 100 ms, por um período de equilíbrio inicial 20 min.
11. Feche a câmara para permitir uma temperatura estável.

4. eletrofisiológicos parâmetros e arritmogênica

1. Aplica uma estimulação programada através de eletrodos distais ou proximais do cateter em duas vezes o batimentos atrial ou ventricular limiar estimulação para avaliar os parâmetros eletrofisiológicos, conforme descrito nas etapas a seguir.
   1. Determinar o tempo de recuperação do nó sinusal como a duração do ciclo de retorno máximo após 10 s de estimulação em um comprimento de ciclo S1S1 de 120 ms 100 ms e 80 ms fixa.
   2. Determinar o ponto de Wenckebach como a duração do ciclo mais longa S1S1 (8 estímulos; S1S1: 100 ms; 2 redução gradual do ms) com uma perda de 11 da condução nodal AV. Determinar os períodos refratários nodais atrioventricular como a mais longa S1S2 (12 estímulos; S1S1: 120 ms, ms 110 e 100ms; um falta acoplado extrastimulus com 2 ms redução gradual S1S2) com uma perda de condução nodal AV.
   3. Determinar os períodos refratários atrial e ventriculares, como a mais longa S1S2 (12 estímulos; S1S1: 120 ms, ms 110 e 100ms; um falta acoplado extrastimulus com 2 ms redução gradual S1S2) com uma resposta de batimentos atrial ou ventricular ausente^10,11.
2. Executar um extrastimulation programado (S1S1: 120 ms 100 ms e 80 ms, seguidos por até 3 batidas extras; 60-20 ms com uma redução gradual de 2 ms) ou explosão protocolos de estimulação (5 s no S1S1: 50-10 ms com uma redução gradual de 10 ms) em conformidade com as convenções de Lambeth para eva luate arritmogênica ventricular^10,11,12.

5. Epicárdica condução medições

Nota: Registro unipolar Epicárdica electrogramas usando um sistema de gravação de 128 canais, assistida por computador com uma taxa de amostragem de 25 kHz para mapeamento de alta resolução. Usar uma matriz de eletrodo multi 32 (MEA; distância eletroda inter: 300 µm; 1,8 x 1,8 mm). Note que os dados foram filtrados de bandpass (50 Hz) e digitalizados com 12 bits e uma gama de sinal de 20 mV.

1. Coloque a MEA na área designada do coração e adicionar o aterramento para outra parte do coração^13,14,15.
2. Coloque um cateter de estimulação Epicárdica perto o MEA e iniciar uma estimulação constante.
3. Inicie a gravação após a confirmação do bom contacto dos eléctrodos, verificando a qualidade do sinal e a amplitude.
4. Use uma análise off-line para a determinação da velocidade de propagação da onda e dispersão na direção da condução.

6. Förster ressonância FRET transferência de energia cíclico adenosina monofosfato (cAMP) geração de imagens baseada

Nota: Para medições baseadas no traste, colheita de corações de ratos transgénicos de CAG-Epac1-campos¹⁶.

1. Use um sistema de imageamento autoconstruído em torno de um estereomicroscópio^15,17.
2. Coloque as duas oculares na frente do coração e ajustá-lo para a acuidade.
3. Excitar o sensor de campo com uma fonte de luz [por exemplo, use um único comprimento de onda luz emitida por diodo (440 nm)]. Dividi a emissão de luz em canais de doador e aceptor usando um divisor de feixe (para um par de proteína fluorescente de proteína/amarelo fluorescente ciano, uso um 565dcxr espelho dicroico e filtros de emissão D480/30 e D535/40).
4. Assegurar uma temperatura estável colocando um envoltório de plástico em torno da câmara.
5. Tirar fotos usando uma câmera científica metal-óxido-semicondutor complementar (sCMOS). Coordene a fonte de luz e a câmera captura de imagem com um software como Micro-Gerenciador de imagem de código aberto.
6. Para iniciar a aquisição de imagem, empurre o Acq Multi-D. botão e configurar um lapso de tempo, que adquire uma imagem cada 10 s, com o tempo de exposição adequado, que depende da força do sinal fluorescente (cerca de 100 ms).
7. Use o anteriormente descrito e disponível FRET on-line e FRET on-line 2 plugins¹⁷ para dividir a imagem em dois canais, selecione as regiões de interesse e monitorar o rastreamento de relação.
8. Durante a aquisição, perfundir o coração com a solução de Krebs-Henseleit modificada contendo substâncias diferentes, dependendo da natureza do experimento.
9. No final do experimento, desligue a aquisição pressionando o botão parar e salvar a pilha de imagens.
10. Analise os dados FRET off-line usando um software de análise dedicado que pode dividir imagens em duas seções idênticas para os canais de doador e aceptor e pode executar análise FRET em várias regiões de interesse.
    Nota: Um dedicado plug-in (FRET off-line) é necessária, que é fornecido no et al . Sprenger ¹⁷.
    1. Inicie o software. Abra a análise, indo ao menu Plugins e, em seguida, clique em MicroManagere depois em Abrir arquivo de Microgerente.
    2. Execute o plugin FRET off-line para dividir o lapso de tempo em duas imagens idênticas para os canais de PCP e YFP.
    3. Use a ferramenta de Seleções à mão livre para marcar a região de interesse na imagem YFP. Pressione o botão Adicionar para adicionar a selecção à janela Multi medida .
    4. Escolha a região de interesse na Medida Multi janela e pressione Multi para obter uma tabela com valores médios de cinza para cada frame e região. Copie e cole todos os dados em uma folha de Excel.
    5. Clique na pilha de imagem do PCP. Executar as mesmas ações como na etapa 6.10.4 para a pilha de PCP e cole a mesma folha de Excel com os valores médios de cinza.
11. Corrigi os dados off-line para o fator de infiltração do doador para o aceitador canal¹⁷.
    1. Use a seguinte fórmula, onde B é o fator de infiltração:
       Ratio = (YFP - B x CFP) / PCP
    2. Determinar o fator de infiltração B por um coração expressando o PCP só de imagem e medir a porcentagem da fluorescência no canal YFP doador (B = YFP / PCP).

7. Neuromorphology

Nota: Analise o sistema nervoso autônomo intracardíaco usando immunostainings de toda a montagem de corações murino intactas. Note que a maioria dos gânglios intracardíacos é localizada no tecido adiposo epicárdico perto das veias pulmonares.

1. Usar diferentes colorações para a representação de Neurofilamento (estruturas neuronais gerais; frango anti-NF-H, 1:3, 000), Tirosina Hidroxilase (TH, simpáticas estruturas neuronais; coelho α TH, 1:1, 000) e colina acetiltransferase (ChAT, parassimpático estruturas neuronais; cabra α ChAT, 01:50).
2. Após a perfusão no aparato de Langendorff, consertar os corações de rato em 10 mL de formalina para 24h e armazená-los em tampão fosfato salino (PBS) no 4 ˚ c.
3. Branquear os corações em lixívia de Dent (4:1:1 metanol: água oxigenada solução 30% (w/w) em H₂O: dimetilsulfóxido (DMSO)) durante 1 semana a 4 ˚ c e re-hidratá-los posteriormente a PBS em uma série de decrescente metanol em PBS (100%, 75%, 50%, 25%; 1 h cada) ¹⁸.
4. Realizar a incubação do seguinte formato com uma agitação suave no 4 ˚ c-24-placa:
   1. Permeabilize os corações em 1% Triton-X-100/PBS (PBS-T) por 3 x 1 h à temperatura ambiente antes de bloqueá-los durante a noite em um tampão de bloqueio [5% albumina de soro bovino (BSA) / PBS-T + 0,2% de azida de sódio].
   2. Diluir os anticorpos como segue: cabra α ChAT (01:50), coelho α TH (1:1, 000), Neurofilamento α de frango (1:3, 000); anticorpos secundarios para rotulagem fluorescente (1: 500; ou de acordo com as instruções do fabricante); biotinilado anticorpos secundários para rotulagem cromogênico (1: 200; ou de acordo com as instruções do fabricante).
5. Incube as amostras em anticorpos primários diluídos em um tampão de bloqueio durante uma semana a 4 ˚ c.
6. Lave os corações para 3 x 15 min em PBS-T antes da incubação do anticorpo secundário em um tampão de bloqueio por 4 dias.
7. Lave os corações para 3 x 15 min em PBS-T e armazená-los em um meio de montagem para a coloração fluorescente para 3h em temperatura ambiente ou usar um kit de deteção complexo avidina-biotina de acordo com as instruções do fabricante.
8. Pre-incube os corações por 1h em um buffer de comercial para 3, 3'-diaminobenzidine (DAB), antes de desenvolvê-los sob um controle visual em um buffer contendo DAB de acordo com as instruções do fabricante.
9. Armazene as amostras em água bidestilada.
10. Para cortes de parafina, desidratar e incorporar os corações em parafina.
    1. 4-µm espessura seções de corte e deparaffinize-los de acordo com os procedimentos de rotina do laboratório. Se e como a recuperação do antígeno precisa ser executada precisa ser estabelecido para cada instalação individual uma vez que depende da combinação de anticorpos.
    2. Permeabilize as seções por 10 min em 0,2% Triton X-100/Tris-salino (TBS), seguido de lavagens de 3 x 5 min na TBS.
    3. Bloqueá-los com 3% BSA/TBS por 1h à temperatura ambiente.
    4. Incube-os durante a noite a 4 ˚ c [anticorpos primários: cabra α ChAT (01:50), coelho α TH (1: 500), frango Neurofilamento α (1:1, 000)] ou 2 h à temperatura ambiente (marcado com fluorescência anticorpos secundários, 1: 500) em 1% BSA/TBS com 3 x 5 min lava TBS in-between.
    5. Adicionar 1 µ g/mL de trihydrochloride de H33342 de bisbenzimide para a solução de anticorpo secundário ou usar um método diferente de coloração nuclear.
    6. Monte as lâminas em um meio de montagem para a coloração fluorescente.

Resultados

A Figura 1 mostra uma imagem da instalação do Langendorff incluindo 2 eletrodos multi matrizes (MEAs). Antes do experimento, o cateter intracardíaco é posicionado perto da cânula para facilitar uma rápida e fácil inserção no ventrículo direito átrio/direita e certifique-se de um curto período de tempo até que o equilíbrio pode começar. A parte inferior da câmara pode ser aumentada (veja as setas na Figura 1) para ...

Discussão

Neste manuscrito, o conhecido Langendorff ex vivo coração perfusão sistema é apresentado como uma ferramenta para estudar o impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica usando mapeamento diferente e técnicas de estimulação incluindo as abordagens endocárdico e Epicárdica.

Várias partes do protocolo são cruciais para a instalação. Em primeiro lugar, é importante o uso de uma técnica de preparação em que as almofadas de gordura atri...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	Modified Krebs-Henleit solution
Sodium hydrogencarbonate	Sigma-Aldrich	401676	Modified Krebs-Henleit solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Modified Krebs-Henleit solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	Modified Krebs-Henleit solution
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M1880	Modified Krebs-Henleit solution
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	Modified Krebs-Henleit solution
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	Modified Krebs-Henleit solution
Sodium pyruvate bioXtra	Sigma-Aldrich	P8574	Modified Krebs-Henleit solution
Carbogen (95% O2 / 5% CO2)	SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany	Modified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22	EMD Millipore	SCGPT05RE	Modified Krebs-Henleit solution
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	A0257	Neuromodulation
Hexamethonium chloride	Sigma-Aldrich	H2138	Neuromodulation
Nicotine free base 98-100%	Sigma-Aldrich	N3876	Neuromodulation
Formalin solution neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Whole mount staining
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859	Whole mount staining
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Whole mount staining
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	H1009	Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	D8418	Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets	Gibco / Invitrogen	18912-014	Whole mount staining
Triton-x-100	Sigma-Aldrich	T8787	Whole mount staining
Albumin bovine fraction V	Biomol, Hamburg, Germany	11924.03	Whole mount staining
Chicken anti neurofilament	EMD Millipore	AB5539	Whole mount staining
Rabbit anti tyrosine hydroxylase	EMD Millipore	AB152	Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase	EMD Millipore	AP144P	Whole mount staining
Donkey α rabbit IgG Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Whole mount staining
Donkey α goat IgG Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A11057	Whole mount staining
Donkey α chicken IgY Alexa 647	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	AP194SA6	Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α rabbit igG	R&D Systems	AP182B	Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α goat igG	R&D Systems	AP192P	Whole mount staining
Biotin-conjugated goat α chicken igY	R&D Systems	BAD010	Whole mount staining
Vectashield mounting medium	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	H-1000	Immunohistochemistry
Vectastain ABC kit	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	PK-4000	Immunohistochemistry
Steady DAB/Plus	Abcam plc, Cambridge, UK	ab103723	Whole mount staining
HistoClear	DiaTec, Bamberg, Germany	HS2002	Immunohistochemistry
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B2261	Immunohistochemistry
Vectashield HardSet mounting medium	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	VEC-H-1400	Immunohistochemistry
Perfusion system	HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany	73-4343	Langendorff apparatus
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter	Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand	PL3508 PowerLab 8/35	Langendorff setup
Octapolar catheter	CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA	custom	Langendorff setup
Stimulus generator	STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	STG4002-160µA	Stimulation setup
Stimulation software	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	MC_Stimulus II	Stimulation setup
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms	ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	USB-ME128-System	MEA setup
Multi-electrode array	MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	EcoFlexMEA36	MEA setup
Multi-electrode array recording software	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	MC_Rack	MEA setup
Spring scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15003-08	Heart Preparation
Strabismus Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14575-09	Heart Preparation
Mayo Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14110-15	Heart Preparation
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11203-25	Heart Preparation
London Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11080-02	Heart Preparation
Narrow Pattern Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11003-13	Heart Preparation
Plastic Wrap	Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States		Consumable Materials
Stereomicroscope	Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany		FRET
LED	CoolLED, Andover, UK	pE-100	FRET
DualView	Photometrics, Tucson, AZ, USA	DV2-SYS	FRET
DualView filter set	Photometrics, Tucson, AZ, USA	05-EM	FRET
optiMOS scientific CMOS camera	Qimaging, Surrey, BC, Canada	01-OPTIMOS-R-M-16-C	FRET
Imaging software	Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA		FRET
Analysis Software	Image J software; Public Domain, NIH, USA		FRET