JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Doku özel mikroRNA inhibisyon mikroRNA alanında az gelişmiş bir teknolojidir. Burada, biz başarılı bir şekilde myoblast hücreleri miR-181 mikroRNA ailesinde kalp etkisizleştirmek için bir protokol tanımlamak. Nanovector teknoloji önemli vivo kardiyo özgü miR-181 aile inhibisyon gösteren sünger bir mikroRNA amacıyla kullanılabilir.

Özet

MikroRNA (miRNA) küçük çoğu mesajcı RNA (mRNA) ifade inhibe RNA kodlamayan. İnsan hastalıkları, kanser ve kardiyovasküler hastalık, gibi doku ve/veya hastalık ilerlemesi ile ilişkili hücre özgü miRNA ifade etkinleştirmek gösterilmiştir. MiRNA ifade inhibisyonu bir terapötik müdahale için potansiyel sunmaktadır. Ancak, miRNAs, antagomir oligonucleotides, istihdam etkisizleştirmek için geleneksel yaklaşımlar belirli miRNA işlevleri küresel teslim üzerine etkiler. Burada, bir sıçan modelinde bir protokol miR-181 aile içinde vivo kardiyo özgü inhibisyonu için mevcut. MiRNA-sünger yapı 10 tekrarlanan miR-181 bağlayıcı sıraları içerecek şekilde tasarlanmıştır. Kardiyo özgü α-MHC organizatörü kardiyo özgü miR-181 miRNA-sünger ifade sürmeyi pEGFP omurga klonlanmış. İstikrarlı bir hücre oluşturmak için ifade miR-181-sünger, myoblast H9c2 hücre satırı sahip α-MHC-EGFP-miR-181-sponge yapı transfected ve floresan aktif hücre paromisin ile kültürlü GFP olumlu H9c2 hücre içine (FACs) sıralama göre sıralanmış (G418). Paromisin istikrarlı büyüme, monoklonal hücre popülasyonlarının ek FACs ve tek hücre klonlama tarafından oluşturulur. Elde edilen myoblast H9c2-miR-181-sünger-GFP hücreleri yoluyla miR-181 hedef proteinlerin ifade artan değerlendirildi gibi miR-181 aile üyelerinin fonksiyon kaybı sergi ve kapış işlevsel olmayan sünger ifade H9c2 hücrelere kıyasla. Buna ek olarak, tarafından olumlu liposomal nano tanecikleri kullanılıyorsa ve olumsuz miR-181-sünger plazmid tahsil kompleks bir nanovector miR-181-sünger yapı sistemik teslim etmek için geliştirmek. GFP in vivo görüntüleme bir nanovector, üç haftalık süre içinde birden fazla kuyruk ven enjeksiyonları miR-181-sünger önemli bir ifade bir kardiyo özgü şekilde tanıtmak mümkün olduğunu ortaya koymaktadır. Önemlisi, miR-181 fonksiyon kaybı kalp doku ama böbrek veya karaciğer içinde görülmektedir. MiRNA-sünger doku özgü miRNA ifade etkisizleştirmek için güçlü bir yöntemdir. MiRNA-sünger ifade bir doku özgü organizatörü sürüş özgüllük bir hedef organ veya doku binayla miRNA inhibisyonu için sağlar. Ayrıca, nanovector ve miRNA-sünger teknolojileri birleştirerek bir etkili teslim ve doku özgü miRNA inhibisyon vivo içindeverir.

Giriş

Son yirmi yılda insan hastalığında miRNAs önemli rol işaret çok sayıda çalışma yapılmıştır. Edebiyatı büyük gövdeli bulgular miRNAs kanser1 ve kardiyovasküler hastalık2,3,4,5gibi hastalıkların Patofizyoloji yadsınamaz önemini göstermek. Örneğin, miR-21 upregulated birçok kanserleri, sonuçlanan bir artan hücre döngüsü ve hücre proliferasyonu6' dir. Hepatit C enfeksiyonu, miR-122 virüs7çoğaltma içinde önemli bir rol oynar ve miR-122 inhibisyonu viral yük8azalır kanıtlanmıştır. İçinde kalp hipertrofisi, miR-212/132 upregulated ' kalbinde ve patolojik fenotip9' ilgilenmektedir. Bariz önemini downregülasyon ya da işlevsel bir upregulated miRNA inhibisyonu tedavi amaçlı hemen hemen tüm hastalıklar miRNA biyolojide istismar için fırsatlar öneriyor.

Dört miR-181 aile üyeleri, miR-181a/b/c/d, insan genomu üç genomik konumlarda bulunur. Kümenin miR-181-a/b-1'in bir kodlamayan RNA ana bilgisayar gen (MIR181A1-HG) intronic bölge kodlar. NR6A1 gen intronic bölge miR-181-a/b-2 kodlar. MiR-181-c/d küme uncharacterized bir transkript kromozom 19 üzerinde yer alır. Tüm miR-181 aile üyeleri aynı "tohum" sıra paylaşmak ve tüm dört miR-181 aile üyeleri büyük olasılıkla aynı mRNA hedefleri düzenleyen.

Biz3,4 ve diğerleri10 önemini miR-181 aile fertleri sırasında son aşama kalp yetmezliği parlak nokta. MiR - 181 c upregulation bir tip II diyabet gibi kalp hastalığı riski, obezite ve yaşlanma3,4,5ile ilişkili patolojik şartlar altında gerçekleşir de tanımış. Overexpression miR - 181 c kardiyak disfonksiyon4' e uzanan oksidatif stres nedenleri öne.

Çeşitli gruplar miRNA mitokondri11,12,13,14' te var, ama o miR - 181 c işlenen, nükleer genom türetilmiştir göstermek için ilk tavsiye ettiler ve sonradan mitokondri RISC3için translocated. Ayrıca, kalp5mitokondrial kompartımanda miR-181a ve miR-181b düşük bir ifade tespit etti. Da önemlisi, o miR - 181 c mt-COX1 mRNA ifade represses böylece miRNAs mitokondrial gen düzenlemesi katılmak ve mitokondriyal işlev3,4alter gösteren bulduk.

Bu makalede cardiomyocytes tüm miR-181 ailesinde aşağı vurmak için bir miRNA sünger tasarlamak için gerekli yöntemi anlatılmaktadır. Ayrıca, bir protokol miR-181-sünger vivo içinde uygulanması için anahat.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. sünger tasarım

  1. MikroRNA 3' UTR bağlama
    Not: A miRNA işlevleri belirli temel eşleştirme etkileşimlerin 3' çevrilmeyen bölgesi (UTR) kısmen tamamlayıcı siteleri ile onun hedef mRNA'ların aracılığıyla (kapsamlı bir inceleme için bkz: Bartel)15.
    1. MiRNA ifade olarak önemli tamamlayıcılık miRNA sıra içeren oligonucleotides inhibitörleri tasarlayın. Bir oligonükleotid miRNA işlevini engellemek için karmaşık geniş baz eşleşmesi yoluyla içinde miRNA çekilmek.
  2. MiRNA sünger tasarım
    1. Tasarım tandemly bir çıkıntı normalde Argonaute 2 tarafından i ciddi konumundaki dahil etmek için kısmen tamamlayıcı miRNA dizileri serilir. Çıkıntı herhangi bir RNA parazit türü bölünme ve sünger bozulma önlemek için olgun miRNA sırasının nükleotit 9-12 yer alıyor.
    2. İsterseniz, tüm miR-181 aile üyelerine bağlamak için yem hedef sıra tasarlayın. Üzerine bir inceleme ve karşılaştırma miR-181 aile miRNA sıralarının, ortak bir dizi de 5'-tarafından 8 ardışık nükleotit içeren Bulge, ya da bir sıra tüm 4 miR-181 aile üyeleri için ortak 3'-tarafındaki Ek 8 çıkıntı bul. ardışık nükleotit. 2 bu dizilere sırasıyla sol ve sağ yarım bağlayıcı siteleri temsil eder.
      Not: Yem sıra GGA ayırıcı tarafından ayrılmış sağ ve sol yarım bağlayıcı siteleri bir tandem dizisidir. Birlikte 5' uç sıra ve (1.2.2. adımda açıklanan) 3' yanı sıra ne zaman (1.2.1 adımda anlatıldığı gibi) bir miRNA komplementer çıkıntı oluşturmak için tasarlanmış GGA rondela ile bağlantı. Bu 1 miRNA bağlama sitesi 10 x son miR-sünger seçenekli.
  3. MiRNA sünger ile ilgili diğer konular
    Not: alıcı ifade vektör içine Sünger sıra klon için kısıtlama nükleaz tanıma siteleri dizisinin her iki uçta dahil edilmelidir. Bir silico sindirim analiz sünger sırası belirsiz bölünme onaylamak için seçilen enzimleri ve aşağı akım klonlama uygulamalarında kullanılan diğer enzimleri tarafından kullanılmalıdır.
    1. MiR-181-sünger Serisi Gelişmiş bir yeşil flüoresan protein (EGFP) için kodlama sırasına değildir öyle ki Çift Kişilik kodonu (TAA TAA) 5'-sonunda, sentetik 3' UTR, ekleyin.
  4. Klonlama için sünger DNA sentezi
    1. Bir DNA synthesizer kullanın veya son miRNA sünger sıra ile kısıtlama nükleaz tanıma yer yerde klonlama için sentezlemek için piyasada bulunan bir kaynağı kullanır. Sünger bakterilerde bir amplifikasyon için seçilebilir işaretleri içeren bir plazmid sevk edilir. Ayrıca, sünger bir polimeraz zincir tepkimesi (PCR) tarafından klonlama için güçlendirilmiş olabilir veya sadece 1.3. adımda anlatılan kısıtlama sites'ı kullanarak bağış vektör bıraktı (Ayrıca, bkz: adım 3.1).

2. bir doku özgü organizatörü dahil etmek için alıcı vektör klonlama

Not: pEGFP-C1 vektör miRNA sünger ifade kaset için alıcı vektör olarak kullanın. PEGFP-C1 vektör sitomegalovirüs (CMV) düzenleyici tarafından yönlendirilen bir EGFP için bir okuma çerçevesi içerir. CMV organizatörü memeli hücrelerinde yapısal etkindir. Bir doku özgü organizatörü gerekiyorsa, CMV organizatörü (bkz. Adım 2.1) AseI ve NheI enzimler sindirimi tarafından kaldırılabilir. Plazmid geniş bir birden çok klonlama sitesi (MCS) yanı sıra sefaloridin (Kan) ve paromisin (G418) işaretleri bakteri seçimde ve memeli hücrelerinde istikrarlı bir ifade için sırasıyla içerir.

  1. CMV organizatörü pEGFP-C1--dan kaldırma
    1. 1 x kullanılan enzimleri üretimi tarafından önerilen piyasada bulunan Özet arabellek içeren sindirim tepki 50 μL, 5 μg plazmid DNA (su)'in ve AseI ve NheI enzimlerin her 5 μL olun. Tüm bileşenleri bir microcentrifuge tüp ve nazikçe onları flicking tarafından karıştırın. Tüpü 10 için spin tepki alt toplamak için bir microcentrifuge s. 15 dakika 37 ° C su banyosunda tepki kuluçkaya.
    2. Sindirilir Doğrusallaştırılmış plazmid arındırmak. 5 sütun bağlama arabellek (kullanılan DNA arıtma sütunları imalatı için uygun bağlama önbellek özel bir karışımı) tepki hacmi x ekleyin ve üretici tarafından açıklandığı gibi bir DNA arıtma sütun ile reaksiyonu arındırmak. 25 μL elüsyon arabelleği sütun ortasına doğru dikkatle eklendi (su) ile elute.
    3. Jel arındırmak sindirilir plazmid % 0.5 özel jel üzerinde aşağıdaki gibi: eluted plazmid tampon (% 50 gliserol-boya yükleme x 3) yükleme 5 μL ekleyin. Tüm örnek 1 su kuyusu üstünde % 0.5 özel jel içine yükleyin. Ayrı bir yol, 500 dahil kesilmemiş vektör ng. Çalıştırmak için 30-40 dk kadar kesilmiş ve işlenmemiş plazmid yeterli bir ayrılması sağlanır.
    4. Aşağıdaki gibi Doğrusallaştırılmış plazmid arındırmak: UV ışık kutusu üzerinde özel jel DNA'da görselleştirmek. Temiz bir tıraş bıçağı ile dikkatli bir şekilde Doğrusal plazmid karşılık gelen grup tüketim.
      Not: Doğrusal plazmid kesilmemiş plazmid düşük çalıştırmalısınız ve tek bir bant yaklaşık 4,2 KB olarak görünür. Eksize CMV organizatörü yaklaşık 500 nükleotit (nt), hafif bir grup olarak görünür.
    5. Piyasada bulunan bir seti kullanarak jel dilimden DNA ayıklamak ve su 25 μL sütunla DNA'dan elute.
  2. PEGFP-C1 bir kalp özgü organizatörü klonlama
    Not: Alfa-myosin ağır zincir (α-MHC) Organizatörü önceden karakterize ve sağlam düzeyleri kalp tarafından kısıtlanmış ifade aşağıdaki Molkentin, Jobe, Markham ve16içinde açıklandığı gibi yönlendirmek için gösterdi. Sonraki bölümlerde klonlama için vektör organizatörü yükseltmek nasıl açıklanmaktadır.
    1. Öğeleri + 420 p40 plazmid16 transkripsiyon başlangıç siteye göre-2934 için ilk tarafından arasında α-MHC organizatörü klon bu bölge ve ardından plazmid PCR için şablon olarak kanattan PCR astar tasarlama. PCR astar yukarıda açıklanan5kullanarak organizatörü bölgenin yükseltmek. İleriye ve geriye doğru PCR astar sıraları örtüşme sindirilir uçlarına pEGFP-Fusion-yönetmen klonlama izin vermek için C1'in (adım 2.1) içerir. Astar tasarım inç-Fusion klonlama için kapsamlı bir açıklama için inç-Fusion kullanım kılavuzuna bakın. Astar dizileri Tablo 1' de bulunur.
    2. Her astar ve 10 1 mikron içeren bir 50 μL PCR reaksiyon hazırlamak ng şablonunun DNA. PCR enzim ve dNTPs bağlı olarak seçilen PCR reaktif imalatı uygun bir miktarda ekleyin. PCR bir standart DNA Bisiklete binme blokta gerçekleştirin. 3 dk 98 ° C adım, denaturing, tavlama ve uzantısı 35 devredir 5, 30 ve 120 ardından denaturing gerçekleştirmek s her, anılan sıraya göre. 72 ° C'de 10 dakika son bir uzantısına ekle
    3. PCR ve jel çıkarma kadar temiz. PCR döngüsü tamamlandığında, üretici tarafından açıklandığı gibi bir DNA arıtma sütunla arındırmak ve PCR reaksiyon 5 sütun bağlama arabellek tepki hacmi x ekleyin. Karışımı 25 μL elüsyon arabelleği sütun ortasına doğru dikkatle eklendi (su) ile elute.
      1. Arabellek [% 50 gliserol (3 x) boya yükleme] için eluted plazmid yükleme 5 μL ekleyin. Tüm örnek 1 de ' % 1'özel jel içine yükleyin. 30-40 dk için koşmak; görselleştirmek ve PCR ürünü (yukarıdaki adım 2.1.5) açıklandığı gibi tüketim.
    4. α-MHC organizatörü pEGFP C1 ile aşağıdaki gibi ligate: 1 x piyasada bulunan tüp ligasyonu arabellek, saflaştırılmış PCR 2 μL ve Doğrusallaştırılmış vektör 1 μL içeren 10 μL ligasyonu tepki ekleyin. 50 ° c ligasyonu 15dk için gerçekleştirmek ve sonra buz üzerinde cool.
    5. Bakteriyel bir dönüşüm aşağıdaki gibi yapın: 2.5 μL Fusion tüp ligasyonu karışımı ile yetkili hücrelerinin 50 μL bileşenleri ekleyerek transfect. Eppendorf dinlenmek için 20 dk 42 ° C su banyosu 40 s ve sonra yere koydum, buzda buz 2 min için tüp tüp.
      1. Dönüşümün, SOC kitle 350 μL eklemek ve 45 dk. plaka 200 μL akıbet çözüm LB plakaları ile Kan. gerçekleştirmek için 37 ° C'de hücreler bir koloni α-MHC organizatörü ligasyonu içeren Kan dayanıklı hücreleri tanımlamak için PCR büyümek.
        Not: Tarama astar ligasyonu kavşak PCR için dizayn edilmiştir.
    6. PCR olumlu klonlar LB-Kan suyu ve üretici tarafından açıklandığı gibi standart mini hazırlık plazmid arıtma protokolleri kullanarak saf plazmid genişletin.

3. sünger klonlama

  1. Alıcı vektör sindirmek
    1. α-MHC-pEGFP plazmid doğrusal EcoRI ve KpnI ile klonlama için yapmak ve jel (yukarıdaki adım 2.1) açıklandığı gibi arındırmak.
  2. PCR yükseltmek ve sünger DNA sindirmek
    1. Vektörel çizimler PCR için şablon olarak nakliye miR-181-sünger ve karşılık gelen 284-nt-uzun kapış kullanın. Yukarıda açıklanan PCR astar5kullanarak sünger bölgenin yükseltmek. İleriye ve geriye doğru PCR astar ligasyonu α-MHC-pEGFP-C1 içine izin vermek için Restriksiyon enzimi sıraları içerir unutmayın. PCR (yukarıdaki adım 2.2.2) açıklandığı gibi gerçekleştirin. PCR ürünleri (adım 2.2.3) açıklanan ve sindirim için su ile eluted sindirim önce arındırmak. Astar dizileri için bkz: Tablo 1.
    2. Tüp ligasyonu için sünger DNA sindirmek. Bir 50 μL sindirim tepki 1 x Özet arabellek, adım 3.2.1 jel saf PCR reaksiyon ve 5 μL hem EcoRI hem de KpnI enzim içerir. Tüm bileşenleri bir microcentrifuge tüp ve nazikçe onları flicking tarafından karıştırın. Tüpü 10 için spin tepki alt toplamak için bir microcentrifuge s. 15 dakika 37 ° C su banyosunda tepki kuluçkaya.
    3. Daha önce açıklandığı gibi bir PCR temizlik sütun kullanarak sindirilir PCR sünger (adım 2.2.1) arındırmak.
  3. MiR-181-sünger α-MHC-pEGFP-C1 vektör ligate
    1. 1 x ligasyonu arabellek içeren bir 21 μL ligasyonu reaksiyonu, 3 μL sindirmek ve miR-181-sünger PCR, 1 μL Doğrusallaştırılmış α-MHC-pEGFP-C1 vektörünün, 1 x DNA arabellek ve DNA ligaz 1 μL saf. Ligasyonu oda sıcaklığında 5 min için gerçekleştirmek ve buza koyun.
    2. XL1-mavi yetkili hücreleri 50 μL ligasyonu Mix 2 μL ile dönüşümü. Dönüşümün ve protokolleri kaplama (yukarıdaki adım 2.2.5) açıklandığı gibi kullanın. Bir koloni PCR doğru α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge sırada içeren Kan dirençli bakteri tanımlamak için gerçekleştirin. Tarama astar PCR için ligasyonu Kavşağı tasarım. Astar dizileri bkz. Tablo 1 .
    3. Vektör sıra ve yükseltmek. PCR olumlu klonlar LB-Kan suyu ve standart mini hazırlık plazmid arıtma protokolleri kullanarak saf plazmid genişletin. İstenen DNA dizileri ifade plazmid doğrulamak için bir DNA sıralama gerçekleştirir.

4. nesil istikrarlı H9c2 miR-181-sünger ifade hücreleri

  1. Büyüme ve bakım H9c2 hücre
    1. Kültür H9c2 hücreleri içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (fetal Sığır serum (FBS) % 10 son bir konsantrasyon içeren DMEM). Standart protokolleri kullanarak hücreleri alt kültür ve onları % 5 karbon dioksit 37 ° C'de büyümek.
  2. Transfection ve H9c2 hücreleri ifade α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge seçimi
    1. Bir adım H9c2 hücrelerinin en iyi sonuç için gerçekleştirin. Scramble sünger (miR-181-sünger-sıra yerini alan 284-nt-uzun kapış dizisi) ya da bir electroporator sahip α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge yapı ile sıçan myoblasts (H9c2) transfect.
      1. Kısaca, 4 x 10-5 hücreleri 2 μg plazmid DNA (içinde 5 µL H2O) ile transfect ve Elektroporasyon aygıtla uyumlu bir çözeltinin 100 µL. H9c2 hücre transfect için DS-120 bir adım programını kullanın.
      2. Oda sıcaklığında 10 dakika için küvet transfected hücrelerde kuluçkaya. DMEM 500 µL doğrudan küvet için ekleyin. Yavaşça toplam küvet içeriği 6-şey plaka bir kuyu için aktarın.
    2. 48 saat sonrası transfection FACs tarafından sonra GFP olumlu hücrelerini seçer. Yalnızca GFP ifade hücreleri paromisin (G418) bir ek ile bir 6-şey plaka plaka (400ng/mL) tam büyüme basına.
      Not: G418 seçimi öncesinde bir kill eğrisi paromisin seçim için gerekli miktarını belirlemek için kurulmalıdır. H9c2 hücreler için 400 ng/mL G418 sonuçlanan bir plazmid sigara yaklaşık % 80'i ölüm oranı H9c2 hücreleri 24 saat sonra transfected ve G418 istenen çalışma konsantrasyonu bu hücreler için olarak kabul edildi. Büyüme G418 içinde 16 gün boyunca devam edildi sonra hücre istikrarlı olarak kabul edildi.
    3. Bir sünger pozitif seçim için bir işaretleyici olarak GFP ifade kullanarak G418 istikrarlı hücreleri FACs sıralanması gerçekleştirin. Her şey bir 96-şey plaka 5-10 hücrelere akışı sıralayarak tohum. 24-şey plakaları monoklonal hücrelere 96-şey plaka üzerinde çeşitli pasajlar genişletin. Kullanım dondurucu stokları hücre sonraki deneyler için başlangıç noktası olarak 3 (P3) hücreleri geçiş.
    4. P5 ve P10 arasında düşük geçiş hücreleri ile tüm hücre-satır-tabanlı deneyler yapmak.

5. sentez ve sünger-nano tanecikleri (miR-181-sünger nano tanecikleri) arıtma

  1. Liposomal nano tanecikleri katyonik Amfifil (DOTAP) ve Co lipidler, kolesterol ve DSPE-PEG-OMe, 5:5:0.1 mM oranı sırasıyla, kloroform ve metanol bir cam şişe içinde bir karışımı çözülerek hazırlayın.
  2. 44-45 ° c, organik çözücü nem-Alerjik azot nazik bir akış tarafından takip bir rotary evaporatör kullanarak bir vakum altında kaldırın. Lipid kalan Kuru film 8 h için yüksek vakum altında tutun.
  3. Vakum Kurutulmuş lipit filmin %5 glikoz ekleyerek bir karışım hazırlayın. Gecede film hidrat bu karışım izin verin bırakın. Girdap şişeyi bir ara sıra bir 45 ° C su banyosunda sallayarak ile multilamellar veziküller üretmek için oda sıcaklığında 2-3 dk için.
    1. Küçük unilamellar veziküller içinde bir buz banyosu hazırlamak için 3-4 kadar açıklık görülebilmektedir min, % 100 iş hacmi ve 25 W çıkıș gücü için multilamellar veziküller solüsyon içeren temizleyicide.
  4. Scramble sıra ya da pEGFP(α-MHC) vektörler ve lipozom 1:3 ücret oranı olarak nanovector4oluşturmak için içine klonlanmış bir miR-181-sünger sırası karıştırın.
    Not: Olumlu tahsil liposomal nano tanecikleri ve olumsuz ücret plazmid DNA elektrostatik bir kompleks bir nanovector bilinir.

6. sistemik teslimini sünger-nano tanecikleri ve in Vivo sonuç doğrulama

  1. Sünger-nano tanecikleri sıçanlarda sistemik teslim
    1. Sprague-Dawley (SD) fareler kullanın. Fareler intravenöz miR-181-sünger nanovector veya kapış nanovector kuyruk ven yoluyla enjekte et. Vücut ağırlığı yaklaşık 200 g olan SD erkek rats, kullanın.
    2. Nanovector/kg vücut ağırlığı 4 mg doz kullanarak kuyruk ven enjeksiyon gerçekleştirmek ve bu 2 hafta içinde 6 kuyruk ven enjeksiyonları rejimi kullanarak yineleyin. Tekrarlanan nanovector teslim bir 1 haftalık süre (gün 15-21) vektör içinde vivoifade için izin.
    3. Optimizasyon öncesinde, sırasında ve sonra nanovector teslim GFP sinyal Imaging onaylayın. GFP sinyal yarı nicel veri üreten tomografik görüntüleme yazılımı tarafından analiz.
  2. Vivo miR-181 inhibisyon miR-181-sünger tarafından doğrulanması
    1. Ifade işlev miR-181-sünger kalp dokusunda göstermek için Batı leke gerçekleştirin.
      Not: Bu çalışma için mt-COX1 ifade incelenmiştir.
  3. Vivo miR-181-sünger ifade kalbinde fonksiyonel sonuçları
    1. İki boyutlu, M-modu ve Doppler ekokardiyografi ile değerlendirilmesi sırasında ve kardiyak fonksiyon ve morfolojik değişiklikler çözümlemek için nanovector teslim sonra gerçekleştirin. İçin daha iyi tarama kapasitesi kemirgen kalplerinde bir 15 MHz doğrusal dizi çevirici ile donatılmış bir ultrason sistemi kullanın.
    2. Anestezi kardiyak contractility etkileyebilir; Bu nedenle, miR-181-sünger nanovector veya kapış nanovector ekokardiyografi işlemi sırasında bilinçli ve herhangi bir anestezik reaktif hayvanlar için teslim gerçekleştirin. Das, görebilir ve ark. daha fazla açıklama için 4 .

Sonuçlar

Stabil transfected pEGFP-miR-181-sünger-ifade H9c2 hücrelerinde (Kimden adım 4.2), tüm miR-181 ailesi (miR-181a, miR-181b, miR - 181c ve miR - 181d) ifade orta pEGFP-şifreli-ifade H9c2 hücreleri göre azalma. MiR-181-sünger hizmet veren tüm miR-181 Aile, rekabetçi bir inhibitörü olarak düşündüğümüz bu yüzden ifade miR - 181 c mitokondrial gen hedef, mt-COX1, artırmak. Western blot verileri mt-COX1 ifade pEGFP kapış ifade H9c2 hücrelere kıyasla pEGFP-miR-181-sünger...

Tartışmalar

Bu makalede açıklanan tasarım ve sentez miRNA-sünger ve nasıl sünger doku özgü ifade doku özgü miRNA aile ifade etkisizleştirmek için güçlü bir araçtır gösterdi.

Sünger hedefleme miR-181 aile bir ifade plazmid ile bir kalp özgü organizatörü klonlanmış göstermiştir. Plazmid verimli bir şekilde nanovector parçacık'dır içine paketlenmiş vitro ve in vivo (Şekil 1) Elektroporasyon veya kuyruk ven enjeksiyon sırasıyl...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Anthony K. L. Leung Bölümü Biyokimya ve moleküler biyoloji teşekkür ediyoruz, Bloomberg Halk Sağlığı Okulu, Johns Hopkins Üniversitesi onun teknik için miR-181-sünger yapı tasarlama konusunda yardım et. Biz de Polina Sysa-Şah ve Kathleen Gabrielson moleküler bölümü ve karşılaştırmalı Pathobiology, miRNA-sünger teslimat Johns Hopkins Tıp Kurumları yanında vivo içinde düşsel teknik yardım için teşekkür ederiz.

Bu eser NIH HL39752 (Charles Steenbergen için) gelen hibe ve Amerikan Kalp Derneği 14SDG18890049 bir bilim adamı kalkınma hibe (için tolga Das) tarafından desteklenmiştir. Sıçan kardiyo özgü organizatörü cömertçe Jeffery ö Molkentin Cincinnati çocuk hastanesinde tarafından sağlandı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
pEGFP-C1 vectorAddgene6084-1
In-fusionClontech121416
QIAprep MiniprepQiagen27104
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
miR-181-sponge synthesisIntrogen GeneArtcustome made
PCR primersIntegrated DNA Technologiescustome
EcoRI enzymesNew Endland BiolabsR0101S
KpnI enzymesNew Endland BiolabsR0142S
Rapid DNA Ligation KitSigma-Aldrich11635379001
H9c2 cellsATCCCRL-1446
DMEM MediaThermo Fisher Scientific11965092
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10082139
Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1)LonzaVCA-1005
G418, GeneticinThermo Fisher Scientific11811023
FACSAria II Flow cytometerBD Bioscience644832
Branson 450 sonifierMarshall ScientificEDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging deviceCaliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibodyAbcamab14705
α-tubulin antibodyAbcamab7291
Sequoia C256 ultrasound systemSiemens

Referanslar

  1. Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
  2. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
  3. Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
  4. Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
  5. Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
  6. Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
  7. Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
  8. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  9. Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
  10. Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
  11. Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
  12. Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
  13. Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
  14. Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  16. Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
  17. Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
  18. Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
  19. Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
  20. Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
  21. Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
  22. Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
  23. Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
  24. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  25. Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
  26. Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
  27. Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
  28. Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
  29. Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
  30. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
  31. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  32. Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
  33. Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
  34. Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
  35. Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
  36. Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
  37. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  38. Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
  39. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  40. Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyolojisay 136mikroRNAmiRNAmiRNA s ngermiRNA inhibisyonnanopartik lnanovectormiR 181kalpmitokondrial miRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır