JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

עיכוב רקמות ספציפיות microRNA היא טכנולוגיה זה לא מפותח בתחום microRNA. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול לעכב ממשפחת מיר-181 microRNA בתאים myoblast בהצלחה מכל הלב. טכנולוגיית Nanovector משמש כדי לספק microRNA ספוג המדגים משמעותי ויוו אירובי ספציפיים מיר-181 משפחה עיכוב.

Abstract

MicroRNA (miRNA) הוא קטן ללא קידוד RNA אשר מעכב את הביטוי post-transcriptional RNA שליח (mRNA). מחלות אנושיות, כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם, הוכחו להפעיל רקמות ו/או ביטוי miRNA תא ספציפיים הקשורים עם התקדמות המחלה. עיכוב של הביטוי miRNA מציע את פוטנציאל התערבות טיפולית. עם זאת, הגישות המסורתיות לעכב miRNAs, העסקת antagomir oligonucleotides, להשפיע על פונקציות ספציפיות miRNA במסירה גלובלית. במסמך זה, אנו מציגים עבור ויוו אירובי ספציפיים עיכוב של משפחת מיר-181 פרוטוקול במודל של עכברים. מבנה miRNA-הספוג נועד לכלול 10 רצפים חוזרים ונשנים איגוד אנטי-miR-181. יזם סיבולת לב ריאה ספציפיים α-MHC שוכפל לתוך עמוד השדרה pEGFP לנהוג הביטוי אירובי ספציפיים מיר-181 miRNA-ספוג... כדי ליצור תא יציב קו לבטא את מיר-181-ספוג, תאים H9c2 myoblast transfected עם הבונה α-MHC-EGFP-miR-181-sponge וממויינות לפי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACs) לתוך תאים H9c2 חיובי GFP אשר מתורבתים עם neomycin (G418). בעקבות צמיחת יציב neomycin, תא monoclonal אוכלוסיות הנקבעים על-ידי FACs נוספים, שיבוט תא בודד. התאים H9c2-מיר-181-ספוג-GFP myoblast וכתוצאה מכך נספח אובדן התפקוד של בני משפחתו מיר-181 כפי העריך דרך ביטוי מוגבר של חלבונים היעד מיר-181, לעומת תאים H9c2 לבטא ספוג פונקציונלי לטרוף. בנוסף, אנו מפתחים nanovector למסירה מערכתית של הבונה מיר-181-ספוג מאת complexing טעונה באופן חיובי liposomal חלקיקים של אניון פלסמידים מיר-181-ספוג. In vivo הדמיה של GFP מגלה כי מספר הזנב וריד זריקות של nanovector בתקופה של שלושה שבועות הם מסוגלים לקדם ביטוי משמעותי של מיר-181-הספוג באופן ספציפי סיבולת לב ריאה. חשוב, לאובדן של מיר-181 פונקציה הוא ציין את רקמת הלב אך לא הכליות או הכבד. MiRNA-הספוג היא שיטה חזקה כדי לעכב את הביטוי miRNA רקמות ספציפיות. נסיעה הביטוי miRNA-הספוג מקדם רקמות ספציפיות מספק ירידה לפרטים על עיכוב miRNA, אשר יכול להיות מבודד יישוב איברים או רקמות. יתר על כן, שילוב של טכנולוגיות nanovector ו- miRNA-הספוג מאפשר יעילה, רקמות ספציפיות miRNA עיכוב ויוו.

Introduction

בשני העשורים האחרונים, נעשו מחקרים רבים הצביעו על תפקיד משמעותי miRNAs בהתפתחות מחלות אנושיות. ממצאים מתוך גוף גדול של ספרות להדגים את חשיבותה להכחיש miRNAs בהתפתחות הפתופיזיולוגיה של מחלות, כמו סרטן1 ו-4,3,של מחלות לב וכלי דם2,5. לדוגמה, מיר-21 הוא upregulated ב סרטן רבים, וכתוצאה מכך מוגברת מחזור התא והתא התפשטות6. הפטיטיס C זיהומים, 122-מיר ממלא תפקיד חשוב ב השכפול של וירוס7, הוכח כי עיכוב של מיר-122 מקטין את העומס הנגיפי8. ב. היפרטרופיה, מיר-212/132 הוא upregulated בלב והוא מעורב פנוטיפ פתולוגיים9. החשיבות הברורה downregulation או עיכוב פונקציונלי של miRNA upregulated מציע הזדמנויות רפואית תוך ניצול הביולוגיה miRNA, כמעט כל המחלות.

בני המשפחה ארבעה מיר-181, מיר-181a/b/c/d, מצויים שלושה מיקומים גנומית הגנום האנושי. האזור intronic ללא קידוד RNA מארח גנים (MIR181A1-HG) מקודד האשכול של מיר-181-/ b-1. האזור intronic של הגן NR6A1 מקודד את מיר-181-/ b-2. האשכול מיר-181-c/d הינו ממוקם על תעתיק uncharacterized על כרומוזום 19. כל מיר-181 בני המשפחה לשתף אותו רצף "זרע", כל בני המשפחה ארבע של מיר-181 פוטנציאלי יכול לווסת את המטרות mRNA זהה.

אנחנו3,4 ואחרים10 הדגישו את החשיבות של בני משפחתו מיר-181 במהלך לאי-ספיקה סופנית. אנחנו גם מזהה כי קולטנים upregulation מיר - 181c מתרחשת בתנאים פתולוגיים הקשורים לסיכון מוגבר למחלות לב, כגון סוג סוכרת II, השמנה, הזדקנות3,4,5. זה היה שמהווה ביטוי של מיר - 181c גורם סטרס חמצוני, מה שמוביל בתפקוד הלב4.

מספר קבוצות הראו כי miRNA קיים המיטוכונדריה11,12,13,14, אבל אנחנו היינו הראשונים להדגים את מיר - 181 c נגזר מן הגנום הגרעיני, עיבוד, ו לאחר מכן translocated המיטוכונדריה RISC3. יתר על כן, זיהינו ביטוי נמוך של מיר-181a ומיר-181b בתוך התא מיטוכונדריאלי של הלב5. חשוב, מצאנו את מיר - 181c represses הביטוי mRNA mt-COX1, ובכך הוכחת כי miRNAs להשתתף בוויסות גנטי מיטוכונדריאלי, לשנות את הפונקציה מיטוכונדריאלי3,4.

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה נדרש לעצב miRNA-ספוג כדי להפיל את כל המשפחה מיר-181 ב cardiomyocytes. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות פרוטוקול של יישום ויוו מיר-181-הספוג.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס.

1. ספוג עיצוב

  1. MicroRNA מחייב 3' UTR
    הערה: A miRNA פונקציות דרך ספציפית אינטראקציות שיוך הבסיס לאתרים משלימים חלקית באזור 3' לא מתורגם (UTR) של mRNAs היעד שלה (לסקירה מקיפה, ראה ברטל)15.
    1. לעצב את מעכבי miRNA הביטוי כמו oligonucleotides המכילים משמעותי משלימים את החסר רצף miRNA. Sequester miRNA ב oligonucleotide מורכבים באמצעות זיווג בסיס נרחב כדי לחסום את הפונקציה miRNA.
  2. העיצוב של ספוג miRNA
    1. עיצוב tandemly ערוכים רצפים miRNA משלימים חלקית כדי לכלול בליטה במיקום ביקע בדרך כלל על-ידי Argonaute 2. הבליטה ממוקמת ב נוקלאוטידים 9-12 של הרצף miRNA בוגרת כדי למנוע כל RNA הפרעות סוג מחשוף והשפלות של הספוג.
    2. אם רצונך בכך, לעצב את רצף המטרה דמה כדי לאגד את כל בני המשפחה מיר-181. על בחינה והשוואה של הרצף miRNA משפחה מיר-181, למצוא רצף נפוצות בקצה 5'-על הבליטה המכיל נוקלאוטידים רצופים 8, או למצוא רצף משותפים לכל בני המשפחה 4 של מיר-181 על 3'-הצד של הבליטה של 8 נוספים נוקלאוטידים רצופים. רצפי 2 אלה מייצגים את אתרי קשירה חצי ימינה ושמאלה, בהתאמה.
      הערה: רצף דמה הוא מערך טנדם האתרים מחייב חצי ימינה ושמאלה המופרדות על-ידי כרווח לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה. הקישור יחד את הרצף 5'-סוף ואת הרצף 3' בצד (שמתואר בשלב 1.2.2) עם כרווח לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה שנועדה ליצור הבליטה כאשר annealed כדי miRNA (כפי שמתואר בשלב 1.2.1). חזור על זה אתר קישור 1 miRNA 10 x בהבונה מיר הסופי-ספוג.
  3. שיקולים אחרים ספוג miRNA
    הערה: על כדי לשכפל את רצף ספוג לתוך הווקטור ביטוי הנמען, הגבלת נוקלאז זיהוי אתרים חייב להיות כלול בכל קצה של הרצף. ניתוח מערכת העיכול סיליקו אמור לשמש כדי לאשר את המחשוף לא ספציפית של הרצף ספוג על ידי אנזימי הגבלה שבחרת את שאר אנזימי הגבלה בשימוש ביישומים שיבוט במורד הזרם.
    1. להוסיף זוגי stop codon (TAA TAA) בקצה 5'-של סינתטי 3' UTR, כך הרצף מיר-181-ספוג הוא לא חלק רצף קידוד עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) משופרת.
  4. סינתזה של הספוג דנ א לקראת שיבוט
    1. השתמש סינתיסייזר דנ א או להעסיק מקור זמין מסחרית לסנתז את רצף ספוג miRNA הסופי עם הגבלת נוקלאז אתרי זיהוי מקום עבור השיבוט. הספוג נשלח על פלסמיד שיכול להכיל סמנים לבחירה עבור הגברה חיידקים. עוד, הספוג יכול להיות מוגבר על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) לקראת שיבוט או פשוט נשרתי הווקטור התורם באמצעות האתרים ההגבלה המתוארת בשלב 1.3 (ראה גם שלב 3.1).

2. שיבוט הווקטור נמענים לכלול מקדם רקמות ספציפיות

הערה: השתמש וקטור pEGFP-C1 כמו וקטור הנמען בקלטת ביטוי בספוג miRNA. וקטור pEGFP-C1 מכיל מסגרת הקריאה עבור EGFP מונע על ידי יזם cytomegalovirus (CMV). האמרגן CMV פעיל צורונים בתאי יונקים. אם מקדם רקמות ספציפיות נדרשת, האמרגן CMV ניתן להסיר על ידי עיכול של אנזימים AseI ו- NheI (ראה שלב 2.1). פלסמיד מכיל נרחב באתר שיבוט מרובים (MCS) גם kanamycin (קאן), neomycin (G418) סמנים עבור מבחר של חיידקים, ביטוי יציב בתרבית של תאים, בהתאמה.

  1. הסרת האמרגן CMV pEGFP-C1
    1. להקל μL 50 של עיכול תגובה המכיל 1 x מאגר זמין מסחרית תקציר שהוצעה על ידי ייצור אנזימי הגבלה בשימוש, 5 μg של פלסמיד דנ א (במים), ו 5 μL כל של אנזימים AseI ו- NheI. להוסיף רכיבים כל צינור microcentrifuge ומערבבים בעדינות אותם על ידי מצליף זה. לסובב את הצינור 10 s ב- microcentrifuge כדי לאסוף את התגובה בתחתית. דגירה התגובה באמבט מים 37 º C למשך 15 דקות.
    2. לטהר את פלסמיד ליניארית מעוכל. מוסיפים 5 x נפח התגובה של עמודת איגוד מאגר (שילוב קניינית של המאגר איגוד מתאים לייצור של העמודות טיהור DNA בשימוש), לטהר את התגובה עם עמודה של טיהור DNA כפי שתואר על ידי היצרן. Elute עם μL 25 • תנאי מאגר (מים) הוסיף בזהירות אל המרכז של העמודה.
    3. ג'ל לטהר את פלסמיד מתעכל על 0.5% agarose ג'ל כדלקמן: להוסיף 5 μL של טעינת מאגר (50% גליצרול-3 x טוען צבע) פלסמיד eluted. לטעון המדגם כולו לתוך 1 גם על 0.5% agarose ג'ל. כוללים מסלול נפרד עם 500 ננוגרם של וקטור נימולים. להפעיל אותו במשך 30-40 דקות עד הפרדה נאותה של פלסמידים לשמור על נימול מושגת.
    4. לטהר את פלסמיד ליניארית כדלקמן: להמחיש את ה-DNA הג'ל agarose על קופסת אור UV. עם סכין גילוח נקי, נכנסים בזהירות הלהקה התואם פלסמיד ליניארי.
      הערה: פלסמיד ליניארי לפעול נמוך יותר מאשר פלסמיד נימולים, יופיע כלהקה יחיד כ 4.2 kb. האמרגן CMV נכרת תופיע להקת אור-כ-500 נוקלאוטידים (nt).
    5. לחלץ את ה-DNA של הפרוסה ג'ל באמצעות ערכת זמינים מסחרית, elute ה-DNA מהעמוד עם 25 μL של מים.
  2. שיבוט מקדם ספציפיות הלב לתוך pEGFP-C1
    הערה: מקדם אלפא-צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה (α-MHC) יש כבר בעבר מאופיין והפגינו לכוון חזקים רמות ביטוי מוגבלת הלב כפי שמתואר את הבאים Molkentin, Jobe מארקהם16. הסעיפים הבאים מתארים כיצד להגביר את המקדם של וקטור לקראת שיבוט.
    1. לשכפל את המקדם α-MHC בין רכיבים +420 כדי-2934 ביחס אתר התחלת שעתוק לתוך פלסמיד p40 ה16 על ידי הראשון בעיצוב תחל PCR מחזיתות באזור זה, ולאחר מכן את פלסמיד כתבנית עבור ה-PCR. להגביר את האזור יזם באמצעות PCR תחל שתואר לעיל5. תחל PCR ואחורה מכילים רצפים של חפיפה לקצה מתעכל pEGFP-C1 (שלב 2.1) כדי לאפשר ב- Fusion ביים שיבוט. עיין בספר ההדרכה של-Fusion לקבלת הסבר מקיף של העיצוב תחל לקראת שיבוט ב- Fusion. פריימר רצפים מצויים טבלה 1.
    2. להכין ריאקציה PCR 50 μL, אשר מכיל 1 μM כל פריימר ו-10 ננוגרם של תבנית ה-DNA. להוסיף את הכמות המתאימה של אנזים ה-PCR, dNTPs בהתאם לייצור ריאגנטים PCR שבחרת. לבצע PCR על גוש אופניים תקן ה-DNA. מבצע דקה 3 98 ° C denaturing צעד, ואחריו מחזורי 35 של denaturing, חישול, הרחבה עבור 5, 30 ו- 120 s כל אחת, בהתאמה. כוללים סיומת הסופי של 10 דקות-72 מעלות צלזיוס.
    3. לנקות את מיצוי PCR וג'ל. עם סיום של מחזור ה-PCR, להוסיף 5 x נפח התגובה של המאגר איגוד עמודות התגובה PCR, לטהרו עם עמודה של טיהור DNA כפי שתואר על ידי היצרן. Elute את התערובת עם μL 25 • תנאי מאגר (מים) הוסיף בזהירות אל המרכז של העמודה.
      1. להוסיף 5 μL של טעינת מאגר [50% גליצרול (3 x) טוען צבע] כדי פלסמיד eluted. לטעון המדגם כולו לתוך 1 על 1% agarose ג'ל. להפעיל אותו במשך 30-40 דקות; המחש, לסלק את המוצר PCR כפי שתואר לעיל (שלב 2.1.5).
    4. מאתרים ומפסיקים את המקדם α-MHC עם pEGFP-C1 כדלקמן: להוסיף את התגובה מצדו 10 μL המכיל 1 x מאגר זמין מסחרית מצדו μL 2 של ה-PCR מטוהרים, μL 1 של וקטור ליניארית. לבצע את מצדו ב 50 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואז צנני את זה על קרח.
    5. לבצע טרנספורמציה חיידקי כדלקמן: transfect 50 μL של תאים מוכשר עם 2.5 μL של תוך-Fusion מצדו מיקס על ידי הוספת הרכיבים. לנוח גלאים את הצינור על קרח למשך 20 דקות, לשים את זה בתוך אמבט מים 42 ° C עבור s 40, ולאחר מכן מקם את הצינורית על קרח למשך 2 דקות.
      1. בעקבות השינוי, להוסיף 350 μL של התקשורת SOC, לגדל תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות צלחת 200 μL של תוצר פתרון על צלחות ליברות עם קאן לבצע מושבה PCR לזהות תאים עמידים קאן אשר מכילים מצדו יזם את α-MHC.
        הערה: תחל ההקרנה נועדו PCR על פני הצומת מצדו.
    6. הרחב את השיכפולים PCR חיובי מרק LB-קאן, פלסמידים לטהר על-ידי הכנה מיני רגיל פלסמיד טיהור פרוטוקולים כפי שתואר על ידי היצרן.

3. שיבוט הספוג

  1. לעכל את הווקטור הנמען
    1. להפוך את פלסמיד α-MHC-pEGFP לינארי לקראת שיבוט עם EcoRI, KpnI, ולטהר את הג'ל כמתואר לעיל (שלב 2.1).
  2. PCR להגביר ולעכל את הספוג דנ א
    1. השתמש לטרוף 284-nt-ארוך משלוח וקטורים כתבנית עבור ה-PCR של מיר-181-ספוג, המתאימים. להגביר את האזור ספוג באמצעות PCR שתואר לעיל תחל5. שימו לב כי תחל PCR ואחורה מכילים רצפי אנזים הגבלה להתיר מצדו לתוך α-MHC-pEGFP-C1. לבצע PCR כפי שתואר לעיל (שלב 2.2.2). לטהר את המוצרים PCR לפני לעיכול כמו שמתואר (שלב 2.2.3) ו eluted אותם עם מים למערכת העיכול. ראו פריימר רצפים, טבלה 1-
    2. לעכל את הספוג DNA עבור מצדו. תגובת מערכת העיכול 50 μL מכיל 1 x תקציר מאגר, התגובה PCR מטוהרים-ג'ל מהשלב 3.2.1 ו μL 5 של אנזימים EcoRI והן KpnI. להוסיף רכיבים כל צינור microcentrifuge ומערבבים בעדינות אותם על ידי מצליף זה. לסובב את הצינור 10 s ב- microcentrifuge כדי לאסוף את התגובה בתחתית. דגירה התגובה באמבט מים 37 º C למשך 15 דקות.
    3. לטהר את הספוג PCR מתעכל באמצעות PCR לנקות עמודה כפי שתואר לעיל (שלב 2.2.1).
  3. מאתרים ומפסיקים מיר-181-הספוג לתוך וקטור α-MHC-pEGFP-C1
    1. הגדרת תגובת מצדו μL 21 אשר מכיל מאגר מצדו x 1, 3 μL של מתעכל מטוהרים מיר-181-ספוג PCR, μL 1 של וקטור α-MHC-pEGFP-C1 ליניארית, מאגר דנ א x 1 ו- 1 μL של ה-DNA ליגאז. לבצע את מצדו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ולאחר מכן מקם את זה על קרח.
    2. להפוך μL 50 תאים המוסמכת XL1-כחול עם 2 μL של מיקס מצדו. השתמש הטרנספורמציה יופיצ פרוטוקולים כפי שתואר לעיל (שלב 2.2.5). לבצע מושבה PCR לזיהוי חיידקים עמידים קאן אשר מכילים את רצף α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge הנכון. עיצוב תחל ההקרנה ל- PCR פני הצומת מצדו. ראה טבלה 1 רצפים של פריימר.
    3. להגביר, רצף וקטור. הרחב PCR שיבוטים חיובי מרק LB-קאן, פלסמידים לטהר על-ידי הכנה מיני רגיל פלסמיד טיהור פרוטוקולים. ביצוע של רצפי DNA כדי לאמת את פלסמיד לבטא את רצפי DNA הרצוי.

4. דור של תאים המבטאים מיר-181-ספוג H9c2 יציב

  1. צמיחה ותחזוקה של תאים H9c2
    1. תרבות H9c2 תאים בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) המכילה סרום שור עוברית (FBS) כדי ריכוז סופי של 10%. תת התרבות התאים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, לגדל אותם ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו-חמצני.
  2. תרביות תאים ומבחר H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge לבטא תאים
    1. ביצוע של אלקטרופורציה של תאים H9c2 לקבלת התוצאות הטובות ביותר. Transfect חולדה myoblasts (H9c2) עם ספוג לטרוף (רצף לטרוף 284-nt-ארוך אשר מחליף את מיר-181-הספוג-הרצף) או הבונה α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge עם electroporator.
      1. בקצרה, transfect 4 x 10-5 תאים עם 2 μg של פלסמיד ה-DNA (ב 5 µL של H2O) ו- 100 µL תואם התקן אלקטרופורציה פתרון. השתמש תוכנית אלקטרופורציה של DS-120 כדי transfect את התאים H9c2.
      2. דגירה התאים transfected cuvette 10 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף 500 µL של DMEM ישירות cuvette. בעדינות להעביר את התוכן cuvette סה כ טוב של צלחת 6-. טוב.
    2. בחר תאים חיוביים GFP לאחר 48 שעות שלאחר תרביות תאים על-ידי FACs. צלחת רק תאי ביטא-GFP לתוך צלחת 6-ובכן עם תוספת של neomycin (G418) (400ng/mL) בכלי התקשורת צמיחה מלאה.
      הערה: לפני הבחירה G418, עיקול להרוג גלובאלים כדי לקבוע את כמות neomycin נדרש עבור הבחירה. עבור תאים H9c2, 400 ננוגרם למ"ל של G418 כתוצאה כ 80% שיעור המוות של פלסמיד שאינו transfected H9c2 תאים לאחר 24 שעות, נחשב הריכוז הרצויה עבודה של G418 עבור תאים אלה. שורת התאים נחשב יציב לאחר צמיחה נשמר ב- G418 16 ימים.
    3. לבצע את המיון FACs של התאים G418 יציבה באמצעות הביטוי של GFP כסמן עבור מבחר חיובי ספוג. זרע 5-10 תאים כל טוב של צלחת 96-ובכן על-ידי מיון-זרימה. הרחב את התאים monoclonal מהצלחת 96-ובכן ובכן 24 צלחות מעל כמה מעברים. שימוש מניות המקפיא של תאים מן המעבר 3 תאים (P3) כנקודת ההתחלה לניסויים הבאים.
    4. לבצע כל תא-קו מבוססי ניסויים עם תאים נמוך-מעבר בין P5 ו P10.

5. סינתזה ולטיהור ספוג-חלקיקים (מיר-181-ספוג חלקיקים)

  1. הכן על חלקיקים liposomal על ידי המסת cationic אמפיפיליות (DOTAP), שומנים שיתוף, כולסטרול ועוד DSPE-פג-הביתה, על יחס 5:5:0.1 מ מ, בהתאמה, בתערובת של כלורופורם, מתנול, בקבוקון זכוכית.
  2. הסר את הממס האורגני-44-45 ° C, תחת ואקום באמצעות המאדה, ואחריו זרם עדין של חנקן ללא לחות. לשמור על הסרט מיובשים הנותרים של השומנים תחת ואקום גבוה עבור 8 שעות.
  3. להכין תערובת על-ידי הוספת 5% גלוקוז הסרט השומנים מיובשות ואקום. . תשאיר את זה בן לילה כדי לאפשר את תערובת זו מימה הסרט מערבולת המבחנה למשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר על מנת לייצר שלפוחית multilamellar ברעידות ומדי פעם באמבט מים 45 ° C.
    1. Sonicate השלפוחיות המוגלתיות multilamellar להכשיר שלפוחית קטנה unilamellar באמבט קרח למשך 3-4 דקות עד בהירות יכול להיות שנצפו, של 100% מחזור ו W 25 הספק.
  4. מערבבים רצף לטרוף או רצף מיר-181-ספוג משובטים לתוך pEGFP(α-MHC) וקטורים של ליפוזום על בסיס יחס 1:3 תשלום כדי ליצור את nanovector4.
    הערה: קומפלקס אלקטרוסטטית של חלקיקים liposomal מפרוטונים שמטענם ואניון פלסמיד DNA מכונה של nanovector.

6. מערכתית מסירת ספוג-חלקיקים ואימות של תופעות In Vivo

  1. משלוח מערכתית של ספוג-חלקיקים בחולדות
    1. השתמש חולדות ספראג-Dawley (SD). להזריק את החולדות לווריד עם nanovector מיר-181-ספוג או לטרוף nanovector דרך הווריד של הזנב. השתמש חולדות זכרים SD, המהווים כ- 200 גרם במשקל הגוף.
    2. ביצוע הזריקה וריד הזנב באמצעות מינון של 4 מ ג של nanovector/ק"ג משקל גוף וחזור זה באמצעות משטר של 6 זריקות וריד הזנב מעל 2 שבועות. בעקבות המשלוח nanovector חוזרות ונשנות, לאפשר תקופה 1-בשבוע (ימים 15-21) לביטוי וקטור בתוך vivo.
    3. לאשר אופטימיזציה על ידי הדמיה האות GFP לפני, במהלך, ואחרי משלוח nanovector. לנתח את האות ה-GFP טומוגרפי תוכנות הדמיה, אשר מפיק נתונים כמותיים למחצה.
  2. אימות של ויוו מיר-181 עיכוב על ידי מיר-181-הספוג
    1. לבצע תספיג כדי להדגים את הביטוי של תפקודי מיר-181-ספוג בתוך רקמת הלב.
      הערה: במחקר זה, mt-COX1 הביטוי נבדק.
  3. השלכות תפקודיות משמעותיות ויוו מיר-181-ספוג הביטוי בלב
    1. לבצע אקוקרדיוגרפיה מימדי M-mode, דופלר במהלך ואחרי המסירה nanovector כדי לנתח את תפקוד הלב ואת שינויים מורפולוגיים. לשימוש קיבולת כדאי סריקה בליבם מכרסמים, מערכת סאונד מאובזר עם מתמר מערך ליניארי 15 מגה-הרץ.
    2. הרדמה עשויים להשפיע את contractility לב; לכן, לבצע את המשלוח של מיר-181-ספוג nanovector או nanovector לטרוף בעלי חיים הנמצאים בהכרה וללא כל ריאגנט הרדמה במהלך תהליך אקוקרדיוגרפיה. נא עיין Das, ואח. 4 לבירור נוסף.

תוצאות

בתאים stably transfected pEGFP-מיר-181-ספוג-לבטא H9c2 (מתוך שלב 4.2), הביטוי של מיר-181 לכל המשפחה (מיר-181a, מיר-181b, מיר - 181c ו- d מיר - 181) היה ירד במתינות יחסית pEGFP-מקושקשות-הבעת תאים H9c2. MiR-181-ספוג משמש כמעכב תחרותי של מיר-181 המשפחה, כך שציפינו כי הביטוי של מיר - 181c מיטוכונדריאלי למקד ג'ין, mt-COX1, יגדל. ת...

Discussion

המאמר תיאר את העיצוב ואת סינתזה של miRNA-ספוג, הדגימו כיצד הביטוי רקמות ספציפיות של הספוג הוא כלי רב עוצמה כדי לעכב את הביטוי משפחה miRNA רקמות ספציפיות.

הראו משפחה מיר-181 מיקוד ספוג יכול להיות משובטים לתוך פלסמיד ביטוי עם מקדם ספציפיות הלב. פלסמיד שניתן לארוז ביעילות לתוך חלקיק na...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים אנתוני ק' ל' ליונג של המחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית, בלומברג בית הספר לבריאות הציבור, אוניברסיטת ג'ונס הופקינס טכנית שלו לעזור בעיצוב הבונה מיר-181-ספוג. אנו מודים גם פולינה Sysa-שאה, קתלין Gabrielson של המחלקה של מולקולרית ו Pathobiology השוואתית, מוסדות ג'ונס הופקינס לרפואה לסיוע טכני שלהם על ידי ההדמיה ויוו miRNA-הספוג דמי משלוח.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH, HL39752 (כדי צ'ארלס Steenbergen) על ידי מענק פיתוח מדען מן 14SDG18890049 American Heart Association (כדי Samarjit Das). האמרגן אירובי ספציפיים עכברוש סופק בנדיבות על ידי ג ' פרי Molkentin ד בבית החולים לילדים בסינסינטי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
pEGFP-C1 vectorAddgene6084-1
In-fusionClontech121416
QIAprep MiniprepQiagen27104
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
miR-181-sponge synthesisIntrogen GeneArtcustome made
PCR primersIntegrated DNA Technologiescustome
EcoRI enzymesNew Endland BiolabsR0101S
KpnI enzymesNew Endland BiolabsR0142S
Rapid DNA Ligation KitSigma-Aldrich11635379001
H9c2 cellsATCCCRL-1446
DMEM MediaThermo Fisher Scientific11965092
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10082139
Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1)LonzaVCA-1005
G418, GeneticinThermo Fisher Scientific11811023
FACSAria II Flow cytometerBD Bioscience644832
Branson 450 sonifierMarshall ScientificEDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging deviceCaliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibodyAbcamab14705
α-tubulin antibodyAbcamab7291
Sequoia C256 ultrasound systemSiemens

References

  1. Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
  2. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
  3. Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
  4. Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
  5. Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
  6. Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
  7. Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
  8. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  9. Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
  10. Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
  11. Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
  12. Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
  13. Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
  14. Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  16. Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
  17. Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
  18. Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
  19. Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
  20. Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
  21. Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
  22. Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
  23. Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
  24. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  25. Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
  26. Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
  27. Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
  28. Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
  29. Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
  30. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
  31. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  32. Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
  33. Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
  34. Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
  35. Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
  36. Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
  37. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  38. Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
  39. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  40. Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136MicroRNAmiRNAmiRNAmiRNAnanovector181miRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved