מודל רב תכליתי של שנתות קשה שרץ על ארנבים מעבדה

Summary

פיתחנו מערכת פשוטה ופסיביות ניזונים קרציות קשה מעבדה ארנבים. פרוטוקול שאינו מפרך שלנו משתמשת בחומרים נגיש בקלות, ניתן להתאים בהתאם לדרישות של ההגדרות ניסיוני שונים. השיטה מאפשרת ניטור נוח ו/או דגימה של קרציות במהלך תקופת האכלה כולה.

Abstract

השימוש של בעלי חיים במחקר שנתות חיוני עבור מגוון של מטרות ניסיוני כולל שמירה על מושבות שנתות קשה במעבדה. ב. קרציות, כל שלבים התפתחותיים (למעט ביצה) הן hematophagous, רכישת ארוחה דם כאשר למארחים חוליות שלהם חיונית סיומו המוצלח של מחזור החיים שלהם. כאן נדגים שיטה פשוטה המשתמשת קפסולות openable בקלות האכלה של קרציות קשה על ארנבים. היתרונות של השיטה המוצעת כוללים שלה פשטות, משך קצר, תכליתי והכי חשוב התאמה לצרכים של דרישות ספציפיות ניסיוני. השיטה מאפשר את השימוש צ'יימברס מרובים (בגדלים שונים) על אותה חיה, מה שמקנה האכלה מספר שלבים או קבוצות ניסוי ובו-בזמן להפחית את הדרישה בסך הכל בעלי חיים. החומרים ללא ונגיש בקלות בהם מזעור אי נוחות על חיות שניתן בקלות התאוששה ניסוי, המוצעים לאימוץ או לעשות שימוש חוזר אם הפרוטוקול האתי מאפשר זאת.

Introduction

הקרציות קשה (Ixodidae) ידועים היטב כמו איטי פרוקי רגליים האכלה, יכול להיות מצורף במחשב מארח מספר ימים, או שבועות, תלוי במין וההתפתחותי. שלב¹. פרוקי רגליים אלה hematophagous חובה וקטורים של מגוון רחב של גורמים מדבקים, כגון חיידקים, חד-תאיים, וירוסים, ובכך להציג סיכון משמעותי בפני בני אדם, בעלי חיים בריאות¹. מתי ללמוד ביולוגיה שנתות או הערכת שיטות בקרה חדשות, הקמת שנתות יעיל מערכות האכלה היא קריטית על מנת לעצב את הניסויים ביעילות להשיג את goal(s) של המחקר. לאחרונה, מספר השנתות מלאכותי האכלה מערכות (הימנעות השימוש של בעלי חיים) היו מפותחות^2,3,4 , יש להשתמש במידת האפשר. עם זאת, מערכות אלו לא הצליחו להחליף שנתות האכלה בבעלי חיים ולאחר שהם אינם מתאימים תחליפים תנאים הפיזיולוגיות רבים הדרושים עבור מחקרים מדעיים. לכן, במקרים מסוימים, השימוש בבעלי חיים מארחים נסיוניים חיוני להבטיח את הרלוונטיות של תוצאות הניסוי.

ארנבים ניו זילנד מעבדה הוכיחו להיות המארחים נגיש ביותר עבור מספר ixodid שנתות מינים^5,6,7,8,9. שתי אסטרטגיות נפוצות של שנתות ניזון ארנבים שימשו לעיתים קרובות: א) ניזון אוזני הארנב מכוסה כותנה בד או גרביים^6,7, ב) האכלה שקיות כותנה⁹, ניילון בקבוקי¹⁰ או אטומה צ'יימברס¹¹ דבוקה לגב של הארנב. ההזנה על האוזניים של הארנב אינה מערכת אלגנטית, מפני קרציות (בשלבים מוקדמים במיוחד, הזחלים או נימפות) עשוי לסרוק ולצרף עמוק בתוך תעלת האוזן, וזה לא נוח לבעל החיים גורם בקרה של שנתות האכלה ו/או ההתאוששות של צבה קרציות קשה. מערכת זו היא גם מוגבלת לקבוצות רק שתי שנתות על אוזניים מכוסה על ידי גרביים ונטויה. צווארונים האליזבתני, המייצג של אי נוחות משמעותי לבעל החיים. שאר מערכות^9,10,11 הם בהחלט יותר מתקדם, מתאימה לתחזוקה המושבה שנתות קשה. עם זאת, הם מוגבלים במספר הקבוצות ניסיוני על הארנב וכן המידות לניתן לשינוי/הצורות של התאים האכלה. בנוסף, פרוטוקולים אלה דורשים לעיתים קרובות להביך את הרגליים ארנב האחורי כדי למנוע שריטות ושימוש קולרים האליזבתני כדי למנוע לטפח.

במסמך זה אנו מציעים שיטה פשוטה, שאינה מפרך ויעילה מאוד להאכיל קבוצות מרובות של קרציות קשה בדלתיים סגורות דבוק הארנב בחזרה מכוסה על ידי ג'קט, ביטול הצורך קולרים האליזבתני או דופק במהלך הניסוי. באופן ספציפי, המערכת שלנו משתמשת קפסולות אלסטי זני אתילן ויניל אצטט (EVA) קצף גיליון מכוסה על ידי רשת נגד יתושים ומודבק הארנב מגולח עם מהיר שהשרף מתהווה (3 דקות) ללא דבק לטקס. טכניקה זו מאפשרת ההחזקה של כמוסות מרובים של הגודל הרצוי או צורה, כמה שבועות לאחר הניסוי הארנבים הם החלים לחלוטין. המערכת מתאימה בעיקר לשלבים נטפלים ומבוגרים שנתות קשה, אך עם שינוי קטן זה יכול לשמש עבור הזחלים האכלה גם כן. השיטות מבוססות-קצף אווה עבור קשה שנתות האכלה שעשוי להיות מותאם סוגים אחרים של חוליות מארחים, לדוגמה כבשים (אשר מוצג בתור אחת החלופות בעיתון הזה).

Protocol

הערה: במחקר זה, ארנבים היו מתוחזקים בכלובים רגילים עם אוכל, מים מוצעים ad libitum בסוכנות צרפתית עבור מזון, איכות הסביבה, בריאות תעסוקתית & בטיחות (ANSES) מוכר מתקנים בעלי חיים אלפורט, צרפת. חיות נוטרו פעמיים מדי יום על ידי שני טכנאים מנוסים עבור תגובות חריג בעור, בעיות בריאות או סיבוכים. החדר ניסיוני היה מאובטח על ידי הפללת הפנימי של הפתח עם סרט הדבקה דו-צדדי כדי למנוע בריחה מקרית של קרציות. השיטה עובדת בצורה מיטבית אם שני אנשים עובדים כצוות, אבל לא ניתן להשלים יחיד הנערץ על ידי אדם מנוסה אחד. אמנם רוב הארנבים נינוח ורגוע, סימנים של לחץ עלולה להתרחש במהלך המניפולציה. כדי להבטיח כי ארנב אינה פוגעת עצמה על ידי נאבק, איפוק ידני עשוי להתבצע על-ידי החזקת בעדינות של עורפה של הצוואר ביד אחת בעוד היד השנייה תומך בכך האחוריות. מלפני חצי שנה, המלונות בהם צפיתי כבשים הנשי נשמר במרכז מתקני מחקר ביו-רפואי (CRBM) נבחרת וטרינרי בית הספר של Alfort (ENVA), מים ומזון היו שסופקו ad libitum, ואיפה זה נבדק פעמיים ביום.

הערה: המעבדה שלנו קיבל הרשאה לשימוש ארנבות וכבשים שנתות האכלה על ידי ועדת האתיקה חיה ניסויים יבוא Anses/ENVA/UPEC, היתר מספרי 01741.01, 11/10/16-5B, בהתאמה. מאז היינו רק קרציות נטולת הפתוגן בניסויים שלנו, כל הארנבונים השתמשו במחקר זה היו מוצעים לאימוץ באמצעות האגודה הארנב הלבן, פריז, צרפת.

1. הכנת הקפסולות

1. לחתוך לגודל הרצוי של הקפסולה מגליון קצף אווה (איור 1א'). הסיבוב החיצוני פינות (איור 1B) של הקפסולה כדי לצמצם ניתוק בשוגג בעת הדבקה זה על העור ארנב.
   הערה: עובי המסגרת של הקפסולה צריך להיות בסביבות 8 מ מ. השתמש גיליון מוקצף בעובי 5 מ מ עבור הזחלים, נימפות, קרציות קטנות מינים למבוגרים כגון Ixodes. גיליון מוקצף בעובי 1 ס מ מתאים גודל גדול קרציות למבוגרים כגון Amblyomma sp., Hyalomma sp., וכו שהגודל של הקפסולה משתנה לפי דרישות ניסיוני. לדוגמה, עבור 20 זוגות מבוגרים Ixodes , נימפות 200 או 1,000 הזחלים, אנו משתמשים גודל של קפסולה הפנימי של 5 x 5 ס מ², 6 x 7 ס מ² או 7 x 9 ס מ², בהתאמה.
2. גזור 8 מ מ רחב רצועות של הוק הדבקה קלטת (ראה טבלה של חומרים) ושמים אותם על המסגרת קצף אווה מוכן (איור 1C).
3. גזור הרצועות בגודל זהה של לולאה הדבקה קלטת (ראה טבלה של חומרים) ואגידתו לצדדים הוק מחוברים למסגרת קצף אווה (איור 1D).
4. לחתוך את הגודל המתאים של הרשת יתושים בסדר (גודל רשת פחות מ- 50 מיקרומטר) בהתאם לגודל המסגרת קצף אווה ודבוק זה הלולאה דביק (איור 1E ו- 1F). חותכים את המסוכך במידת הצורך.
   הערה: סוג זה של קפסולת יכול לשמש כדי להאכיל נימפות ומבוגרים מינים שנתות קשה, בזמן מערכת איטום שונה של הכמוסות היא זקוקה זחל האכלה (משלימה באיור 1) כדי למנוע בריחה מקרית של הזחלים דרך מהודק בצד וו ולופ.

2. הכנת הארנב לפני התפשטות שנתות

1. לגלח את האזור של הארנב ומאחור כדי לשמש עם מספריים (איור 2א).
2. חלות ללא דבק לטקס על פני כולו של הקפסולה מוכן ומחכה 1 דקות (איור 2B).
3. הדבק את הקפסולה על ידי לחיצה על העור (בעיקר בפינות) עם האצבעות במשך כ-3 דקות (איור 2C ו- 2D).
   הערה: בעת הדבקה כמוסה אחת, תוודאו שיש לפחות 5 מ מ שביניהם (איור 2E ו- 2F). אנחנו בדרך כלל להימנע האזור של עמוד השדרה, אך ניתן להשתמש במידת הצורך.
4. הרם מעט הקפסולות לבדוק חזותית ההחזקה שלהם על העור. אם נמצאו אזורים שאינם מצורפים, להחיל את הדבק בעזרת מרית, הקש על עוד 3 דקות.
5. סרט הגנה חלות על הכפות האחורי של הארנב כדי למנוע נזק המעיל (איור 2G).
   הערה: שלב זה הוא אופציונלי והוא הוא בעיקר כדי למנוע נזק מעיל, לא נזק הקפסולה שנתות.
6. ללבוש את המעיל ארנב על-ידי הצבת כאשר רגליו הקדמיות דרך הפתחים והידוק בצוואר, ביצוע בטוח ארנב נושם שרידים נוחים. לא למקם את הרגליים האחוריים דרך מתחמים אלסטי בשלב זה ולהשאיר את רוכסן פתוח (איור 2H).

3. שנתות התפשטות

1. מקום הקרציות לתוך מזרק פלסטיק (1 או 5 מ ל בהתאם למספר של האנשים) עם המחט-סוף גזורה מחובר עם כותנה (איור 1G). אם כמות קטנה של קרציות להיות שורץ, להשתמש מלקחיים.
   הערה: עבור תחזוקה המושבה שנתות לאפשר את תקתוק הנפוחים female(s) להטיל ביצים עם עוקבות הבקיעה בתוך המזרק (5 או 10 מ"ל) מכוסה על ידי רשת נגד יתושים השינוי עטוף עם גומייה¹² כדי להימנע מניפולציה מפרך של הזחלים בזמנו הם הם חלה על המחשב המארח (איור 1H). בנוסף, הזחלים מלא הנפוחים מותר להרשות לו נשירה במזרק (איור משלים 1I; 5 או 10 מ"ל) עבור התפשטות ישירה של הארנב עם נימפות.
2. מקם את המזרק עמוק לתוך הקפסולה באמצעות פתח פינה ואת לחסן הקרציות על-ידי לחיצה על הבוכנה מזרק. לאט לאט טוויסט על הבוכנה לכיוון העור הארנב כדי להסיר את הקרציות הנותרים קשורה על הבוכנה, בו זמנית תמשכי החוצה של הקפסולה (איור 2אני).
   הערה: אם חלק של האנשים אזחל הקפסולה, להחזיר אותם באמצעות מלקחיים.
3. לסגור את הקפסולה על ידי שנעל שוב את הקלטת וו ולופ.
4. למקם את הרגליים האחורי של הארנב האחורי מארזים אלסטי של הז'קט ו zip סגור.
   הערה: ודא כי האצבע יכולה להתאים בין הצוואר על הז'קט הארנב כדי להבטיח נוחות וגם כדי למנוע לועס את הז'קט.
5. להחזיר את הארנב הכלוב (איור 2J).
   הערה: הזמן התפשטות לאוסף של קרציות גדושה להשתנות בין מינים שונים שנתות, בשלבים התפתחותיים. לדוגמה, עבור Ixodes scapularis ו- Ixodes קיקיון, משך הזמן של האכלה עבור מבוגרים נימפות, הזחלים הם 6 – 9, 3-4, ו- 2-3 ימים, בהתאמה. ניתן למצוא רשימה של הפניות 29 מחזורים החיים שונים שנתות קשה בתנאי מעבדה בלוין ושומכר (2016)⁹.

4. איסוף וניטור של קרציות

1. קח את הארנב מן הכלוב לספסל, לפתוח את הז'קט.
2. בעדינות לרסן את הארנב עם הידיים. לפתוח את הקפסולה על-ידי unfastening את הקלטת וו ולופ (איור 2 K ו- 2 ל') ולאסוף את הקרציות צחצוח הזחלים הנפוחים (משלימה באיור 1) או נימפות על צלחת פלסטיק או באמצעות מלקחיים למבוגרים (איור 2L ). אם באופן חלקי (לא רצופים) קרציות נדרשים, להשתמש טוויסטר שנתות או מלקחיים כדי לנתק אותם.
   הערה: אם שמירה על המושבות שנתות בבקשה לראות את הפתק בשלב 3.1. לשמור על קרציות הנפוחים ב המתאים לח ותנאי טמפרטורה לפי המין שנתות מסוים.
3. אם יש צורך, refasten את הקלטת וו ולופ לסגור את הקפסולה.

5. שחזור של הארנב

1. להסיר את רשת היתושים לחלוטין של הקפסולה ולהשאיר את הז'קט הארנב (איור 2מ').
2. לחכות 3-4 שבועות, נסה להסיר את הקפסולה באמצעות בעדינות קיטום באחת הפינות (איור 2N). אם הקפסולה מחוברת עדיין בחוזקה, חזור על שלב זה שבוע לאחר מכן.
3. להסיר את הג'קט ולתת שהארנב לשחזר בכלוב.
   הערה: לאחר הקפסולה אינו פועל, בדוק עורו של הארנב לתגובות לא נורמלי. אמנם בדרך כלל אין טיפול נדרש, קרם emollient יכול לשמש במקרה של גירוי.
4. אם הפרוטוקול לבין ניסויים מאפשר, הארנב ששוחזר (איור 2O) ניתן לעשות שימוש חוזר או מוצעים לאימוץ.
   הערה: ארנבים הוכחו לרכוש התנגדות שנתות התקדמנו מכת קרציות חוזרות¹³; לכן, reinfestations לא מומלץ אלא אם הניסוי דורש.

תוצאות

כאן אנו מציעים לראשונה שיטה צעד צעד מפורט-מאת של שנתות קשה האכלה ב- EVA מוקצף קפסולות חלה על הגב של ארנב מגולח, מכוסה על ידי מעיל (איור 1  ואיור 2). פרוטוקול זה מתאים עבור סוגים שונים של ניסויים כאשר קבוצות שנתות שונים באותו מחשב מארח נ...

Discussion

הצעד החשוב ביותר של פרוטוקול זה כולה היא הדבק הקפסולה בחוזקה על העור מגולח. מסיבה זו, לחץ קבוע לפחות 3 דקות הוא קריטי, בעיקר בפינות. כאשר מזריקים הקרציות בתוך הקפסולה, חשוב ליישם אותם עמוק לתוך הפינה הנגדית של אחד פתוח כדי למנוע בריחה שנתות במהלך אטימה. בעת תכנון הניסויים, ודא כי כל הקפסולות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
New Zealand Rabbits (2.5-3.5 kg)	Charles River	Strain Code 571
Rambouillet sheep	Local provider-tick free farm	Female 6 months old
EVA foam 5 mm thick	Cosplay Shop	EVA-PE451kg (950mm x 450mm)	10 mm PE45 kg foam from the Cosplay Shop may be used for the large adult tick species
Foam Sheet 9" X 12" 6 mm-White	Amazon	FOAMSHT6-20	6 mm-EVA foam ca be ordered via Amazon as an alternative to the foam from Cosplay Shop
Full length rabbit jackets	Harvard Apparatus, Inc.	620077- medium, 6270078 - large
Non-toxic latex glue	Tear mender	Fabric & Leather Adhesive
Tubular cotton orthopedic stockinette	BSN Medical	9076 (12-15 cm wide)
Mosquito mesh	Loisirs Creatifs	Very fine filter nylon mesh fabric	Any mosquito mesh, or curtain material with the mesh size less than 50 μm is suitable.
Leukoplast	BSN medical S.A.S	LF 72361-02
Adhesive hook-and-loop tape	AIEX store	AIEX 39.37 Feet/12m Hook and Loop Self Adhesive Tape Roll, 20 mm width, white colour	Fullfiled by Amazon
Fast drying glue	Fixtout	Superglue