לטווח ארוך In Vivo מעקב של תאים דלקתיים הדינמיקה בתוך דרוזופילה הגלמים

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הדמיה לחיות הפצע ותיקון ההיענות דלקתיות המשויך ברזולוציה גבוהה-עתיים ויוו. שיטה זו משתמשת השלב הגולמי של פיתוח דרוזופילה כדי לאפשר לטווח ארוך הדמיה ומעקב של אוכלוסיות תאים מסוים לאורך זמן והוא תואם עם איון יעיל מציאה RNAi בתיווך גנים.

Abstract

במהלך לתגובה דלקתית מהירה כדי נזק לרקמות, תאים של מערכת החיסון המולדת מגויסים במהירות כדי פגיעה באתר. פעם לפצע, תאים חיסוניים מולדת לבצע מספר רב של פונקציות חיוניות, כמו להילחם זיהום, ניקוי פסולת נמק ועירור מטריקס התצהיר. כדי להבין באופן מלא את מגוון אירועים איתות המסדירים את התגובה החיסונית, חשוב לבחון את התנהגויות מורכבות של (ואת האינטראקציות המתרחשות בין) מרובות תא שושלות ויוו, ואת בזמן אמת, עם הערך הגבוה רזולוציה-עתיים. את המוגבהת אופטי, את ללקוחות שלנו גנטי של עוברי דרוזופילה הקמנו דרוזופילה כמודל שלא יסולא בפז על תמונת-לחיות, לנתח את ההיבטים הבסיסיים של תאים דלקתיים התנהגות, כולל מנגנוני פיזור התפתחותית, סיווג של גופות מוות ו/או חיידקים פתוגנים, גיוס לפצעים. עם זאת, עבודה עדכנית עכשיו הוכיחה כי העסקת שלב יותר מאוחר יותר במחזור דרוזופילה – הגולם דרוזופילה – מציע מספר יתרונות ברורים, לרבות יעילות RNAi משופרת, יותר הדמיה תקופות, ו באופן משמעותי תא החיסון במספרים גדולים. כאן נתאר פרוטוקול לתיקון הפצע הדמיה ואת התגובה דלקתיות המשויך ברזולוציה גבוהה-עתיים ב הגלמים דרוזופילה בשידור חי. כדי לבצע את הדינמיקה של epithelialization מחדש ודלקת, אנו משתמשים מספר של מסוים ויוו פלורסנט סמנים עבור אפיתל והן תאים חיסוניים מולדת. אנחנו גם להוכיח את היעילות של fluorophores צילום-להמרה, כגון קאךה, אחרי תת-קבוצות תאים חיסוניים מסוים, כדי לעקוב אחר אופן הפעולה שלהם הם נודדים, נחישות מהאתר, פציעה.

Introduction

לתגובה דלקתית יעילה הוא מרכזי עבור כל האורגניזם להילחם בזיהום, לנקות פסולת שננהל את התיקון של רקמות פצועים¹. אמנם תגובה זו התוצאה הבלתי נמנעת של רוב נזק לרקמות, דלקת דורש רגולציה קפדנית כי נמצא קשור לתגובה דלקתית לא הולם למגוון רחב של מחלות אנושיות שונות (כולל כרונית ללא ריפוי פצעים, הצטלקות יתר, נטייה לסרטן)^1,2,3. נתון זה הרלוונטיות הקלינית, זה הכרחי כדי להשיג הבנה מפורטת יותר של המנגנונים המולקולריים הסלולר נהיגה את התגובה דלקתית כדי לפתח אינדיקטורים prognostic חדשה ואסטרטגיות לטיפול מגוון כרונית דלקתית תנאים, אשר עשויים להגן על רקמות תיקון מפני דלקת ממושכת ומיותר.

בשנים האחרונות הפך דרוזופילה מערכת מודל ומבוססת ובעל ערך לנתח תכונות יסוד של תגובת דלקתית והתפאורה מפני חרקים האנושי^4,5. בזמן הנוכחי, דרוזופילה מציע ללקוחות שלנו גנטי גדול בהרבה ממה שאפשרי כיום במודלים ניסויים אחרים (כגון עכברים או דג זברה), המתיר מדויק מניפולציה גנטית-עתיים ויוו (כדי להשבית או יתר אקספרס לכל הגן עניין בתוך סוגי תאים ספציפיים בנקודה מוגדרת התפתחותית זמן-) ואת הקלות של הגנום כולו מסכי^6,7. באופן מסורתי, רוב המחקרים הדמיה חיה של ריפוי הפצע, דלקת דרוזופילה בוצעו בשלבים עובריים, העוברים הם משותק (בניגוד דרוזופילה הזחלים או מבוגרים), שקוף אופטית המאפשרת ברזולוציה גבוהה ללא תחרות ויוו הדמיה⁸. זה איפשר לחוקרים להמחיש את גיוס מהיר וחזק דרוזופילה תאים חיסוניים מולדת (hemocytes) לאתר הפצע בתגובה לפגיעה מכנית או לייזר המושרה האפיתל מתחלקים^{9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14}. על ידי שילוב של מחקרים אלו הדמיה לחיות עם מניפולציה גנטית, לימודי עוברי דרוזופילה חשף הרבה חלבונים תא החיסון חשוב לשלוט תאים דלקתיים התנהגות בתוך vivo. לדוגמה, זוהתה homolog סיד-1 דרייפר (ITAM מחשבים המכילים חלבון) כמו חשוב "לפגוע קולטן' זה שמתווכת תאים חיסוניים דרוזופילה גיוס₂O H₂-תלוי באופן לאתרים של נזק¹⁵. רמות דרייפר בתוך תאים חיסוניים בתורו מווסתות על ידי סידן-induced JNK איתות גבוהות במורד הזרם של מוות גופה ספיגת¹². Hemocyte תנועתיות נוסף דורש שינויים cytoskeletal מורכבים לתאם את ההעברה מכוונת כלפי הפצע וזה תלוי פעילות הרגולטורים cytoskeletal כגון ה bundling אקטין חלבון תמונה מרתקת-¹⁶ ומשפחת רו קטן GTPases Rac, רו⁹.

דרוזופילה הוא חרק holometabolous זה עובר שלבים זחל, הגולמי נוספים בעקבות מופרה, לפני שהגיע לבגרות¹⁷. הגולם דרוזופילה פותחה כמודל נוספים עבור פולשני לחיות-הדמיה של מגוון רחב של אירועים הסלולר דינמיים, כולל תא התפתחותי העברה¹⁸, חלוקת התא¹⁹, התא צמיחה²⁰שריר התכווצות²¹. לאחרונה, זה כבר נקבעה כמודל רומן שבו ללמוד את הדינמיקה של הפצע תיקון ודלקת ויוו^22,23.

בדיוק כמו העובריים, דרוזופילה הגלמים הם משותק שטיחות שקוף, לאחר ניתוח זהיר מ שלהם מקרים הגולמי אטום¹⁸. על ידי ניצול זה שקיפות אופטית, אחד יכול לעקוב אחר ההתנהגות ויוו של תאים חיסוניים מולדת (hemocytes) בתגובה הנזק רקמות בתוך רקמות הגולמי דרוזופילה , כגון כנף הגולמי²². האגף הגולמי קיים מבנה bilayered פשוטים, המורכב שני גיליונות אפיתל שטוח גדול המחוברים ברחבי הפריפריה כנף; חוץ-תאית הרווח בין שתי שכבות אלה אפיתל מתמלא hemolymph (דם חרקים), מספר גדול של תאי hemocytes²⁴. בדיוק כמו עוברי, פגיעה מכנית או לייזר המושרה האפיתל האגף מפעיל גיוס מהירה של hemocytes האתר של פציעה²³. עם זאת, בשלב זה הגולמי מציע כמה יתרונות חשובים עבור הדמיה מעל קודם העובריים. הגלמים פצוע יכול לדימות במשך זמן רב ובתקופות זמן (לפחות 5 שעות), אזור הרקמה יותר זמין עבור ההפרעות ניסיוני (כגון דור של פציעות מרובות), ישנם מספרים גדול משמעותית של hemocytes נוכח (בשלב הזה מתן מסלולים תא יותר ממרחק נוסף עבור עוצמה סטטיסטית משופרת במהלך הניתוח המתמטית). יתר על כן, היעילות של איון מציאה RNAi בתיווך גנים באופן ניכר שיפור בשלבים הגולמי, ומאפשר גנים רבים להיות 'הפיל למטה' טישו או באופן ספציפי זמן לעומת הגישה כל המוטציות מסורתיות יותר של העוברים.

על מנת לבצע את הדינמיקה של הפצע מחדש epithelialization ואת התגובה דלקתי המלווה בתוך המודל הגולמי החדש, יש ליצור שתי אוכלוסיות תאים שונים: האפיתל הגולמי של תאים חיסוניים מולדת (דרוזופילה hemocytes). מספר סמנים שונים (טבלה של חומרים) זמינים עבור תווית אלה שתי האוכלוסיות תאים שונים - הבחירה של סמן תלוי תהליך מסוים שילמדו. כדי לסמן את אפיתל הגולמי, קווים דרוזופילה המכיל גם ubiquitously ביטוי מתויג GFP E-קדהרין (שמתייג צמתי adherens) מנוצלים באופן שגרתי כדי לציין את העמדות של השוליים בתא, או לחלופין, על ה-GFP מתויג תחום אקטין-איגוד של Moesin (שמתייג את שלד התא אקטין) כדי להמחיש את הפצע-קצה אקטין כויץ הטבעת של מתקדמים בליטות. כדי לתייג את דרוזופילה hemocytes, hemocyte ספציפיים קמעונאי-Gal4²⁵ לביטוי נסיעה של RFP גרעינית (לצורך מעקב הגרעין), cytoplasmic GFP או מתויג GFP Moesin (כדי לתייג את שלד התא את הציטופלסמה או אקטין, בהתאמה). photoconvertible fluorophore (כגון קאךה) משמשים. למעשה, לעתים קרובות כדאי להשתמש מספר סמני תא החיסון בשילוב, כדי לאפשר ניתוח בו זמנית של תנועת גרעיני ושל המורפולוגיה תא (ראה תוצאות נציג). עם זאת, מכיוון פרוטוקול זה כרוך השימוש דרוזופילה הגלמים, רק שילובים של סמנים גנטיים כי הם קיימא עד אמצע-הגולמי שלבים יכול להיות מנוצל. כמו כן, עובריים מניות קטלני לא יהיה מתאים. . זה לא צפוי להיות בעיה כאשר הדמיה שליטה (או פראי-סוג) גלמי אבל חשוב לקחת בחשבון בעת גנים הם לנוק או overexpressed, כדי להעריך את ההשפעה שלהם על סגירת הפצע או דלקת. במקרה של lethality מוקדם נגרמת על ידי ג'ין נוקאאוט (או ביטוי) Gal80^ts הבונה יכול לשמש כדי לעודד את נוקאאוט מונחה Gal4 בהמשך פיתוח (ראה דיון).

במחקרים האחרונים שלנו, נעה לתוך השלב הגולמי איפשר לנו לאסוף מספיק נתונים מסלול תא החיסון כדי לנתח את התנהגות דלקתיות באמצעות מודלים מתמטיים מתוחכם, אשר בתורו אפשרה לנו להסיק פרטי הרומן של הפצע attractant דלקתיות אותות²³. לדוגמה, גישה זו חשף כי chemoattractant הפצע מתפשט באיטיות דרך הרקמה מודלק ב 200 μm²/min, קצב איטי מאשר קודם לכן הציע מולקולות קטנות המועמד כגון ATP או H₂O₂ מדווחים טשטוש^26,27,28,29; מולקולות קטנות "נזק" אלה נוטים במקום לשמש אותות מתירניות. יתר על כן, על-ידי ביצוע הפעולה ארוכת טווח של תאים חיסוניים מולדת כפי שהם לפתור מן פצע ראשוני נחשפים שנייה (עשוי ב timepoints שונים לאחר הראשונה), שחשפנו תקופה זמנית 'הקהיה' במהלך אילו תאים חיסוניים עיוורים פציעות עוקבות²³. על ידי ניצול הפוטנציאל הדמיה לטווח ארוך של המודל הגולמי, יחד עם דרוזופילה גנטי ללקוחות שלנו, אחד לא יכול לנהוג את אופן הפעולה של אוכלוסיות תאים חיסוניים מסוים (כגון רק אלה תאים חיסוניים גייס לאתר הפצע) ב תגובה עלבונות עוקבות, באמצעות fluorophore photoconvertible³⁰ אשר יכול לבוא לידי ביטוי אך ורק בתוך שושלת היוחסין תא החיסון²³.

כאן נתאר פרוטוקול להמחיש את הדינמיקה של הפצע ותיקון את התגובה דלקתית המשויך ברזולוציה-עתיים גבוהה באמצעות מגורים הגלמים דרוזופילה . אנו מספקים מתודולוגיה מפורט כדי לכסות את השלבים הנחוצים לביצוע ההכנה הראשונית גלמי (דיסקציה, הרכבה) עוקבות בתיווך לייזר ובפציעתם ואת ההדמיה זמן לשגות. אנו מתארים גם את השימוש צילום-להמרה fluorophores להתיר תיוג של תאים חיסוניים מסוים קבוצות משנה ויוו. לטווח הארוך, נוכל לדמות כי המודל הגולמי דרוזופילה החדש יפתח אפשרויות מרגשות ניקוד הדינמיקות איתות מורכבים שבבסיס התגובה דלקתיים ברקמות. על-ידי החלת ניתוחים סטטיסטיים מתוחכמים יותר אחד עשויות לחשוף את התכונות של תגובת שאמורים להיות נגיש ניסיוניים, בעוד יעילות משופרת RNAi יכול להלוות עצמה ליישום של הגנום כולו ההקרנה בתוך תאים חיסוניים ויוו לזהות שחקנים הרומן ויסות התנהגות תא החיסון.

Protocol

פרוטוקול זה כולל ארבעה שלבים רציפים הראשי: (1) הכנת דרוזופילה מניות ו הזמני של דרוזופילה הגלמים, דיסקציה הגולמי (2), הרכבה, ופצעו הגולמי (3), (4) אין ויוו זמן לשגות קונאפוקלית הדמיה.

1. הכנת דרוזופילה מניות ואגרות הזמני של הגלמים

1. להשיג את המניות דרוזופילה המתאים (ראה מבוא ו לטבלה של חומרים).
2. לאסוף את הזבוב הבוגר בריא צעיר של גנוטיפ המתאים.
   1. בחר מבוגר זבובים באמצעות רפידות גז פחמן דו-חמצני כדי בקצרה עזים ומתנגד הזבובים, במכחול בסדר להעביר טיסות של גנוטיפ המתאים או מגדר בקבוקון אוסף.
   2. להוסיף 20 בתול נקבות וזכרים 20 כל בקבוקון המכיל אוכל לטוס סטנדרטיים מדיה (תערובת קמח תירס-מולסה-אגר, ראה טבלה של חומרים) בתוספת שמרים.
3. לדור הגולמי אופטימלית, עצה הזבובים הבוגרים בכל יום על גבי אוכל חדש ב הבקבוקונים טריים, שמירה על כל הבקבוקונים ב 25 º C.
   הערה: אם נעשה שימוש במערכת Gal4-UAS³¹ לנהוג ביטוי גנים ספציפיים שושלת היוחסין, כל הצעדים צריכה להתבצע 25 ° c או מעל, כמו מערכת Gal4-UAS הוא רגיש לטמפרטורה.
4. 18 h לפני הדיון הדמיה מתוזמנת, בחר לפחות 10 שהוקם לבן קדם גלמי (איור 1 א') הבקבוקונים (כלומר 0 h לאחר היווצרות puparium, APF) באמצעות מלקחיים או במכחול בסדר מכך גלמים ממשטח המבחנה פנים ו העברת הגלמים בקפידה לצד של בקבוקון פלסטיק ריק ונקי.
   הערה: נודד 3^rd לחלל הזחלים לזחול כלפי מעלה מהדרך אוכל לעבור להתגלמות; prepupae לבן שהוקם מזוהים בקלות כמו שהם מחזיקים everted spiracles הקדמי הם נייחים (בניגוד הזחלים 3^rd לחלל). הקוטיקולה הופכת 'puparium' (המקרה הגולמי) אשר בתחילה רכים ולבנים¹⁷. יש לנקוט כדי למנוע נזק הגלמים, כמו זה יכול להוביל לא רק כדי לא רצויים הנוצרות על-ידי פגיעה דלקתית תשובה, אלא גם על עיכוב התפתחותי משמעותי.
5. גיל הגלמים הנבחרת לשלב ההתפתחותי המתאים (18 h APF ייתן תוצאות אופטימליות) בבקבוקון ב 25 º C.
   הערה: כאשר הגלמים מתפתחים, המקרה הגולמי יהפכו בהדרגתיות לחשוכים ופריך יותר.
6. היכונו אחרים השלב הבא מבעוד מועד. כדי להפוך את heptane ב דבק, לשלב באורך 20 ס מ של סרט דו צדדי מגולגל למעלה עם heptane ב 20 מ בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל, חותם עם הסרט פרפין, רוק בטמפרטורת החדר למשך הלילה על הספסל.

2. ניתוח דרוזופילה הגלמים והכנה

1. להעביר את הגלמים דרוזופילה בשלבים נייר-דבק דביק דו-צדדי רכוב על משטח זכוכית. מקם את הגלמים כך הצד הבטני דבוק על הסרט ועל הצד הגבי פונה כלפי מעלה (איור 1B).
   הערה: החלק הפנימי. של הגולם תהיה לזיהוי מ שני spiracles בולטות מהקצה הקדמי של המארז הגולמי.
2. הסר בזהירות את הגלמים מ שלהם מעטפת מגן puparium תחת מיקרוסקופ דיסקציה brightfield באמצעות מלקחיים ומספריים מיקרו (איור 1B-D).
   1. בתחילה, לעשות חתך באזור הקדמי ביותר puparium עם המלקחיים (איור 1B). ודא כי המקרה הגולמי באזור זה הוא חלול ונטול רקמות הגולמי כי הגלמים התכווצו בתוך התיק במהלך התפתחות מוקדמת הגולמי.
   2. אחרי החתך הראשוני, בזהירות לקרוע או לפתוח את התיק הגולמי בקדמי אחורי כיוון בעזרת מלקחיים או microscissors (איור 1C) עד הגולם היא חופשית לחלוטין של חום מעטפת אטומה שביר (איור 1D).
      הערה: גלמי בשלב זה הם מאוד שבירים ו יש לנקוט כדי להימנע ניקב פני הגולמי; ניקב ברור כפי hemolymph במהירות ידלוף החוצה מן החדירה. הגלמים עם דקירות, קטן ככל שיהיה, צריך להיות מושלך.
3. הר הגלמים בצלחת עם תחתית זכוכית באמצעות דבק heptane.
   1. השתמש טיפ פיפטה 20 מ"ל כדי למקם טיפת דבק מוכן מראש heptane ב (ראו סעיף 1.6 לעיל) 10 מ ל קו על המנה עם תחתית זכוכית.
   2. לאפשר הדבק לייבוש על 5 s לפני העברת הגלמים גזור בקפידה על גבי הדבק heptane ב באמצעות מלקחיים (איור 1E).
   3. על מנת להקל על ופצעו והדמיה, בשורה הגלמים ברציפות; כ 5 הגלמים הם הציעו אבל יותר יהיה לניהול עם ניסיון.
      הערה: שימוש בדבק heptane ב זו מומלצת לשימוש בעת שימוש במערכות הדמיה זקוף אך אין צורך בעת באמצעות מערכת הפוכה. אם הדבק יוצר אופטי שיבושים במהלך הגלמים הדמיה, ניתן להניח ישירות על coverglass במקום – הדבקה טבעית בין רקמות הגולמי זכוכית יהיה מספיק ברוב המקרים עבור הדמיה יציבה, כל עוד הטיפול נלקח בעת העברת ההדמיה מגישים בין מיקרוסקופים.
4. לקבלת תוצאות מיטביות, הר הגלמים כך האגף הוא שטוח על coverglass עם רוב השטח כנף במגע ישיר עם coverglass (איור 1F). לגלגל את הגלמים באמצעות מלקחיים כדי לשנות את המיקום שלהם על מנת להבטיח שהכנף, מותקן כראוי.
5. כדי למנוע התייבשות מדגם במהלך תקופת הדמיה, הוסף פיסת נייר סינון סופג ספוג במים מזוקקים לצד המנה תת בסוף הרכבה, נזהר שלא להפריע הגלמים (איור 1E). מכסים את הכלי עם מכסה.
   הערה: הגלמים הם עכשיו מוכן ופצעו והדמיה.

3. לייזר המושרה ופצעו כנפיים הגולמי דרוזופילה

1. להעביר את המנה עם תחתית זכוכית המכיל את הגלמים הנטען כדי מיקרוסקופ שדה רחב מצויד עם מערכת אבלציה לייזר tunable.
   1. השתמש לייזר פעמו-UV אוויר מקורר חנקן-שאוב אבלציה למכוניתך 435 nm-ראה טבלה של חומרים עבור פרטים¹¹; אורך הגל מדויק של האור בשימוש לתאורת נבחרה על-ידי המשתמש באמצעות תא צבע המתאים.
2. שימוש brightfield אופטיקה, התאם את בקרי הבמה מיקרוסקופ כדי לאתר האגף הגולמי של הגולם הראשון להיות פצועים (איור 1F).
3. לקבלת תוצאות מיטביות, לשימוש של העדשה המטרה של טבילה 40 X או 63 X שמן בשני ההדמיה, לייזר אבלציה; ודא טבילה הנוזל בשימוש (שמן או גליצרול) עקבי בין אבלציה מערכות הדמיה. להתאים את המיקרוסקופ להתמקד על המטוס של האפיתל כנף הגולמי הקרוב ביותר coverslip זכוכית (קרי פוקוס על האזור של האפיתל כדי להיות פצועים) באמצעות את כפתור בקרת להתמקד בסדר גמור.
4. באמצעות התאמות הבמה מיקרוסקופ, מקם את האגף הגולמי כך האזור כדי להיות פצועים מיושר ישירות עם אזור המטרה ידועה אבלציה לייזר.
5. להשתמש שקופית מחליש צפיפות האנרגיה אל המיקרוסקופ להתאים ידנית על רמת צריכת החשמל של האור אבלציה.
   הערה: המחוון מחליש כולל תחנות לחץ ופסקי דין כדי לזהות את הרמה היחסית של הנחתה ולהתיר את השימוש בהגדרות לשחזור.
6. משתמש בפקד ידנית חיצוני המפעיל , להפעיל את הלייזר אבלציה באמצעות בלחיצה קצרה של הגורם המפעיל כדי להפוך פצע. בדוק המראה של בועת האוויר ארעי באתר אבלציה מאחר ופצע בדרך כלל ילווה אותו. בדוק אם ובפציעתם לייזר המושרה הוכתרה בהצלחה באמצעות את המסננים המתאימים פלורסנט להמחיש האפיתל הגולמי.
   הערה: לטפל כדי למנוע חשיפה מקרית קרני לייזר ההשתקפויות קרן יכול לגרום עין חמורה או העור נזק.
7. אם ופצעו אינה מצליחה, משתנים המטוס מוקד (להעביר את המוקד מיקרוסקופ מעט מעל או מתחת לרמת מוקד הנוכחי) וחזור בלחיצה אחת על ההדק אבלציה. לחלופין, להגדיל בהדרגה את עוצמת הלייזר באמצעות השקופית מחליש עד גודל הפצע הרצויה מושגת.
8. כדי להשתנות אבלציה לייזר חזרה הדופק, השתמש את כפתור חזרה שער בלוח הבקרה אחורי (אשר משתנה הקצב הדופק לשנייה פחות מ- 1 עד 60 הרץ). ופצעו אופטימלית, להגדיר את קצב החזרה של הדופק עד 40 הרץ.
9. כדי ליצור פצעים בגדלים שונים, להשתמש השקופית מחליש צפיפות אנרגיה כדי להתאים ידנית על רמת צריכת החשמל של האור אבלציה.
10. להימנע ופצעו את כל הנטען הגלמים ולהשתמש הגלמים האלה שאינם ablated כפקדי unwounded.
11. עבור תוצאות עקביות, באופן קבוע ליישר מחדש את מערכת אבלציה (באמצעות מדריכי הפעלה הרלוונטיים). כמו כן, לנקות, ממלאים את התא מהוד צבע ששולט הגל פלט לייזר.

4. in Vivo זמן לשגות קונאפוקלית הדמיה

1. במהירות להעביר את המנה עם תחתית זכוכית מיקרוסקופ המתאים עבור הדמיה בצילום מואץ.
   הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש קונאפוקלית מפרט גבוה או מיקרוסקופ דיסק ספינינג המצויד גלאי רגיש שיכול לזהות GFP והן mCherry fluorophores.
2. כדי דמות בכל האגף הגולמי, השתמש בעדשה המטרה הגדלה נמוכה (למשל 20 X) (איור 2 א). סדר התגובה דלקתי המלווה עם רזולוציה מרחבית גבוהה ותיקון תמונות פצע, להשתמש טבילת שמן 40 X (NA 1.3) או 63 X (NA 1.4) המטרה עדשות (ראה תמונות נציג ב איור 2B-D).
3. פתח את התוכנה לכידת התמונה המשויך המיקרוסקופ.
4. באמצעות התוכנה לכידת התמונה, הפעל את לייזרים המתאים למשל 488 ננומטר ואת לייזרים nm 561 להמחיש GFP, mCherry fluorophores, בהתאמה (על-ידי לחיצה על התיבות הרלוונטיות), להתאים את עוצמת הלייזר, רווח/אופסט הגדרות לתת מספקת אות ניאון תוך הימנעות פיקסל רוויה; להשתמש את עוצמת הלייזר אפשרי הנמוך (טווח של 5-20%) כדי למזער את photobleaching ואת phototoxicity.
5. כדי ללכוד שתי תיקון את אפיתל והגיוס תאים דלקתיים, להגדיר המיקרוסקופ להקליט z-מחסנית באמצעות ידיות התאמת את המוקד בסדר בלוח הבקרה; לקבלת תוצאות מיטביות, להגדיר את התוכנה (באמצעות לחיצות כפתור ידני) z-פרוסות הרשומה באמצעות האגף הגולמי (מינימום כל 3 מ מ), מהחלק העליון של האפיתל פצועים דרך למרחב חוץ-תאית מתחת (מכיל hemocytes נודדים) כדי להשיג גדול z-מחסנית (בטווח של 50-100 מ מ).
6. עבור הדמיה בצילום מואץ, להקליט את z-במחסן במרווחי זמן קבועים (מינימום 30 כל s) לפחות 1 h שלאחר ופצעו.
   הערה: מרווח הזמן המדויק בין z-ערימות נבחר מייצג פשרה בין ללכוד את הדינמיקה התא המשתנים והימנעות הלבנת לצילום של הדגימות.
7. לשיקוף בו זמנית מרובים גלמי (כולל שאינם ablated פקדים unwounded), להשתמש במה ממונע (מצורף המיקרוסקופ) התכונה רב בעמדה רכישה זמינה בתוך התוכנה הדמיה. להגדיר באופן ידני את המיקום של כל גולם בודדים בתוך התוכנה באמצעות ידיות שליטה על הבמה עמדה ולאחר מכן הגדר ידנית את מגבלות z המתאים-מחסנית (העליון והתחתון) עבור כל גולם בודדים.
8. דמיינו הדימויים בצילום מואץ במהלך לכידת התמונה או מאוחר יותר עם מומחה התמונה ניתוח תוכנה (כגון ImageJ³²) באמצעות הקרנות z-מחסנית או עיבוד תלת-ממדי. לדוגמה, כדי לעקוב אחר תנועות hemocytes בודדים (כמו 2C איור' ו- D'), גרעינים hemocyte המסלול באמצעות גישה פתוחה ImageJ plug-in "TrackMate" או "מדריך מעקב" (שיטות לאור ^{33, 34}).
9. השתמש הבדיקות photoconvertible (כגון קאךה³⁰) כדי photoconvert באופן סלקטיבי, תווית תת-קבוצה של תאי אפיתל או המערכת החיסונית במהלך דימות.
   1. פתח את המודולים המתאימים בתוך התוכנה הדמיה כדי לבצע את photoconversion (כגון FRAP, קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר הלבנת-צילום מודול) ולהפעיל את 405nm לייזר (על-ידי לחיצה על תיבת בתוכנות הרלוונטיות)³⁵.
   2. בחר בתאים כדי להיות photoconverted בתוך התוכנה FRAP באמצעות הכלי בחירה מרובע, עגול או ביד חופשית. בתוך התוכנה FRAP, להגדיר את הזמן-קורס photoconversion (Bleaching) מסגרת/איטרציה אחת והגדר את 405 ננומטר לייזר בעוצמה 20% לייזר. באופן ידני, לחץ להתחיל את הניסוי כדי לבצע photoconversion.
   3. לצאת המודול FRAP (לחץ על סגור) ולחזור למסך הדמיה המקורית בתוך התוכנה; שימוש 488 ננומטר, לייזרים nm 561 תמונה את אופן הפעולה של תאים photoconverted ושאינם-photoconverted על-ידי הגדרת z-מחסנית והקלטה בצילום מואץ כאמור לעיל.
      הערה: Photoconverted הגששים נותרים יציבים במשך שעות רבות לאחר photoconversion הראשוני, המאפשר את אופן הפעולה של התאים photoconverted להיות אחריו לאורך זמן (לפחות 5 שעות). לדוגמה, דלקתיות התאים בתוך הפצע יכול להיות סלקטיבי photoconverted (איור 2F), את התנהגותם בעקבות כפי הם פותרים מאתר פגיעה (איור 2G ו- H).

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר את הכנת דרוזופילה הגלמים עבור הדמיה בצילום מואץ בשידור חי של הפצע תיקון ודלקת ויוו. באמצעות שיטה זו, זה צריך להיות ניתן לייצר מספר סרטים ברזולוציה גבוהה של סגירת הפצע הגולמי והגיוס תאים דלקתיים בקלות תמונה הגלמים עבור פרקי זמן ארוך (לפחות 5 שעות) שלאחר ופצעו ללא photobleaching משמעותית.

ערכת כללי להכנה גולם דרוזופילה

איור 1 מדגימה שיטת אופטימלית עבור הכנת דרוזופילה הגלמים ויוו הדמיה. דרוזופילה לבן 'prepupae' נאספים ב- '0 h' לאחר היווצרות puparium (APF), ככל החרקים זוחלים חדל תנועתיות ולאמץ את הצורה הגולמי סטריאוטיפי עם everted נשימה תוספות (spiracles) גלוי בקצהו הקדמי ביותר שלהם ( איור 1A). ה 0 לבן APF prepupae מותר לפתח עבור 18 h ב- 25 ° C, שבו זמן הפך puparium בראון (איור 1B) והם מכן גזור באמצעות מלקחיים בסדר ו/או microscissors (איור 1C, כדי להסיר את המקרה הגולמי מגן) כדי לחשוף גולם שקוף אופטית בתוך (איור 1D). בעקבות ניתוח, הכנפיים הגולמי יהיה גלוי על הצדדים לרוחב של בית החזה הגולמי (במיתאר כחול, איור 1C-D). בשלב זה, שאר חלקי הגוף הגולמי גם הם בקלות ניכרת, לרבות עיניים, הרגליים, הבטן (המסומנות ב- 1D איור). הרגליים גם הם מתאימים ללימודי דלקת בפצע, יכולים להיות פצועים באמצעות שיטת לייזר זהה המתואר לעיל. מספר 18 h APF הגלמים יכול להיות מותקן בו זמנית בתוך המנה הדמיה (איור 1E, באמצעות heptane ב דבק נייר סינון ספוגי מים כדי למזער את התייבשות) עם חלק שטוח ביותר של האגף (עם מיתאר כחול) בקשר עם coverslip ( איור 1F); זהו יתרון מיוחד אם המיקרוסקופ הדמיה מצויד שלב ממונע כדי לאפשר מספר הגלמים שיירשמו בתקופה הדמיה בודד אחד. צריכים להיות מושלך מכל הגלמים אשר נפגעו במהלך ניתוח או הרכבה (למשל הגולם ממוקם שלישי ברצף, חץ איור 1E). חלקי גוף אחרים (למשל עיניים, רגליים, ורוד עם מיתאר) ניתן גם לפנות את coverslip והם זמינים עבור ופצעו ובעקבות הדמיה (איור 1F). לניסויים לומד פצעים יחיד, לייזר המושרה נזקים הם בדרך כלל בצורה הטובה ביותר שנגרם מרכזי באגף (כוכבית, איור 1F), למרות מיקומים אחרים עשוי לשמש אם פציעות מרובות שילמדו.

ופצעו סטרילי מפעילה תגובה דלקתית חזקה באגף הגולמי דרוזופילה

לעקוב הפצע ותיקון של המלווה תגובה דלקתית ויוו, כנפי 18שע APF דרוזופילה הגלמים הפצועים היו עם תמונה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בצילום מואץ (איור 2 א-H). בשלב זה הגולמי, epithelia אגף הם לוחות שטוחים פשוטה של תאים (הנקראת כאן באמצעות E-קדהרין מתויג GFP כדי לסמן גבולות תא בודד, אגף שוליים שמתואר באיור 2A). אפילו באגפים unwounded (נמוך ההגדלה, דמויות 2A ו- 2A'), מספרים גדולים של נדידת תאים חיסוניים מולדת (hemocytes, הנקרא באמצעות קמעונאי-Gal4 מונע cytoplasmic GFP, ירוק, ו- RFP גרעינית, מגנטה) ניתן למצוא במרחק (hemolymph דם חרקים) כובש את החלל חוץ-תאית להתערב (איור 2 א ו 2A'). לייזר המושרה לפגיעה האפיתל כנף הגולמי (שולי הפצע המתוארים לבן, איור 2B-D) מעוררת העברה מהירה של hemocytes לאתר הפצע (איור 2B-D ו תא החיסון גרעינים ב איור 2B '-D'). תיוג של hemocytes עם שני גרעיני (למשל RFP גרעיני 'אדום-עוקץ') בשילוב עם סמן cytoplasmic או cytoskeletal (למשל cytoplasmic GFP או Moesin מתויג GFP) זה שטר יתרון מיוחד שכן היא מאפשרת מעקב בו זמנית של גרעינים hemocyte (לניתוח אוטומטי של hemocyte ההתנהגות למשל העברת מהירות, כיוון), הפריט החזותי של מורפולוגיה hemocyte. זו האחרונה היא חשובה שכן היא מאפשרת לנו לקבוע אם hemocytes הן phagocytosing פסולת נמק (איור 2C, הזחה) קצוות הפצע (או חיידקים במקרה של זיהום)^12,23 , גם מאפשר לנו לעקוב אחר התנהגותם protrusive כפי שהם להאריך filopodia בסדר או lamellipodia בקצה המוביל שלהם כפי הם נודדים לקראת או הרחק את הפצע.

פשוט מעקב של מסלולים גרעיני hemocyte באמצעות ניתוח תמונות המתאימות תוכנה³² (טבלה של חומרים) מדגים את הדינמיקה-עתיים מורכבים לתגובה דלקתית, דומה לזה שדווחו בעבר עבור פצועים עוברי^9,36 (רצועות צבעוניות, איור 2C' ו D'). במרחק רק 30 דקות של ופצעו, hemocytes ממוקם קרוב אל אתר פגיעה להתחיל ההעברה מכוונת כלפי הפצע (איור 2C"). עם זאת, עם הגדלת זמן לאחר פציעה, hemocytes ממוקם בהדרגה עוד יותר מן האתר פגיעה גם להתחיל ההעברה מכוונת כלפי הפצע (איור דו-ממדי'). בדרך זו, 'גל' של תגובתיות תא החיסון שמתפשט מסובבת כלפי חוץ מהקצה הפצע הוא ציין, שאנו מדמיינים כדי לשקף פעפוע של chemoattractant הפצע מן האתר פציעה. הדינמיקות האלה תא החיסון-עתיים סיפק נקודת התחלה שימושית עבור שלנו במחקר עדכני שהפעיל מתוחכמים דוגמנות ("היסק בייסיאנית") אנליזה מתמטית להסיק מאפיינים הרומן של האות attractant הפצע (שיטות מפורט פורסם ב²³.) על ידי כיול המודלים שלנו חישובית (זה מקושר המילוי ההדרגתי attractant הפצע hemocyte bias) כדי להתאים שנצפה ויוו מסלולים המערכת החיסונית, אחד יכול לחלץ מפורט מאפייני attractant פצע המסלול שלנו hemocyte נתונים (כגון קצב פעפוע אות המקור, את משך הייצור אות)²³.

יתר על כן, על ידי נהיגה הביטוי של fluorophore photoconvertible קאךה בתוך שושלת היוחסין תא החיסון באמצעות קמעונאי-Gal4 (ירוק, איור 2E) גם היינו יכולים לתייג באופן סלקטיבי subpopulation של אלה hemocytes כנף הנדידה (כגון אלה גייסו לאתר הפצע; E, לפני UV-induced photoconversion ו- F, פוסט-photoconversion). אז שנמשיך את אופן הפעולה של hemocytes האלה לאורך זמן (מגנטה, איור 2G-H) כפי שהם לפתור מן האתר הפצע (חיצים, איור 2G ו- H) ולהשוות איך ההתנהגות שלהם שונה האלה הלא-photoconverted התאים לא מגיעים לאתר פציעה. השתמשנו זה ויוו תיוג טכניקה כדי להדגים כי hemocytes מגויס ראשוני לפצוע באופן זמני רגישות לפצע השנייה שנוצר 90 דקות מאוחר יותר²³, למרות טכניקה זו תיוג דיפרנציאלי יכול גם יש הרבה שימושים תובנה אחרים בעתיד (ראה דיון).

באמצעות גישה זו, נוכל גם בעת ובעונה אחת לעקוב אחר הדינמיקה-עתיים של הפצע תיקון או אתה-epithelialisation' (איור 2B-D). כאן ubiquitously לידי ביטוי מתויג GFP E-קדהרין מתייג את צמתי adherens הסלולר ברחבי האפיתל כנף ומאפשר את הצורות של תאים אפיתל בודדים להיות אחריו לאורך זמן. קצה הפצע מזוהה בקלות בצומת שבין תאי אפיתל GFP שכותרתו שלם ופסולת ללא תווית (לבן קו מקווקו, איור 2B-D). עבור רוב הפצעים, הפצע מתחיל מחדש epithelialize בתוך h 1 של פציעה, פנימה מקדמות את קצה הפצע (איור דו-ממדי); הפצעים של גודל זה ירפא בדרך כלל בתוך 2-3 h של פציעה²³. סגירת הפצע עוברי והן הגלמים הוא מונע על ידי כבל כויץ actomyosin יחד עם הקצה המוביל אקטין-עשיר filopodia^23,37; הדינמיקות האלה cytoskeletal ניתן לאבחן באופן ישיר במהלך תיקון הפצע באמצעות עיתונאים המתאים ויוו , כמו דלעת הספגטי מתויג GFP (צולבות הקישור חוטים שרירן רגולטוריות שרשרת אור) או מתויג GFP מחייב אקטין Moesin²³. עבור פצעים גדולים במיוחד, עם זאת, כבל actomyosin ואת הקצה המוביל filopodia אינן נמשכות - הפצעים הללו הופכים "כרונית", אף פעם לא לגמרי מחדש epithelialize²³ גם אחרי הרבה תקופות ארוכות יותר (מעל 24 שעות) אין ויוו הדמיה. מעניין, התגובה דלקתית המשויך הפצעים הללו-הילינג הוא שונה במידה ניכרת מן משויכים עם פצעים אקוטי נורמלי²³ רומז כי התנהגות חריגה תא החיסון יכול להיות סמן prognostic שימושי במרפאה . בעתיד, בהמשך ויוו ניתוח של פצעים כרוניים באמצעות הדמיה ארוכת טווח (מעל 24 שעות) במודל הגולמי עשוי לספק תובנה מכניסטית חשוב המתיש הזה.

איור 1: דרוזופילה גולם הכנה ופצעו, הדמיה לחיות. (א) דרוזופילה prepupae לבן שייאסף הו APF, עם הקצה הקדמי שצוין על-ידי everted נושם תוספות (spiracles). (B) לאחר שהקים prepupae APF לבן h 0 עבור 18 h ב- 25 ° C, puparium מופיע חום. ניתוח המקרה הגולמי לתדר האזור הקדמי ביותר (חץ), שמציין את spiracles everted כמו הגולם נאות נעדר זה באזור, ואת מלקחיים בסדר ו/או microscissors להשתמש כדי להסיר המקרה הגולמי מגן (C). הכנפיים הגולמי יהיה גלוי על הצדדים לרוחב של בית החזה הגולמי (קווי מתאר כחול). התיק הגולמי (D) הוסרו לחלוטין מ- 18 h APF גולם, כאן הגולם התגלגל 90 ° כדי להראות את הצד הלטראלי, עם האגף לדימות במיתאר כחול. (E-F) חמש 18שע APF הגלמים רכוב על זכוכית coverslip בתוך הדמיה מאכל באמצעות דבק heptane ב, עם ספוג מים נייר סינון כדי למזער את התייבשות (E). גולם ממוקם שלישי ברצף (חץ) צריכים להיות מושלך כפי נזק שקרה במהלך ההכנה. הגלמים הם רכובים עם החלק שטוח ביותר של האגף (עם מיתאר כחול) בקשר עם coverslip (F) ו לייזר המושרה פצעים נוצרים מרכזי באגף (כוכבית, F), למרות מיקומים אחרים עשוי לשמש אם פציעות מרובות שילמדו. התמונה ב- (D) הותאם באישור. et al., 2016 האורגים²³. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: דינמי ויוו ניתוח של התגובה דלקתיים ברקמות. הגלמים גזור מן המקרים הגולמי מגן, רכוב על זכוכית coverslip (א) נפצעו, לאחר מכן עם תמונה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בצילום מואץ (בה). נמוכה הגדלה תצוגה של האגף הגולמי unwounded (A, אגף שוליים המתוארים בלבן) המכיל מספר גדול של hemocytes נודדות (א'). לייזר המושרה לפגיעה האפיתל כנף הגולמי (B-D, תא לגבולות התא הנקרא באמצעות מתויג GFP דרוזופילה E-קדהרין; פצע שוליים המתוארים בלבן) מפעילה תגובה דלקתית מהירה עם ההעברה של מספר hemocytes ( קמעונאי-Gal4 המונעת על ידי ביטוי של RFP גרעינית, מגנטה, cytoplasmic GFP, ירוק) לכיוון האתר הפצע (B-D; מסגרות נציג מסרט זמן לשגות בו כל מסגרת היא תחזית של 25 פרוסות 3 μm). מעקב ידני של מסלולים hemocyte (רצועות צבעוניות, ג ' ו- D') מציינים את הדינמיקה-עתיים מורכבים לתגובה דלקתית, דומה שדיווח על עוברי פצועים. Hemocytes phagocytose גם עם נמק הסלולר פסולת באתר הפצע (חץ, C גם כניסה). הביטוי של fluorophore photoconvertible קאךה בשושלת תא החיסון (ירוק, E, באמצעות קמעונאי-Gal4) מאפשר גייס הפצע hemocytes (חץ, E) באופן שונה עם התווית (מגנטה, F), אחריו במשך הזמן כפי הם פותרים מאתר פגיעה (חיצים, G ו- H). אחרים הגולמי הבאים נוצלו: (י-ם) w¹¹¹⁸; ubi-דה-cad-GFP, קמעונאי-Gal4 > UAS-GFP(II); UAS-nRFP(III) ו- (E-H) w¹¹¹⁸; srp-Gal4(II); UAS-Kaede(III). תמונות הותאם באישור. et al., 2016 האורגים²³. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

תגובת דלקתית חריפה נזק לרקמות הוא תהליך מורכב, דינמי מאוד חיוני שננהל את התיקון של רקמות פצוע, לרבות פינוי של פסולת נמק ומאבק נגד זיהום. מלא להבין, לפענח את ההיבטים הבסיסיים של תגובה זו, זה קריטי כי מחקרים הם שבוצעו ויוו על דגימות חיים תלת-ממדי כדי הפעולה המדויקת, האינטראקציות השונות תא שושלות מעורב להיות אחריו באופן מדויק לאורך זמן. ניתוח בזמן אמת של הדינמיקות האלה תא מאפשרת אפיון מפורט יותר של פנוטיפים מוטציה מאשר סטטי יחיד בזמן נקודות מדגימות קבוע באמצעות טכניקות אימונוהיסטוכימיה קלאסי. באופן מסורתי, רוב המחקרים הדמיה לחיות באמצעות מודל דרוזופילה גנטית צייתן השתמשו עובריים לשלב ההתפתחות fruitfly בשל המוגבהת האופטי שלה נייחות לעומת שלבים התפתחותיים מאוחר יותר^{4 , 5}. עם זאת, לאחרונה הקבוצה שלנו ואחרים פיתחו הגולם דרוזופילה כמודל הרומן לבצע ברזולוציה גבוהה לטווח ארוך הדמיה של הפצע תיקון ודלקת בו-זמנית ויוו^{8,22 ,23}. גישה זו המתעוררים מציע פוטנציאל לטווח ארוך מרגש של היבטים יסודיים unraveling אופן הפעולה של תאים דלקתיים, ניתן להתאים נוסף כדי לחקור את התנהגות דינמית של שושלות תאים אחרים (כגון דרוזופילה adipocytes ³⁸) בעקבות פגיעה ברקמות.

ישנם מספר גורמים קריטיים במהלך ההכנה, הדמיה של הפצועים הגלמים דרוזופילה שיקבע את איכות התוצאות הדמיה שתוארו לעיל. ניתן לטעון השלב הקשה ביותר של הפרוטוקול המתואר היא ניתוח זהיר של מיקום מדויק של הגלמים לפני ופצעו והדמיה. הגלמים בשלב התפתחותי זה הם רגישים במיוחד, אפילו מינורי נזק בשוגג הגלמים הכנה בשלבים יפגום באופן משמעותי את הניסוי; כל הגלמים ייתכן שקיימו נזק מכוון חייב להיות מושלך מהניסוי מאז נזק זה יכול להפעיל משלו תגובה דלקתית, אשר עשוי להוביל עוד השלכות פרושות לרווחה (או אפילו מערכתית) על תאים דלקתיים התנהגות במקומות אחרים הגולם. עקב הפיתוח המתמשך של הגלמים מנוצל בניסויים אלה (אשר עוברים rearrangements לרקמות משמעותי להתכונן לבגרות רקמות), לעיתים הגלמים יעברו במהלך דימות. מתגלגל הגולמי הוא, לעומת זאת, עשויה להתרחש אם גלמי יש לא היה רכוב כראוי עם משטח שטוח ביותר של האגף (או רקמות אחרות לדימות) בקשר ישיר עם coverglass; שימוש בדבק heptane ב לייצב את הגלמים על הזכוכית המכסה צריך למזער תנועה זו לא רצויים. מסיבה זו, זהירות רבה יש לקחת גם להימנע הם מוציאים את הגלמים עמדותיהם מסודרים בקפידה בעת העברת הדגימות בין מיקרוסקופים; באופן אידיאלי, הלייזר wounding יצורפו המיקרוסקופ אותו כדי לשמש עבור הדמיה בצילום מואץ עוקבות, צילום-המרה.

בנוסף מיומנות של דיסקציה הגולמי, הרכבה צעדים, גנוטיפ המדויק של הגלמים דרוזופילה בשימוש תהיה השפעה משמעותית על איכות הנתונים הדמיה שנוצר. לדוגמה, מספר העותקים של הנהג Gal4 ושל מבנים UAS (למשל UAS-GFP או קאךה UAS) במרחק גנוטיפ הגולמי בודדים יקבע את יחס אות לרעש במהלך דימות עוקבות. ככלל, עותקים רבים יותר של Gal4 או UAS לבנות הנוכחי, יגדל הרמה הכוללת של חלבון פלואורסצנטי (למשל GFP או קאךה) בתוך הרקמה. הרמה האופטימלית של חלבון פלואורסצנטי, עם זאת, יהיה איזון זהיר בין זריחה רקמות והתעלות מספיק כדי לאפשר באיכות גבוהה הדמיה (ומאפשר שימוש כוחות לייזר נמוכה, ירידה photobleaching הדמיה לאורך זמן ממושך תקופות) אבל מבלי לגרום fluorophore-induced רעילות הסלולר; המספר האופטימלי של המבנים Gal4 ו UAS ניסוי ישתנו בהתאם מנהלי התקן מסוים fluorophores בשימוש. צריך לקחת כדי לגייס את הגלמים 25 ° c (או לעיל, עד 29 ° C) כי מערכת Gal4-UAS טמפרטורה רגיש ולא יהיו יעילות על טמפרטורות נמוכות³¹. על מנת להשיג רמות נוספות של שליטה על הרקמה או זמן-יחודיות של Gal4 -מונע הביטוי, Gal4-UAS מערכת מדכא. שבולם Gal80 יכול גם להיות כלולה גנוטיפ הגולמי³⁹. Gal80 יכול לשמש גם כדי לדכא פעילות Gal4 בתוך רקמה מסוימת (באמצעות Gal80 של רקמות ספציפיות) או בזמן מסוים (באמצעות חום Gal80 רגיש). מערכת Gal4-UAS יכול להיות משולב עם עוד מערכות בינאריות עצמאיות אחרות (כגון לקסה -lexAop ומערכות QF -QUAS ) כדי ליצור דרוזופילה שבו יש מספר מבנים (למשל fluorophores, קווים RNAi או מבנים גנטיים אחרים) הביע בו זמנית במגוון של רקמות שונות³⁹.

השימוש המודל הגולמי דרוזופילה החדש מציע מספר יתרונות על פני הגישה המסורתית יותר העובר. בהשוואה ההדמיה לטווח קצר (עד 3 h) הזמינים ב שלב 15 עוברי (השלב שבו ביותר עובריים ופצעו מחקרים מבוצעים) גלמי יכול לדימות לאורך תקופות ארוכות יותר באופן משמעותי בזמן (בתוך המנהל עד לבגרות לאחר 96 שעות התפתחות הגולמי ). יתר על כן, מספר גדול בהרבה של hemocytes (דרוזופילה מולדת תאים חיסוניים) הם מתנה בתוך רקמות הגולמי (ו זמין עבור הדמיה) לעומת מספר מוגבל יותר מתנה בתוך העובר, זה מה שאיפשר לנו לאסוף יותר באופן משמעותי הדמיה נתונים על התנהגות hemocyte באמצעות המספר הכולל זהה של דגימות. ויותר חשוב, זה, בתורו, איפשר לנו להחיל מודלים מתימטיים מתוחכמים יותר לנתח את התנהגות hemocytes ולחלץ תכונות הרומן של הפצע attractants, תגובה דלקתית אחרת נותרו ניסיוניים לא נגיש²³. יתרון נוסף של המודל הגולמי נמצא זה נוקאאוט מציאה RNAi בתיווך גנים באופן משמעותי יעיל יותר מוקדם העובריים, המאפשר ניתוח משופרת של רקמות או גנים ספציפיים זמן איון באמצעות מערכות בינאריות כגון מערכת Gal4-UAS ³⁹. היעילות של RNAi בשלב זה ובכך נפתח את היכולת לבצע בקנה מידה גדול (או אפילו מוטים הגנום כולו) RNAi מסכי כדי לחפש רומן השחקנים המעורבים הפצע. לתקן או בהתנהגות התא דלקתיות.

עם זאת, דרוזופילה הגלמים בבירור לא ניתן להשתמש כדי ללמוד על הפנוטיפים הנובעים מוטציות גנטיות אשר הם מתחלקים קטלני; מחקרים הדמיה לחיות פונקציונלי של גנים חיוניים התפתחות ולכן עדיין יתבצע בו עוברי, אלא אם כן מציאה RNAi בתיווך גנים נוקאאוט זמן או רקמות ספציפיות באופן מאפשר פיתוח להתרחש דרך בשלבים הגולמי. העובר נשאר גם בדגם הבחירה ללמוד לחיות-התמונה תכונות מסוימות של התנהגות תא החיסון, לרבות פיזור התפתחותית של התאים החיסוניים מ מוצאם, קשר-עיכוב של גפיים, phagocytosis בגופות אפופטוטיים להיפגע שנוצר במהלך התפתחותי רקמות פיסול^5,8 אשר לא נצפו עוד דגמים הגולמי. למרות מחקרים דרוזופילה הזחלים ומבוגרים סיפקו תובנה חשובה המנגנונים בפצע דלקת ותיקון^{40,41,42,43, 44} הדמיה לחיות מחקרים בשלבים אלה הוכיחו קשה בשל אופיו ניידים מיסודו של הדגימות. בעוד הזחלים. יכול להיות מורדם כדי לאפשר תקופות קצרות של הדמיה לחיות, בשל אופיו הזמני של ההרדמה, לתקן רק קצר תמונות של הפצע בשידור חי או תגובה דלקתית יכול להיות מטמיעים⁴⁵. מחקר שנערך לאחרונה פיתחה כעת פרוטוקול משופרת המאפשרת הדמיה וקהילותיהם של ריפוי⁴⁶, הפצע זחל למרות הכנה והדמיה עדיין נשארים מאתגרת יותר במידה ניכרת מאשר עוברי או הגלמים. לטווח הארוך, נוכל לדמות את זה על-ידי ניצול השלב ההתפתחותי המתאים ביותר לתת מענה לכל שאלה ספציפית, מחקרים כל ארבעת השלבים האלה דרוזופילה שונות - מן העוברים דרך ותקופות זחל הגולמי לבגרות (כל אחד עם משלהם יתרונות ייחודיים, מגבלות) - תספק משלימים תובנות המנגנון המולקולרי וסלולריות נהיגה הפצע תיקון ודלקת.

בעתיד, פרוטוקול זה עבור ופצעו והדימות לטווח ארוך של הגלמים דרוזופילה ניתן להתאים בקלות ללמוד מגוון של תופעות הקשורות דלקת ויש לו פוטנציאל מרחיק לכת עבור חשיפת הרומן תכונות של התגובה פצע דלקתי. השילוב של הדמיה לטווח ארוך, יחד עם היישום של photoconvertible fluorophores (כגון קאךה), הן בעלות ערך רב להבנת הדינמיקה של התנהגות מולדת תא החיסון והבנתי בפרט, הרחוק פחות שלב ברזולוציה של התגובה דלקתית של הפצע. על-ידי תיוג ספציפית או הפרט או subpopulations של תאים חיסוניים (כגון אלה מגויס לפצע) ניתן יהיה לנתח כיצד חשיפה אחת cue סביבתיים (כגון גופה או פציעה) משפיע על הבאים בתגובה המערכת החיסונית של התא יותר מאוחר תהיה מוכן. ניתן לשנות את התנהגות דלקתיות דרוזופילה hemocytes על ידי התנסויות קודמות - לדוגמה, הם אינם בשלה להגיב לפגיעה ברקמות מאת phagocytosis מוקדמת בגופות אפופטוטיים להיפגע במהלך פיתוח¹² אבל זה נותר לראות אם רמזים סביבתיים אחרים לגרום לקרקע אירועים דומים. למרות מחקרים של פצעים הגולמי עד כה התמקדו תגובה דלקתית הטבועה, המודל כנף הגולמי מספקת הזדמנות אידיאלית שתי תמונות לחיות גם ומנתחים המנגנונים לתיקון הפצע אפיתל. יתר על כן, שיטת הדמיה הגולמי הזה יכול להתאים גם לחקור את התנהגות דינמית של אחר שושלות תאים בתגובה רקמת נזק³⁸, האגף הגולמי עצמו או רקמות אחרות הגולמי נגיש בקלות (כגון עיניים, הרגליים או בית החזה). בסופו של דבר, על ידי שילוב של ללקוחות שלנו גנטי של דרוזופילה יחד עם הקלות של הדמיה הגולמי לטווח ארוך, תיקון אפיתל הרומן או דלקתיים הרגולטורים יכול שלא נחשפו באמצעות היישום של הגנום כולו דפיקה למטה לא משוחד גישות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila stocks
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)	Kyoto Stock Center, DGRC	#109007	Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;;Ubi-p63E-shg.GFP (III)	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#58742	Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged Moesin P{sGMCA}3.1	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#59023	The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T.
hemocyte specific serpent-Gal4 driver ;srp-Gal4;	Generated by Katja Bruckner	Generated by Katja Bruckner	Expression of Scer\GAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuclearRFP w1118;;P{UAS-RedStinger}6	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#8545 or #8547	UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal
UAS-cytoplasmicGFP ;;P{UAS-GFP.S65T}	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	Multiple stocks available (e.g. #1522)	Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness.
UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#26161	Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV.
GFP-tagged spaghetti squash w1118;;P{sqh-GFP.RLC}	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#57145	The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:Avic\GFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ingredients for fly food media			Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.)
maize	Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)	Contact supplier direct	organic
soya flour	Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)	Contact supplier direct	organic
malt extract	Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)	Contact supplier direct	organic
molasses	Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)	Contact supplier direct	organic
Difco agar	BD Biosciences, Fisher Scientific	DF0142-15-2	For preparation of fly food
Propionic acid	Sigma	402907	For preparation of fly food
Nipagen	Sigma	79721	For preparation of fly food
Dried baker's yeast	Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD	Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD	For preparation of fly food
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sample preparation and mounting
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	For preparation of heptane glue
Fine sable paintbrush	Daler-Rowney (or equivalent)	#0 or 1
Forceps	Fisher Scientific (or Fine Science Tools)	NC9404145	Dumont #5
Glass bottomed dishes for imaging	MatTek	P35G-0-10-C	We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment.
Heptane	Sigma	51730-5ML	For preparation of heptane glue
Double sided sticky tape (e.g. Scotch)	Agar Scientific	AGG263	For preparation of heptane glue
50ml tube (for heptane glue)	Falcon tubes from Fisher Scientific	14-432-22	For preparation of heptane glue
Glass microscope slides	Agar Scientific	AGL4244	For dissection of Drosophila pupae
Dissecting stereo microscope with brightfield	Leica (or equivalent)	M50	For dissection of Drosophila pupae
Microscissors	John Weiss International	103123	Miniature Research Scissors (straight)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser ablation and imaging
Nitogen ablation laser	Spectra-Physics (or Andor equivalent)	Model VSL-337ND-S	For wounding, this should be attached to a widefield imaging system
Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM)	Leica (or equivalent)	TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent)	Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal)
Environmental chamber	Life Imaging Services (or equivalent)	"Microscope Temperature Control System"	Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging
Name	Company	Catalog Number	Comments
Image Analysis Software
FRAP software module	Leica (or equivalent)	CLSM FRAP software module	For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede
ImageJ (image analysis software)	National Institutes of Health (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/	Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012.
ImageJ plugin "Manual Tracking"	National Institutes of Health (NIH)	https://imagej.net/Manual_Tracking
ImageJ plugin "TrackMate"	ImageJ, NIH	https://imagej.net/TrackMate	Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (high performance 3D imaging software)	Perkin Elmer	Volocity 6.3	For image analysis
IMARIS (image analysis software)	Bitplane	IMARIS for Cell Biologists	For image analysis