Универсальная модель жесткий клеща заражения на лабораторных кроликов

Резюме

Мы разработали систему простой и универсальный жесткий клещей питаются кролики лаборатории. Наши номера трудоемкий протокол использует легко доступных материалов и может быть скорректирована в зависимости от требований различных экспериментальных параметров. Метод позволяет комфортно мониторинг и/или выборки клещей в течение всего периода кормления.

Аннотация

Использование живых животных в тик исследований имеет решающее значение для целого ряда экспериментальных целей, включая поддержание твердых тик колоний в лаборатории. Клещей все этапы развития (за исключением яйцо) являются hematophagous, в приобретении крови питание при подключении к их позвоночных хозяев имеет важное значение для успешного завершения их жизненного цикла. Здесь мы показываем, простой метод, который использует легко открывающиеся капсулы для кормления жестких импульсах на кроликов. Преимущества предложенного метода включают его простоты, короткой продолжительности и самое главное универсальный адаптации к потребностям конкретных экспериментальных требований. Этот метод делает возможным использование нескольких камер (различных размеров) на том же животное, которое позволяет кормление несколько этапов или различных экспериментальных групп при одновременном снижении общей животных требование. Не раздражает и легко доступных материалов, используемых сводит к минимуму дискомфорт для животных, которые могут быть легко оправился от эксперимент и предложены для принятия или повторно, если это позволяет этические протокол.

Введение

Жесткий клещей (Иксодовые клещи) хорошо известны как медленное питание членистоногих и могут быть прикреплены на узле в течение нескольких дней, или недель, в зависимости от вида и развития этап¹. Эти обязательные hematophagous членистоногих векторы широкого спектра инфекционных агентов, таких как бактерии, простейшие и вирусы и таким образом представляют значительную опасность для людей и животных здоровье¹. При изучении биологии клеща или оценке новых методов управления, создание эффективной клеща, системы кормления решающее значение для эффективной разработки экспериментов и достичь цели исследования. Недавно несколько искусственный тик питание системы (избегая использования живых животных) были развитые^2,3,4 , и они должны быть использованы, когда это возможно. Однако эти системы не были в состоянии полностью заменить тик, питаясь живыми животными, и они не имеют подходящих заменителей для многих физиологических условий, необходимых для научных исследований. Таким образом в некоторых случаях, использование экспериментальных животных хостов имеет решающее значение для обеспечения актуальности экспериментальных результатов.

Лаборатория Новой Зеландии кроликов показали быть хозяевами наиболее подходящими и доступными для нескольких иксодовых клеща видов^5,6,,78,9. Две общие стратегии делений, питаются Кролики часто использовались:) кормления на уши кролика, покрытые хлопчатобумажной тканью или носки^6,7и b) кормления в хлопка сумки⁹, нейлон бутылки¹⁰ или неопрена палат¹¹ приклеены к кролика обратно. Питание на уши кролика не является элегантный системой, потому что клещей (особенно на ранних стадиях, личинки или нимфы) могут ползать и прикрепить глубоко в ушной канал, что неудобно для животных и делает мониторинг клеща кормления и/или восстановления наполненный клещи трудно. Эта система также ограничивается только две группы тик на уши, полностью покрываются носки, защищены елизаветинской воротники, представляющих значительный дискомфорт для животных. Другие системы^9,10,11 определенно более продвинутые и хорошо подходит для обслуживания жесткого деления колонии. Однако они ограничены в число экспериментальных групп на кролика, а также в изменяемые размеры/формы кормления палат. Кроме того эти протоколы часто требуют ковыляя задние кролик ноги, чтобы избежать царапин и использовании елизаветинской ошейников для предотвращения ухода.

Здесь мы предлагаем простой, не трудоемкий и очень эффективный метод, чтобы кормить несколько групп жестких клещей в закрытых камерах приклеены к кролика обратно охватываемых пиджак, устраняя необходимость в елизаветинской Ошейники или ковыляя во время эксперимента. В частности наша система использует упругой капсулы из этилен виниловый листа пены винилацетата (EVA) в охватываемых москитные сетки и приклеены к бритая кролика обратно клеем быстро затвердевающий (3 мин) не раздражает латекса. Эта техника позволяет вложение нескольких капсул желаемого размера или формы, и несколько недель спустя после эксперимента кроликов полностью выздоровел. Система предназначена главным образом для этапов nymphal и взрослых жесткий клеща, но с немного изменений может использоваться для личинок, а также кормления. EVA пены-методы на основе жестких тика кормления могут быть адаптированы для других видов позвоночных хозяев, например овец (которая отображается как один из вариантов в этом документе).

протокол

Примечание: В этом исследовании, кролики были сохранены в стандартные корпуса с пищей и водой предложил ad libitum на французского агентства для производства продуктов питания, окружающей среды и охраны здоровья и безопасности (НУСО) аккредитованных животных зал в Мезон-Альфор, Франция. Животные были под наблюдением дважды ежедневно два опытных техников для любой ненормальной кожные реакции, проблемы со здоровьем или осложнений. Экспериментальная комната была обеспечена путем разработки внутренних дверях с двухсторонней ленты, чтобы избежать случайного побег тиков. Этот метод лучше всего работает, если два человека работают в команде, но это возможно для завершения одной рукой на один опытный человек. Хотя большинство кроликов, послушный и спокойные, признаки стресса может произойти во время манипуляции. Чтобы убедиться, что кролик не травмировать себя, изо всех сил, может быть достигнуто ручной сдержанность, нежно, удерживая из загривок шеи в одной руке, другой его поддерживает задние четверти. Шесть месяц старый, Рамбуйе, женский овец находился в центре для биомедицинских исследований (CRBM) зал в Национальной ветеринарной школы Alfort (ENVA), где вода и еда были предоставленного ad libitum, и он был возвращен два раза в день.

Примечание: Наша лаборатория получила разрешение на использование кроликов и овец для деления, кормления, Комитет по этике для животных эксперименты ComEth АНСЕС/ENVA/УПЭК, разрешение на 01741.01 номера и 11/10/16-5B, соответственно. Так как мы использовали только возбудителя свободный клещей в наших экспериментах, все кролики, используемые в данном исследовании были предложены для принятия через белый кролик ассоциации, Париж, Франция.

1. Подготовка капсулы

1. Вырежьте нужный размер капсулы из EVA пены листа (рис. 1А). Вокруг внешнего углов (рис. 1Б) капсулы для сведения к минимуму случайных отряд при приклеивании к коже кролика.
   Примечание: Толщина рамы капсула должна быть около 8 мм. Использование листа пенопласта толщиной 5 мм для личинок, нимф и малые деления взрослых видов, таких как Ixodes. Лист пенопласта толщиной 1 см подходит для большого размера взрослых клещей Amblyomma sp., Hyalomma sp., и т.д. , когда меняется размер капсулы на основе экспериментальных требований. Например для 20 пар взрослых Ixodes , 200 нимфы или 1000 личинки, мы используем внутренний капсулы размер 5 x 5 см², 6 x 7 cm² или 7 x 9 см², соответственно.
2. Вырезать полосы шириной 8 мм Крючок самоклеющийся ленты (см. Таблицу материалы) и наклеить их на подготовленный EVA пены кадр (рис. 1C).
3. Вырезать же размер полосы из самоклеющейся цикла ленты (см. Таблицу материалы) и связать их со стороны крюк крепится к раме EVA пены (рис. 1D).
4. Вырезать соответствующий размер штрафа москитные сетки (размер ячеи менее 50 мкм) с размером кадра EVA пены и придерживаться самоклеящиеся цикла (Рисунок 1E и 1F). Вырежьте свесы, при необходимости.
   Примечание: Этот тип капсулы может использоваться кормить нимф и взрослых видов твердых тик, в то время как различные системы опломбирования капсулы необходима для личинок кормления (дополнительная цифра 1) для предотвращения случайного бежать через крепится личинок крюк и петля сторона.

2. Подготовка кролика перед клеща заражения

1. Бритье области кролик спине и боках использоваться с Клипперс (рисA).
2. Не раздражает латекса клей наносится на всю поверхность, подготовленную капсулы и подождите 1 мин (рис. 2B).
3. Клей капсулы, нажав на кожу (особенно в углах) с пальцами около 3 минут (рис. 2 c и 2D).
   Примечание: При приклеивании более чем одну капсулу, не забудьте сохранить по крайней мере 5 мм пространство между ними (рис. 2е и 2F). Мы обычно избежать область позвоночника, но он может использоваться при необходимости.
4. Слегка приподнимите капсулы визуально проверить их привязанность к коже. Если не вложенные регионы будут найдены, применять клей, с помощью шпателя и нажмите для еще 3 минуты.
5. Применять защитные ленты для задних лап кролика для предотвращения повреждения куртка (рис. 2G).
   Примечание: Этот шаг является необязательным и в основном для предотвращения повреждения куртка, не повреждения капсулы клеща.
6. Положите на кролика куртка, поместив передние ноги через отверстия и подтяжка шеи, что делает уверен кролика, дыхание остается комфортно. Не место задние ноги через эластичный корпуса на этот шаг и оставить открытой молнию (рис. 2H).

3. клеща заражения

1. Место клещей в пластиковый шприц (1 или 5 мл в зависимости от числа лиц) с конца иглы вырезать и подключено с хлопком (рис. 1G). Если небольшое количество тиков, чтобы быть заражены, используйте пинцет.
   Примечание: Тик колонии обслуживания позволяют наполненный клещ female(s) откладывают яйца с последующей штриховки внутри шприца (5 или 10 мл), охватываемых москитной сетки, завернутые на резинку¹² , чтобы избежать трудоемкой манипуляции личинок в то время они являются применяется к хост (Рисунок 1H). Кроме того, полностью наполненный личинок может быть позволено линьки в шприц (дополнительная цифра 1I; 5 или 10 мл) для прямого заражения кролика с нимфами.
2. Поместите шприц глубоко в капсуле через открытый угол и прививать клещей, нажимая на поршень шприца. Медленно твист поршень к коже кролика удалить оставшиеся клещи, придает поршень и одновременно вытяните его с капсулой(рисунок 2-я).
   Примечание: Если некоторые из лиц, выползают из капсулы, вернуть их с помощью щипцов.
3. Закройте капсулу, refastening крюк и петля ленты.
4. Поместите задние ноги кролика в задней упругой ограждения куртку и zip закрыты.
   Примечание: Убедитесь, что перст индекса может поместиться между шеи куртку и кролика для обеспечения комфорта, а также чтобы избежать жевать на куртке.
5. Возвращение кролика в клетке (Рисунок 2J).
   Примечание: Время от заражения до коллекции изобилует клещей разных видов различных клещей и стадии развития. Например для Черноногий клещ Ixodes ricinus, длительности кормления для взрослых, нимф и личинки являются 6 – 9, 3-4 и 2 – 3 дня, соответственно. Список ссылок для 29 различных твердых тик жизненных циклов в лабораторных условиях могут быть найдены в Левин и Шумахера (2016)⁹.

4. сбор и мониторинг клещей

1. Возьмите кролика от клетки к скамейке и распакуйте куртку.
2. Нежно сдерживать кролика с вашими руками. Откройте капсулу, раскрепление крюк и петля ленты (рис. 2 K и 2 Л) и собирать клещей чистки наполненный личинки (Дополнительные рис. 1) или нимфы в пластиковых блюдо или с помощью щипцов для взрослых (рис. 2L ). Если частично кормили (не изобилует) клещей не требуется, используйте клеща торнадо или щипцы для отсоединения их.
   Примечание: Если поддержание клеща колоний, пожалуйста, смотрите в примечании к пункту 3.1. Поддерживать наполненный клещей в соответствующие влажный и температурных условий в зависимости от вида конкретной клеща.
3. При необходимости, refasten ленты крюк и петля закрытия капсулы.

5. Восстановление кролика

1. Полностью удалить москитной сетки из капсулы и оставить куртку на кролика (рис. 2M).
2. Подождать 3-4 недели и попытаться удалить капсула, нежно обрезки один из углов (рис. 2N). Если по-прежнему твердо прилагается капсула, повторите этот шаг спустя одну неделю.
3. Удаление куртку и пусть восстановить кролика в клетке.
   Примечание: После того, как капсула не горит, проверьте кожи кролика для ненормальных реакций. Хотя обычно лечение не требуется, смягчающий лосьон может использоваться в случае раздражения.
4. Если протокол и экспериментов позволяют, восстановленные кролик (Рисунок 2O) может быть повторно или предложены для принятия.
   Примечание: Кролики было показано приобрести клеща сопротивления раз подвергается неоднократные клеща заражения¹³; Таким образом reinfestations не рекомендуются, если эксперимент требует.

Результаты

Здесь мы предлагаем в первый раз подробно шаг за шагом метод твердых тик кормления в EVA пены капсулы, применяется к бритая кролика обратно, охватываемых пиджак (рис. 1 и рис. 2). Этот протокол подходит для различных типов эксперим?...

Обсуждение

Наиболее важным шагом в этом весь протокол является клей капсула твердо к бритой кожи. По этой причине постоянное давление для по крайней мере 3 минут имеет решающее значение, особенно в углах. Когда прививки клещей в капсулу, важно применять их глубоко в противоположный угол от открыты?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
New Zealand Rabbits (2.5-3.5 kg)	Charles River	Strain Code 571
Rambouillet sheep	Local provider-tick free farm	Female 6 months old
EVA foam 5 mm thick	Cosplay Shop	EVA-PE451kg (950mm x 450mm)	10 mm PE45kg foam from the Cosplay Shop may be used for the large adult tick species
Foam Sheet 9" X 12" 6 mm-White	Amazon	FOAMSHT6-20	6 mm-EVA foam ca be ordered via Amazon as an alternative to the foam from Cosplay Shop
Full length rabbit jackets	Harvard Apparatus, Inc.	620077- medium, 6270078 - large
Non-toxic latex glue	Tear mender	Fabric & Leather Adhesive
Tubular cotton orthopedic stockinette	BSN Medical	9076 (12-15 cm wide)
Mosquito mesh	Loisirs Creatifs	Very fine filter nylon mesh fabric	Any mosquito mesh, or curtain material with the mesh size less than 50 microns is suitable.
Leukoplast	BSN medical S.A.S	LF 72361-02
Adhesive hook-and-loop tape	AIEX store	AIEX 39.37 Feet/12m Hook and Loop Self Adhesive Tape Roll, 20 mm width, white colour	Fullfiled by Amazon
Fast drying glue	Fixtout	Superglue