Um modelo versátil de infestação de carrapato duro em coelhos de laboratório

Resumo

Nós desenvolvemos um sistema simples e versátil para alimentar carrapatos duro em coelhos de laboratório. Nosso protocolo não-laborioso usa materiais facilmente acessíveis e pode ser ajustado dependendo das exigências das diversas configurações experimentais. O método permite monitoramento confortável e/ou amostragem de carrapatos durante todo o período de alimentação.

Resumo

O uso de animais vivos em pesquisa de carrapato é crucial para uma variedade de fins experimentais, incluindo a manutenção de colônias de tiquetaque duro no laboratório. Em carrapatos, todas as fases do desenvolvimento (exceto ovo) são hematófagos e adquirir uma refeição de sangue quando anexado a seus hospedeiros vertebrados é essencial para a conclusão bem sucedida de seu ciclo de vida. Aqui vamos demonstrar um método simples que utiliza cápsulas facilmente openable para alimentação de carrapato duro em coelhos. As vantagens do método proposto incluem sua simplicidade, curta duração e sobretudo versátil ajuste às necessidades dos requisitos específicos de experimentais. O método possibilita o uso de múltiplas câmaras (de vários tamanhos) do mesmo animal, que permite a alimentação de vários estágios ou diferentes grupos experimentais, reduzindo a exigência geral de animais. Os materiais não-irritante e facilmente acessíveis usados minimiza o desconforto para os animais, que podem ser facilmente recuperados de um experimento e oferecido para adoção ou reutilizados se o protocolo ético permitir.

Introdução

Os carrapatos duro (Ixodidae) são conhecidos como artrópodes alimentação lentas e podem ser conectados em um host para vários dias, ou semanas, dependendo da espécie e do desenvolvimento fase¹. Estes artrópodes hematófagos obrigatórios são vetores de uma grande variedade de agentes infecciosos, como bactérias, protozoários e vírus e, portanto, constituem um risco significativo para os seres humanos e animais saúde¹. Quando estudando biologia carrapato ou avaliar novos métodos de controle, o estabelecimento de uma escala eficaz sistema de alimentação é crucial para efetivamente desenha os experimentos e realizar o objetivo (s) do estudo. Recentemente, vários sistemas de alimentação artificial de carrapato (evitando o uso de animais vivos) foram desenvolvidos^2,3,4 e devem ser usados sempre que possível. No entanto, estes sistemas não foram capazes de substituir carrapato, alimentando-se de animais vivos, e eles não são substitutos adequados para muitas condições fisiológicas necessárias para estudos científicos. Portanto, em alguns casos, o uso de cobaias animais é crucial para garantir a relevância dos resultados experimentais.

Coelhos Nova Zelândia de laboratório têm mostrado os anfitriões mais adequados e acessíveis para vários ixodid carrapato espécie^5,6,7,8,9. Duas estratégias comuns de carrapato, alimentando-se de coelhos foram usadas frequentemente: a) alimentar em orelhas de coelho, cobertas com algodão pano ou meias^6,7e b) em sacos de algodão⁹, nylon garrafas¹⁰ ou neopreno câmaras¹¹ colado à traseira do coelho. Alimentando-se de orelhas de coelho não é um sistema elegante, porque carrapatos (especialmente primeiros estágios, larvas ou ninfas) podem rastejar e anexar no fundo do canal auditivo, que é desconfortável para o animal e faz o acompanhamento da escala de alimentação e/ou a recuperação de ingurgitadas difícil de carrapatos. Este sistema também é limitado a apenas dois grupos de carrapato na orelhas totalmente cobertos por meias protegidas por colares Elizabetanos, representando um significativo desconforto para o animal. Outros sistemas^9,10,11 são definitivamente mais avançados e adequados para a manutenção de colônia de tiquetaque duro. No entanto, eles são limitados no número de grupos experimentais colocados no coelho, bem como nas formas/tamanhos modificáveis das câmaras de alimentação. Além disso, esses protocolos exigem muitas vezes as pernas traseiras coelho para evitar coçar e o uso de colares elizabetanos para evitar o aliciamento a coxear.

Neste documento, propomos um método simples, não-trabalhoso e muito eficaz para alimentar vários grupos de carrapatos duro nas câmaras fechadas colados o coelho volta coberto por uma jaqueta, eliminando a necessidade para os colares elizabetanos ou coxear durante o experimento. Especificamente, nosso sistema usa cápsulas elásticas, feita de uma folha de espuma do etileno-vinil acetato (EVA) abrangidos pela malha de mosquito e colado para o coelho raspado volta com cola látex de não-irritante rápida solidificação (3 min). Esta técnica permite a fixação de várias cápsulas de forma ou tamanho desejado, e poucas semanas após o experimento os coelhos são totalmente recuperados. O sistema é adequado principalmente para os estágios de ninfa e adultos tiquetaque duro, mas com uma pequena modificação pode ser usada para larvas de alimentação também. Os métodos baseados em espuma de EVA para tiquetaque duro de alimentação podem ser adaptados para outros tipos de hospedeiros vertebrados, por exemplo, carneiros (que são mostrados como uma das alternativas neste artigo).

Protocolo

Nota: Neste estudo, coelhos foram mantidos em gaiolas padrão com comida e água oferecidos ad libitum na agência francesa para a alimentação, meio ambiente e saúde ocupacional & segurança (ANSES) credenciado instalações animais em Maisons-Alfort, França. Os animais foram monitorados duas vezes diariamente por dois técnicos experientes por reações anormais da pele, problemas de saúde ou complicações. A sala experimental foi assegurada enquadrando o interior da porta com fita dupla-face para evitar fuga acidental de tiques. O método funciona melhor se duas pessoas trabalham como uma equipe, mas é possível completar única handedly por uma pessoa experiente. Apesar da maioria dos coelhos são dóceis e calmos, sinais de stress podem ocorrer durante a manipulação. Para garantir que um coelho não ferir-se por lutando, contenção manual pode ser realizada mantendo delicadamente da nuca do pescoço com uma mão enquanto a outra mão ele suporta quartos traseiros. A seis meses de idade, Rambouillet Ovinos fêmeas foi mantido no centro para instalações de pesquisa biomédica (CRBM) na escola nacional veterinária de Alfort (ENVA), onde água e comida foram fornecidos ad libitum, e isso foi verificado duas vezes ao dia.

Nota: Nosso laboratório recebeu permissão para usar coelhos e ovelhas para carrapato alimentação pelo Comitê de ética Animal experimentos ComEth Anses/ENVA/UPEC, permitir números 01741.01 e 11/10/16-5B, respectivamente. Desde que usamos apenas carrapatos isentos de agentes patogénicos em nossos experimentos, todos os coelhos utilizados neste estudo foram oferecidos para adoção através da Associação de coelho branco, Paris, França.

1. preparação das cápsulas

1. Corte o tamanho desejado da cápsula da folha de espuma de EVA (Figura 1A). Ronda exterior cantos (Figura 1B) da cápsula para minimizar o desprendimento acidental quando a colagem é a pele de coelho.
   Nota: A espessura do quadro da cápsula deve ser em torno de 8 mm. Use uma folha de espuma espessa de 5 mm para as larvas, ninfas e espécies adultas de pequena escala como Ixodes. Uma folha de espuma de espessura de 1 cm é apropriada para o tamanho grande carrapatos adultos como Amblyomma SP., Hyalomma SP., etc. , que o tamanho da cápsula varia com base nos requisitos experimentais. Por exemplo, para 20 casais adultos de Ixodes , 200 ninfas ou 1.000 larvas, usamos uma cápsula interna do tamanho de 5 x 5 cm², 6 x 7 cm² ou 7 x 9 cm², respectivamente.
2. Corte o 8 mm de largura tiras auto-adesivas gancho de fita (ver Tabela de materiais) e fure-os ao quadro preparado de espuma de EVA (Figura 1C).
3. Corte as tiras de tamanho mesmo auto-adesivos loop de fita (ver Tabela de materiais) e ligação-los para os lados do gancho anexado ao quadro de espuma de EVA (Figura 1D).
4. Cortar o tamanho apropriado da malha fina de mosquito (malhagem inferior a 50 µm) para o tamanho do quadro de espuma de EVA e colá-la ao lacete autoadesivo (Figura 1E e 1F). Se necessário, corte as saliências.
   Nota: Este tipo de cápsula pode ser usado para alimentar ninfas e adultos de espécies de carrapato duro, enquanto um sistema de fecho diferente das cápsulas é necessária para alimentação larval (Supplemental Figura 1) para evitar a fuga acidental das larvas através do arrumações lado do gancho-e-laço.

2. preparação do coelho antes de infestação de carrapato

1. Raspe a região das costas de coelho e os lados para ser usado com tesoura(Figura 2).
2. Aplique a cola de látex não-irritante para toda a superfície da cápsula preparada e esperar 1 min (Figura 2B).
3. Cola a cápsula pressionando na pele (especialmente nos cantos) com os dedos por cerca de 3 minutos (Figura 2 e 2D).
   Nota: Quando a colagem de mais de uma cápsula, certifique-se de manter pelo menos 5 mm de espaço entre elas (Figura 2E e 2F). Nós geralmente evitar a região da coluna vertebral, mas pode ser usado se necessário.
4. Levante ligeiramente as cápsulas para verificar visualmente o seu apego à pele. Se encontram-se as regiões não-inscritos, aplique a cola com uma espátula e pressione por mais 3 minutos.
5. Aplique a fita protetora para as patas traseiras do coelho para não danificar o revestimento (Figura 2G).
   Nota: Este passo é opcional e é principalmente para evitar danos de jaqueta, nem danos para a cápsula de carrapato.
6. Coloque o casaco de coelho, colocando as patas dianteiras através das aberturas e apertar o pescoço, fazendo certo coelho permanece confortável a respirar. Não coloque as pernas traseiras através os cercos elásticas para esta etapa e deixar o zíper aberto (Figura 2H).

3. tick infestação

1. Coloque os carrapatos em uma seringa de plástico (1 ou 5 mL dependendo do número de indivíduos) com o fim de agulha corte e obstruídos com algodão (Figura 1G). Se uma pequena quantidade de carrapatos deve ser infestados, use fórceps.
   Nota: Para permitir a manutenção de colônia de carrapato o carrapato ingurgitado female(s) a pôr ovos com incubação subsequentes dentro da seringa (5 ou 10 mL) abrangida pelo mosquito malha envolvida por uma faixa de borracha¹² para evitar a manipulação laboriosa das larvas no momento eles estão aplicado para o host (Figura 1-H). Também, totalmente ingurgitadas larvas podem muda na seringa (Figura suplementar 1I; 5 ou 10 mL) para a infestação direta do coelho com ninfas.
2. Coloque a seringa profundamente a cápsula via a céu aberto de canto e inocular os carrapatos, empurrando o êmbolo da seringa. Gire lentamente o êmbolo em direção à pele de coelho para remover os carrapatos restantes anexados para o êmbolo e simultaneamente retirá-lo da cápsula (Figura 2eu).
   Nota: Se alguns dos indivíduos rastejaram para fora da cápsula, devolvê-los usando fórceps.
3. Feche a cápsula após o gancho-e-laço de fita.
4. Coloque as pernas traseiras do coelho na parte traseira elásticos cercos da jaqueta e do fecho de correr fechados.
   Nota: Certifique que um dedo pode caber entre o pescoço do casaco e o coelho para garantir o conforto e também para evitar mastigar a jaqueta.
5. Retorne o coelho para a gaiola (Figura 2J).
   Nota: O tempo de infestação para coleta de carrapatos repletos variam entre carrapato diferentes espécies e as fases do desenvolvimento. Por exemplo, para Ixodes scapularis e Ixodes ricinus, as durações de alimentação para adultos, ninfas e larvas são 6 – 9, 3-4 e 2-3 dias, respectivamente. Uma lista de referências para 29 tiquetaque duro diferentes ciclos de vida em condições de laboratório pode ser encontrada em Levin e Shumacher (2016)⁹.

4. recolha e monitorização de carrapatos

1. Tirar o coelho da gaiola para o banco e descompacte o casaco.
2. Suavemente, coibir o coelho com as mãos. Abrir a cápsula, desapertando a gancho-e-laço fita (Figura 2 K e 2L) e coletar os carrapatos de escovar as larvas ingurgitadas (Supplemental Figura 1) ou ninfas para um prato de plástico ou usar fórceps para adultos (Figura 2L ). Se parcialmente alimentados (não repleta) carrapatos são necessários, use uma twister carrapato ou fórceps para desanexá-los.
   Nota: Se a manutenção das colônias de carrapato, por favor, consulte a observação passo 3.1. Manter os carrapatos ingurgitados em apropriado úmidos e condições de temperatura, de acordo com a espécie de carrapato particular.
3. Se necessário, apertá-novamente a gancho-e-laço fita para fechar a cápsula.

5. recuperação do coelho

1. Retire completamente a malha de mosquito a cápsula e deixa o casaco no coelho (Figura 2M).
2. Esperar 3-4 semanas e tentar remover a cápsula aparando delicadamente um dos cantos (Figura 2N). Se a cápsula está ainda firmemente ligada, repita este passo uma semana mais tarde.
3. Remova o casaco e deixar que o coelho recupera na gaiola.
   Nota: Uma vez que a cápsula está desligado, verifique a pele do coelho para reações anormais. Embora normalmente nenhum tratamento é necessário, uma loção emoliente pode ser usada em caso de irritação.
4. Se o protocolo e experimentos permitem, o coelho recuperado (Figura 2O) pode ser reutilizado ou oferecido para adoção.
   Nota: Coelhos foram mostrados para adquirir resistência de carrapato, uma vez exposta a infestações de carrapato repetidas¹³; Portanto, reinfestations não são recomendados, a menos que o experimento requer.

Resultados

Aqui propomos pela primeira vez um método detalhado passo-a passo de tiquetaque duro alimentação em espuma EVA cápsulas aplicadas à traseira de um coelho raspada, coberto por uma jaqueta (Figura 1 e Figura 2). Este protocolo é apropriado para vários tipos de experimentos, quando grupos de escala diferentes no mesmo host são necessários e também podem ser usados para a criação em massa de carrapatos d...

Discussão

O passo mais importante no presente protocolo inteiro é colar a cápsula com firmeza para a pele depilada. Por esta razão, pressão constante pelo menos 3 minutos é crítica, especialmente nos cantos. Quando vacinar os carrapatos na cápsula, é importante aplicá-los profundamente no canto oposto do aberto para evitar a fuga de carrapato durante a selagem. Quando o planejamento de experimentos, certifique-se de que todas as cápsulas são cobertas pelo casaco para evitar danos por mastigar ou coçar. Certifique-se qu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
New Zealand Rabbits (2.5-3.5 kg)	Charles River	Strain Code 571
Rambouillet sheep	Local provider-tick free farm	Female 6 months old
EVA foam 5 mm thick	Cosplay Shop	EVA-PE451kg (950mm x 450mm)	10 mm PE45kg foam from the Cosplay Shop may be used for the large adult tick species
Foam Sheet 9" X 12" 6 mm-White	Amazon	FOAMSHT6-20	6 mm-EVA foam ca be ordered via Amazon as an alternative to the foam from Cosplay Shop
Full length rabbit jackets	Harvard Apparatus, Inc.	620077- medium, 6270078 - large
Non-toxic latex glue	Tear mender	Fabric & Leather Adhesive
Tubular cotton orthopedic stockinette	BSN Medical	9076 (12-15 cm wide)
Mosquito mesh	Loisirs Creatifs	Very fine filter nylon mesh fabric	Any mosquito mesh, or curtain material with the mesh size less than 50 microns is suitable.
Leukoplast	BSN medical S.A.S	LF 72361-02
Adhesive hook-and-loop tape	AIEX store	AIEX 39.37 Feet/12m Hook and Loop Self Adhesive Tape Roll, 20 mm width, white colour	Fullfiled by Amazon
Fast drying glue	Fixtout	Superglue