JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Inibizione di tessuto-specifici microRNA è una tecnologia che è sottosviluppata nel campo dei microRNA. Qui, descriviamo un protocollo per inibire la famiglia di microRNA miR-181 in cellule dei mioblasti dal cuore. Nanovector tecnologia viene usata per fornire un microRNA spugna che dimostra significativa in vivo cardio-miR-181 famiglia inibizione specifica.

Abstract

MicroRNA (miRNA) è piccolo non-codificanti RNA che inibisce l'espressione post-trascrizionale RNA messaggero (mRNA). Malattie umane, come cancro e malattie cardiovascolari, sono stati indicati per attivare il tessuto e/o espressione di miRNA cellula-specifico associato a progressione della malattia. L'inibizione dell'espressione dei miRNA offre il potenziale per un intervento terapeutico. Tuttavia, gli approcci tradizionali per inibire Mirna, impiegando oligonucleotidi ipotesi, influisce sulle funzioni di miRNA specifici al momento della consegna globale. Qui, presentiamo un protocollo per l'inibizione in vivo cardio-specifico della famiglia miR-181 in un modello del ratto. Un costrutto di miRNA-spugna è progettato per includere 10 sequenze di associazione anti-miR-181 ripetuta. Il promotore di cardio specifiche α-MHC è clonato nel backbone del pEGFP per guidare l'espressione di miR-181 cardio specifici miRNA-spugna. Per creare una cella stabile linea esprimendo il miR-181-spugna, dei mioblasti H9c2 cellule è trasfettata con il costrutto α-MHC-EGFP-miR-181-sponge e filtrata per fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACs) in cellule H9c2 positive GFP che sono coltivate con neomicina (G418). A seguito di una crescita stabile a neomicina, popolazioni di cellule monoclonali vengono stabilite mediante ulteriori FACs e clonazione di singola cellula. Cellule risultanti dei mioblasti H9c2-miR-181-spugna-GFP presentano una perdita di funzione dei membri della famiglia miR-181 come valutato attraverso l'aumentata espressione di proteine bersaglio miR-181 e confrontato alle cellule H9c2 esprimendo una spugna non funzionali di scramble. Inoltre, sviluppiamo un nanovector per la consegna sistematica del costrutto miR-181-spugna complessandosi liposomiale nanoparticelle caricato positivamente e negativamente miR-181-spugna plasmidi. In vivo imaging di GFP rivela che coda vena le iniezioni multiple di un nanovector su un periodo di tre settimane sono in grado di promuovere un'espressione significativa della miR-181-spugna in modo specifico per cardio. Cosa importante, una perdita di funzione di miR-181 è osservata nel tessuto del cuore ma non nel rene o del fegato. La spugna di miRNA è un potente metodo per inibire l'espressione di miRNA specifici del tessuto. L'espressione di miRNA-spugna di guida da un promotore tessuto-specifica fornisce specificità per l'inibizione di miRNA, che possa essere limitata a una mirata organo o tessuto. Inoltre, combinando tecnologie nanovector e miRNA-spugna consente un'erogazione efficace e tessuto-specifici miRNA inibizione in vivo.

Introduzione

Negli ultimi due decenni, ci sono stati numerosi studi che hanno messo in evidenza il ruolo significativo dei miRNA nella malattia umana. Risultati da un grande corpo di letteratura dimostrano l'importanza innegabile dei miRNA nella fisiopatologia di malattie quali cancro1 e malattia cardiovascolare2,3,4,5. Ad esempio, miR-21 è aumentata in molti cancri, conseguente a un'aumentata proliferazione ciclo cellulare e6. Nelle infezioni di epatite C, miR-122 svolge un ruolo importante nella replicazione del virus7, ed è stato dimostrato che l'inibizione di miR-122 diminuisce il carico virale8. Nell'ipertrofia cardiaca, miR-212/132 è upregulated nel cuore ed è coinvolto nel fenotipo patologico9. L'evidente importanza del downregulation o inibizione funzionale di un miRNA sovraregolati suggerisce opportunità per sfruttare terapeuticamente la biologia di miRNA in quasi tutte le malattie.

I quattro membri della famiglia miR-181, miR-181 a/b/c/d, si trovano in tre luoghi genomic nel genoma umano. La regione intronic di un gene di host RNA non codificanti (MIR181A1-HG) codifica il cluster miR-181-a/b-1. La regione intronic del gene NR6A1 codifica il miR-181-a/b-2. Il cluster miR-181-c/d si trova in una trascrizione atipico sul cromosoma 19. Tutti i membri della famiglia di miR-181 condividono la stessa sequenza di "seme" e tutti i quattro membri della famiglia miR-181 potenzialmente possono regolare i medesimi obiettivi di mRNA.

Abbiamo3,4 e altri10 hanno sottolineato l'importanza di miR-181 membri della famiglia durante l'infarto di stadio finale. Abbiamo anche riconosciuto che un upregulation di miR - 181 quater si verifica in presenza di condizioni patologiche associate con un rischio aumentato di malattia cardiaca, quale il diabete di tipo II, obesità e invecchiamento3,4,5. È stato postulato che la sovraespressione di miR - 181c causa lo sforzo ossidativo che conduce a una disfunzione cardiaca4.

Parecchi gruppi hanno suggerito che esiste di miRNA in mitocondri11,12,13,14, ma siamo stati i primi a dimostrare che miR - 181 c è derivato dal genoma nucleare, elaborato, e successivamente spostato ai mitocondri in RISC3. Inoltre, abbiamo rilevato una bassa espressione di miR-181a e miR-181b nel compartimento mitocondriale del cuore5. D'importanza, abbiamo trovato che miR - 181c reprime l'espressione di mRNA di mt-COX1, dimostrando in tal modo che i miRNA partecipano alla regolazione del gene mitocondriale e alterano la funzione mitocondriale3,4.

Questo articolo discute la metodologia necessaria per progettare una miRNA-spugna per abbattere l'intera famiglia di miR-181 in cardiomiociti. Inoltre, abbiamo delineare un protocollo per l'applicazione in vivo della miR-181-spugna.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della Johns Hopkins University.

1. spugna Design

  1. MicroRNA associazione 3' UTR
    Nota: A miRNA funzioni attraverso specifiche interazioni accoppiamento base con siti parzialmente complementari nella regione 3' non tradotta (UTR) del suo mRNA bersaglio (per una rassegna completa, vedere Bartel)15.
    1. Progettare gli inibitori dell'espressione dei miRNA come oligonucleotidi contenenti significative complementarità alla sequenza di miRNA. Sequestrare un miRNA a un oligonucleotide complesso mediante appaiamento vasto di bloccare la funzione di miRNA.
  2. Progettazione di una spugna di miRNA
    1. Progettazione schierati tandemly sequenze miRNA parzialmente complementari per includere un rigonfiamento nella posizione normalmente spaccati di Argonaute 2. Il rigonfiamento è posizionato a nucleotidi 9-12 della sequenza miRNA maturo per prevenire qualsiasi RNA interferenza tipo fenditura e la degradazione della spugna.
    2. Se lo si desidera, è possibile progettare alla sequenza di destinazione esca da associare a tutti i membri della famiglia miR-181. Al momento di un esame e il confronto delle sequenze famiglia miRNA miR-181, trovare una sequenza comune sul lato 5' del rigonfiamento contenente 8 nucleotidi consecutivi, o trovare una sequenza comune a tutti i membri della famiglia miR-181 4 sul lato 3' del rigonfiamento di un ulteriore 8 nucleotidi consecutivi. Queste 2 sequenze rappresentano i siti di legame di metà sinistra e destra, rispettivamente.
      Nota: La sequenza di esca è una matrice di tandem delle sedi del legame di metà di destro e sinistro separati da un distanziatore GGA. Collegare insieme la sequenza 5'-fine e la sequenza di 3'-lato (descritto al punto 1.2.2) con un distanziatore GGA progettato per creare il rigonfiamento quando ricotto per un miRNA (come descritto al punto 1.2.1). Ripetere questo 1 sito di legame di miRNA 10 x nel costrutto finale miR-spugna.
  3. Altre considerazioni di spugna di miRNA
    Nota: Al fine di clonare la sequenza di spugna nel vettore di espressione destinatario, siti di riconoscimento nucleasi di restrizione devono essere inclusi a ciascuna estremità della sequenza. Un'analisi in silico digestione dovrebbe essere utilizzata per confermare la scissione non specifici della sequenza spugna dagli enzimi di restrizione selezionati e altri enzimi di restrizione utilizzati in applicazioni di clonazione a valle.
    1. Aggiungere un codone di arresto doppia (TAA TAA) all'estremità 5' del sintetico 3' UTR, tale che la sequenza di miR-181-spugna non è parte della sequenza codificante per una proteina fluorescente verde avanzata (EGFP).
  4. Sintesi della spugna del DNA per la clonazione
    1. Utilizzare un sintetizzatore di DNA o impiegare una fonte disponibile in commercio per sintetizzare la sequenza di spugna finale miRNA con siti di riconoscimento di nucleasi di restrizione in luogo per la clonazione. La spugna viene spedita su un plasmide che può contenere indicatori selezionabili per un'amplificazione nei batteri. Ulteriormente, la spugna può essere amplificata da una reazione a catena della polimerasi (PCR) per la clonazione o semplicemente caduta fuori il vettore di donatore utilizzando i siti di restrizione descritti al punto 1.3 (vedere anche punto 3.1).

2. clonazione il vettore destinatario per includere un promotore tessuto-specifici

Nota: Utilizzare il vettore pEGFP-C1 come il vettore destinatario per la cassetta di espressione della spugna miRNA. Il vettore pEGFP-C1 contiene una cornice di lettura per un EGFP guidato da un promotore del citomegalovirus (CMV). Il promotore di CMV è costitutivamente attivo in cellule di mammifero. Se un promotore tessuto-specifica è necessario, il promotore CMV può essere rimosso tramite digestione degli enzimi di AseI e NheI (Vedi punto 2.1). Il plasmide contiene un vasto polylinker (MCS), kanamicina (Kan) e marcatori di neomicina (G418) per una selezione in batteri e un'espressione stabile in cellule di mammifero, rispettivamente.

  1. Rimozione del promotore CMV da pEGFP-C1
    1. Fare 50 μL di reazione di digestione contenente tampone digest commercialmente disponibili suggerito dalla fabbricazione degli enzimi di restrizione usato 1x, 5 μg di plasmide DNA (in acqua) e 5 µ l di AseI e NheI enzimi. Aggiungere tutti i componenti di un tubo del microcentrifuge e mescolarle delicatamente da sfogliando. Girare il tubo per 10 s in una microcentrifuga per raccogliere la reazione nella parte inferiore. Incubare la reazione in bagnomaria a 37 ° C per 15 min.
    2. Purificare il plasmide linearizzato digerito. Aggiungere 5 x il volume di reazione di buffer di colonna obbligatorio (un mix di proprietà del buffer associazione adatta per la fabbricazione delle colonne di purificazione di DNA utilizzate) e purificare la reazione con una colonna di purificazione del DNA come descritto dal produttore. Eluire con 25 μL di tampone di eluizione (acqua) aggiunto attentamente al centro della colonna.
    3. Gel di purificare il plasmide digerito su gel di agarosio 0,5% come segue: aggiungere 5 μL di tampone di caricamento (50% glicerolo-3 x caricamento tintura) per il plasmide eluito. Caricare l'intero esempio in 1 bene su gel di agarosio di 0,5%. Includere una corsia separata con 500 ng di vettore uncut. Eseguirlo per 30-40 minuti fino ad ottenere un'adeguata separazione dei plasmidi di taglio e non tagliati.
    4. Purificare il plasmide linearizzato come segue: visualizzare il DNA in gel di agarosio su una scatola di luce UV. Con una lama di rasoio pulita, attentamente accise alla fascia corrispondente al plasmide lineare.
      Nota: Il plasmide lineare dovrebbe eseguire inferiore il plasmide non tagliato e verrà visualizzato come una singola banda a circa 4,2 kb. Il promotore CMV asportato apparirà come una banda di luce a circa 500 nucleotidi (nt).
    5. Estrarre il DNA dal gel slice usando un kit disponibile in commercio ed eluire il DNA dalla colonna con 25 µ l di acqua.
  2. Clonazione di un promotore di cuore-specifico in pEGFP-C1
    Nota: Il promotore di catene pesanti alfa-miosina (α-MHC) ha stato precedentemente caratterizzato e dimostrato per dirigere robusti livelli di espressione cardiaco-limitati come descritto nel seguente Molkentin, Jobe e Markham16. Le sezioni successive descrivono come amplificare il promotore del vettore per la clonazione.
    1. Clonare il promotore di α-MHC tra elementi + 420 a-2934 relativo al sito di inizio della trascrizione nel plasmide p4016 di prima progettazione degli iniettori PCR che fiancheggiano questa regione e quindi il plasmide come modello per la PCR. Amplificare la regione del promotore mediante PCR primer precedentemente descritti5. Forward e reverse primer PCR contengono sequenze di sovrapposizione fino agli estremi confini digeriti del pEGFP-C1 (punto 2.1) per consentire la clonazione diretto In Fusion. Consultare il manuale di In-fusione per un'esauriente spiegazione del disegno primer per clonazione In-Fusion. Sequenze dell'iniettore si trovano nella tabella 1.
    2. Preparare una reazione di PCR 50 μL, che contiene 1 μM di ogni primer e 10 ng di DNA campione. Aggiungere una quantità appropriata di enzima PCR e dNTP a seconda la fabbricazione dei reagenti PCR scelto. Eseguire PCR su un blocco di ciclismo del DNA standard. Eseguire un 3 min 98 ° C denaturazione passaggio, seguito da 35 cicli di denaturazione, ricottura ed estensione per 5, 30 e 120 s ciascuno, rispettivamente. Include un'estensione finale di 10 min a 72 ° C.
    3. Ripulire l'estrazione PCR e gel. Al completamento del ciclo di PCR, aggiungere 5 x il volume di reazione di buffer di associazione di colonna per la reazione di PCR e purificarla con una colonna di purificazione di DNA, come descritto dal produttore. Eluire la miscela con 25 μL di tampone di eluizione (acqua) aggiunto attentamente al centro della colonna.
      1. Aggiungere 5 µ l di tampone di caricamento [50% glicerolo (3x) tintura di caricamento] a eluiti plasmide. Caricare l'intero esempio in 1 bene su gel di agarosio 1%. Eseguirlo per 30-40 min; visualizzare e asportare il prodotto PCR come descritto in precedenza (punto 2.1.5).
    4. Legare il promotore di α-MHC con pEGFP-C1 come segue: aggiungere la reazione di legatura 10 μL contenente 1x buffer di legatura commercialmente disponibili, 2 μL di PCR purificato e 1 μL di vettore linearizzato. Eseguire la legatura a 50 ° C per 15 min e poi raffreddarlo sul ghiaccio.
    5. Eseguire una trasformazione batterica come segue: transfect 50 μL di cellule competenti con 2,5 µ l di miscela di legatura In Fusion aggiungendo i componenti. Riposare la Eppendorf tube sul ghiaccio per 20 min, metterlo a bagnomaria a 42 ° C per 40 s e quindi posizionare il tubo sul ghiaccio per 2 min.
      1. A seguito della trasformazione, aggiungere 350 μL di media SOC e far crescere cellule a 37 ° C per 45 min. piastra 200 μL di soluzione di escrescenza su piastre LB con Kan eseguire una PCR per identificare cellule resistenti Kan che contengono la legatura del promotore di α-MHC della Colonia.
        Nota: Gli iniettori di Screening sono stati progettati per PCR attraverso la giunzione di legatura.
    6. Espandere i cloni positivi di PCR in brodo LB-Kan e in plasmidi purificati mediante protocolli di purificazione del plasmide standard mini-prep come descritto dal produttore.

3. clonazione la spugna

  1. Digerire il vettore destinatario
    1. Rendere il plasmide pEGFP-MHC-α lineare per la clonazione con EcoRI e KpnI e purificare il gel come descritto in precedenza (punto 2.1).
  2. PCR amplificano e digerire la spugna del DNA
    1. Utilizzare la storyline di 284-nt-lungo miR-181-spugna e corrispondente vettori di spedizione come il modello per la PCR. Amplificare la regione di spugna utilizzando precedentemente descritti PCR primer5. Si noti che gli iniettori di PCR di forward e reverse contengono sequenze di enzima di restrizione per consentire legatura in α-MHC-pEGFP-C1. Eseguire PCR come descritto in precedenza (punto 2.2.2). Purificare i prodotti di PCR prima digestione descritti (punto 2.2.3) e li eluiti con acqua per la digestione. Per sequenze dell'iniettore, vedere nella tabella 1.
    2. Digerire la spugna del DNA per la legatura. Una reazione di digestione 50 μL contiene 1x buffer di digest, la reazione di PCR gel-purificato dal punto 3.2.1 e 5 μL di enzimi EcoRI sia KpnI. Aggiungere tutti i componenti di un tubo del microcentrifuge e mescolarle delicatamente da sfogliando. Girare il tubo per 10 s in una microcentrifuga per raccogliere la reazione nella parte inferiore. Incubare la reazione in bagnomaria a 37 ° C per 15 min.
    3. Purificare la spugna PCR digerita utilizzando una colonna di pulizia PCR come descritto in precedenza (punto 2.2.1).
  3. Legare la miR-181-spugna in vettore α-MHC-pEGFP-C1
    1. Impostare una reazione di legatura μL 21 che contiene 1 x legatura buffer, 3 μL di digerito e purificato PCR miR-181-spugna, 1 μL di vettore linearizzato α-MHC-pEGFP-C1, tampone DNA 1x e 1 μL di DNA ligasi. Eseguire la legatura a temperatura ambiente per 5 min e poi metterlo sul ghiaccio.
    2. Trasformare 50 μL di cellule competenti XL1-blu con 2 μL di miscela di legatura. Utilizzare la trasformazione e la placcatura protocolli come descritto in precedenza (punto 2.2.5). Eseguire una PCR per identificare batteri resistenti Kan che contengono la sequenza corretta di α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge della Colonia. Progettazione degli iniettori di PCR di screening attraverso la giunzione di legatura. Vedere la tabella 1 per sequenze dell'iniettore.
    3. Amplificare e il vettore di sequenza. Espandere i cloni positivi di PCR in brodo LB-Kan e in plasmidi purificati mediante protocolli di purificazione del plasmide standard mini-prep. Eseguire un sequenziamento del DNA per verificare il plasmide esprimente le sequenze di DNA desiderate.

4. generazione di cellule che esprimono miR-181-spugna di H9c2 stabile

  1. Crescita e il mantenimento delle cellule H9c2
    1. Cellule di cultura il H9c2 dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) contenente siero bovino fetale (FBS) ad una concentrazione finale di 10%. Sub-cultura le celle utilizzando protocolli standard e farle crescere a 37 ° C in 5% di anidride carbonica.
  2. Transfezione e selezione di α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge che esprimono le cellule H9c2
    1. Eseguire un elettroporazione delle cellule H9c2 per ottenere risultati ottimali. Transfect ratto mioblasti (H9c2) con una spugna di scramble (una sequenza di scramble 284-nt-lungo che sostituisce la miR-181-spugna-sequenza) o il costrutto α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge con un electroporator.
      1. Brevemente, transfect 4 x 10-5 cellule con 2 μg di DNA del plasmide (in 5 µ l di H2O) e 100 µ l di una soluzione compatibile con il dispositivo di elettroporazione. Utilizzare un programma di elettroporazione di DS-120 a transfect le cellule H9c2.
      2. Incubare le cellule transfettate in cuvetta per 10 min a temperatura ambiente. Aggiungere 500 µ l di DMEM direttamente la cuvetta. Trasferire delicatamente il contenuto di cuvetta totale in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
    2. Selezionare per cellule positive GFP dopo post-trasfezione 48 h di FACs. Piastra solo le cellule GFP-espressi in una piastra a 6 pozzetti con un'aggiunta di neomicina (G418) (400ng/mL) per i media di crescita completa.
      Nota: Prima della selezione di G418, una curva di uccidere dovrebbe essere stabilita per determinare la quantità di neomicina richiesto per la selezione. Per le cellule H9c2, 400 ng/mL di G418 ha provocato un tasso di mortalità di circa l'80% del non-plasmide transfected le cellule H9c2 dopo 24 h ed è stato considerato come la concentrazione di lavoro desiderata di G418 per queste cellule. La linea cellulare era considerata stabile dopo la crescita è stata mantenuta in G418 per 16 giorni.
    3. Eseguire l'ordinamento di FACs delle cellule stabili G418 usando l'espressione della GFP come indicatore per una selezione positiva di spugna. Semi di 5-10 cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti da flusso di ordinamento. Espandere le cellule monoclonali dalla piastra a 96 pozzetti a 24 pozzetti sopra diversi passaggi. Uso congelatore scorte delle cellule dal passaggio 3 (P3) cellule come punto di partenza per successivi esperimenti.
    4. Eseguire tutti gli esperimenti basati su linee cellulari con cellule di basso-passaggio tra P5 e P10.

5. sintesi e purificazione di spugna-nanoparticelle (miR-181-spugna nanoparticelle)

  1. Preparate le nanoparticelle liposomiale sciogliendo amphiphile cationici (DOTAP) e co-lipidi, colesterolo e DSPE-PEG-OMe, in un rapporto di mM 5:5:0.1, rispettivamente, in una miscela di cloroformio e metanolo in un flaconcino di vetro.
  2. Rimuovere il solvente organico a 44-45 ° C, sotto vuoto mediante un evaporatore rotante, seguito da un delicato flusso di azoto privo di umidità. Tenere il restante film secchi del lipido sotto alto vuoto per 8 h.
  3. Preparare una miscela con l'aggiunta di glucosio 5% per il film lipidico Essicato sottovuoto. Lasciare durante la notte per consentire questa miscela idratare il film. Vortice del flacone per 2 a 3 min a temperatura ambiente per produrre vescicole multilamellari con un'agitazione occasionale in bagnomaria a 45 ° C.
    1. Sonicare le vescicole multilamellari per preparare le vescicole unilamellari piccole in un bagno di ghiaccio per 3-4 minuti fino a quando la chiarezza può essere osservato, a un 100% duty cycle e 25 W di potenza di uscita.
  4. Mescolare una sequenza di scramble o una sequenza di miR-181-spugna clonati nel vettore pEGFP(α-MHC) e liposoma su una base di rapporto 1:3 carica per formare la nanovector4.
    Nota: Un complesso elettrostatico di nanoparticelle liposomiale caricati positivamente e negativamente DNA plasmidico è noto come un nanovector.

6. consegna sistemica di spugna-nanoparticelle e convalida degli effetti In Vivo

  1. Somministrazione sistemica di spugna-nanoparticelle in ratti
    1. Utilizzare ratti Sprague-Dawley (deviazione standard). Iniettare per via endovenosa i ratti con il miR-181-spugna nanovector o scramble nanovector attraverso la vena caudale. Utilizzare ratti maschii di SD, che sono circa 200 g di peso corporeo.
    2. Eseguire l'iniezione della vena della coda utilizzando una dose di 4 mg di nanovector/kg di peso corporeo e ripetere l'operazione usando un regime di 6 iniezioni di vena di coda oltre 2 settimane. A seguito della pronuncia di nanovector ripetuti, consentire un periodo di 1 settimana (giorni 15-21) per l'espressione del vettore in vivo.
    3. Confermare l'ottimizzazione da imaging il segnale GFP, prima, durante e dopo la consegna di nanovector. Analizzare il segnale GFP di software di imaging tomografico, che genera dati semi-quantitativa.
  2. Convalida di in vivo miR-181 inibizione da miR-181-spugna
    1. Eseguire macchia occidentale al fine di dimostrare l'espressione di miR-181-spugna funzionale nel tessuto del cuore.
      Nota: Per questo studio, espressione di mt-COX1 è stata esaminata.
  3. Conseguenze funzionali dell'espressione di miR-181-spugna in vivo nel cuore
    1. Eseguire un'ecocardiografia bidimensionale, M-mode e Doppler durante e dopo la consegna di nanovector per analizzare la funzione cardiaca ed i cambiamenti morfologici. Per una migliore scansione capacità nei cuori del roditore, utilizzare un sistema a ultrasuoni dotato di un trasduttore ad array lineare 15 MHz.
    2. L'anestesia può influenzare la contrattilità cardiaca; Pertanto, effettuare la consegna della nanovector miR-181-spugna o scramble nanovector agli animali che sono cosciente e senza qualsiasi reagente anestetico durante il processo di ecocardiografia. Si prega di consultare Das, et al. 4 per ulteriori chiarimenti.

Risultati

In stabile pEGFP-miR-181-spugna-esprimendo H9c2 cellule transfected (dalla fase 4.2), l'espressione di miR-181 tutta la famiglia (miR-181a, miR-181b, miR - 181c e miR - 181d) è stata diminuita moderatamente relativo pEGFP-uova strapazzate-esprimendo le cellule H9c2. MiR-181-spugna serve come un inibitore competitivo dell'intera famiglia miR-181, così abbiamo anticipato che l'espressione del miR - 181c mitocondriale target gene, mt-COX1, aumenterebbe. Macchia occidentale dati suggeriscon...

Discussione

In questo articolo descritta la progettazione e la sintesi di una miRNA-spugna e ha dimostrato come l'espressione tessuto-specifica della spugna è un potente strumento per inibire l'espressione famiglia tessuto-specifici miRNA.

Abbiamo dimostrato che una famiglia di miR-181 spugna di targeting può essere clonata in un plasmide di espressione con un promotore specifico. Il plasmide può essere confezionato in modo efficiente in una particella di nanovector per la consegna sia in vitro

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo Anthony K. L. Leung del dipartimento di biochimica e biologia molecolare, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University per la sua tecnica aiutare con la progettazione del costrutto di miR-181-spugna. Ringraziamo anche Polina Sysa-Shah e Kathleen Gabrielson del dipartimento di molecolare e comparativa Pathobiology, Johns Hopkins Medical istituzioni per la loro assistenza tecnica per l'imaging in vivo della consegna miRNA-spugna.

Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dal NIH, HL39752 (di Charles Steenbergen) e da una sovvenzione scienziato sviluppo l'American Heart Association 14SDG18890049 (a Samarjit Das). Il promotore di cardio-specifico del ratto è stato generosamente fornito da Jeffery D. Molkentin all'ospedale pediatrico di Cincinnati.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
pEGFP-C1 vectorAddgene6084-1
In-fusionClontech121416
QIAprep MiniprepQiagen27104
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
miR-181-sponge synthesisIntrogen GeneArtcustome made
PCR primersIntegrated DNA Technologiescustome
EcoRI enzymesNew Endland BiolabsR0101S
KpnI enzymesNew Endland BiolabsR0142S
Rapid DNA Ligation KitSigma-Aldrich11635379001
H9c2 cellsATCCCRL-1446
DMEM MediaThermo Fisher Scientific11965092
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10082139
Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1)LonzaVCA-1005
G418, GeneticinThermo Fisher Scientific11811023
FACSAria II Flow cytometerBD Bioscience644832
Branson 450 sonifierMarshall ScientificEDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging deviceCaliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibodyAbcamab14705
α-tubulin antibodyAbcamab7291
Sequoia C256 ultrasound systemSiemens

Riferimenti

  1. Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
  2. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
  3. Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
  4. Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
  5. Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
  6. Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
  7. Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
  8. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  9. Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
  10. Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
  11. Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
  12. Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
  13. Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
  14. Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  16. Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
  17. Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
  18. Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
  19. Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
  20. Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
  21. Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
  22. Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
  23. Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
  24. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  25. Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
  26. Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
  27. Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
  28. Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
  29. Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
  30. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
  31. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  32. Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
  33. Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
  34. Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
  35. Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
  36. Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
  37. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  38. Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
  39. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  40. Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Biologiaproblema 136MicroRNAmiRNAmiRNA spugnainibizione di miRNAnanoparticellenanovectormiR 181cuoremiRNA mitocondriale

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati