A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
אנו מציגים פרוטוקולים בזאת לבידוד לתפוקה גבוהה של פעיל מבחינה פיזיולוגית thylakoids, חלבון מבחני תחבורה עבור רוברטסונית ארגינין טווין כלורופלסט (cpTat), הפרשה (cpSec1), אות זיהוי החלקיקים (cpSRP) מסלולים.
מהכלורופלסט הן organelles בצמחים ירוקים אחראי על ביצוע מסלולים מטבוליים חיוניים רבים, ובראשם פוטוסינתזה. בתוך בתורה מהכלורופלסט, מערכת קרום תילקואיד בתים כל הפיגמנטים פוטוסינתטיים, מתחמי מרכז התגובה, ואת רוב נשאי האלקטרונים, אחראי על סינתזת ATP האור תלוי. מעל 90% של כלורופלסט חלבונים מקודד בגרעין, המתורגמת את ציטוזול, לאחר מכן לייבא לתוך כלורופלסט. תחבורה חלבון נוספת או על פני קרום תילקואיד מנצל לאחד ארבעה מסלולים טרנסלוקציה. כאן, אנו מתארים שיטה תשואה גבוהה עבור בידוד של תחבורה-מוסמך thylakoids של אפונה (אפון השדה), יחד עם תחבורה מבחני דרך שלושה תלויי-אנרגיה cpTat, cpSec1, מסלולים בתיווך cpSRP. שיטות אלה מאפשרות ניסויים הקשורים תילקואיד חלבון לוקליזציה תחבורה energetics, המנגנון של טרנסלוקציה של חלבונים על פני מחקר ביולוגי.
כמעט את כל המכונות proteinaceous אחראי לתפקוד תקין כלורופלסט חייב להיות translocated מ ה ציטוזול1. על המעטפות כלורופלסט, חלבון סובסטרטים מיובאים דרך את translocon של הממברנה החיצונית (TOC), את translocon של הממברנה הפנימית (טיק)2. המיקוד עוד יותר תילקואיד ממברנה ו לומן מתרחשת דרך טווין ארגינין טרנסלוקציה (cpTat)3, את הפרשה (cpSec1)4, אות זיהוי החלקיקים (cpSRP)5, המסלולים ההכנסה ספונטנית6 . שיטת הבידוד לתפוקה גבוהה של פעילות פיזיולוגית מהכלורופלסט וממברנות תילקואיד יש צורך למדוד את energetics ואת קינטיקה של אירוע רוברטסונית, להבין את מנגנוני ההעברה מגוונים בכל מסלול, וכדי להתאים לשפה לסובסטרט חלבון מסוים מכל ששת התאים ברורים של כלורופלסט עניין.
בידודו של ממברנות של כלורופלסט מציע כדאי ניסיוני שליטה על גורמים סביבתיים (כגון: ריכוזי מלח ואת המצע, הנוכחות של ATP/GTP, ותנאי pH) המשפיעים על המדד של תחבורה energetics, קינטיקה. סביבה זו במבחנה הוא משאיל את עצמו חקר מכניסטית בפרטי רוברטסונית מאותן סיבות. בנוסף, בעוד תוכנה חזוי עבור לוקליזציה של כלורופלסט חלבונים השתפרה7,8, in vitro לקשרי תחבורה מבחני לספק שיטה מהירה יותר עבור אישור על מבחני פלורסנט מבוסס מיקרוסקופיה דורשים תגית פלורסנט מקודדים גנטית, צמח שינוי ו/או נוגדנים ספציפיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים ומשום כלורופלסט, תילקואיד של אפונה (אפון השדה), כמו גם עבור מבחני תחבורה ממוטב עבור כל אחד המסלולים רוברטסונית תילקואיד תלויי-אנרגיה.
1. חומרים הראשונית
2. כלורופלסט בידוד, כמת
הערה: בשלב הראשון של הכנת thylakoids הוא הבידוד של מהכלורופלסט שלם10. כל החומרים צריך להישמר קר במהלך ההכנה. Resuspension של מהכלורופלסט צריך להיות מטופל בעדינות, כמו שבירה בשלב זה קשות יכול להגביל את התשואה תילקואיד עוקבות.
3. בידוד של Thylakoids
הערה: Thylakoids מוכנות על ידי פירוק היפוטוניק של מהכלורופלסט ללא פגע. זו מושגת על ידי חשיפת בתורה מהכלורופלסט למאגר היפוטוניק חסר בסורביטול. Thylakoids מבודד יכול לשמש assaying מכל המסלולים רוברטסונית, אך תמצית סטרומה (SE) צריך להיות גם מבודד במהלך ההכנה הזאת אם מסלולים או cpSec1 או cpSRP להיחקר.
4. תמצית סטרומה שחזור וריכוז
5. להעביר דרך cpTat השביל
הערה: בניגוד ' cpSec1 או cpSRP, מסלול cpTat אינה דורשת מרכיבים מסיסים או exogenously להוסיף מקורות אנרגיה; רק הכוח המניע פרוטון מונחה אור הוא הכרחי3. לכן, רק מבודדים thylakoids, המצע חלבונים דרושים עבור וזמינותו. קודמן טפסים, prOE17, prOE23, יכול גם להיות בהצלחה מועבר סובסטרטים טיפוסי הם צורות ביניים של kDa 17 (כפי שניתן לראות באיור1) ו- 23 kDa subunits של חמצן מתפתח מורכבים, iOE17, iOE23, בהתאמה. קודמן טפסים יש דו-צדדי N-מסוף מיקוד הרצף כולו, ואילו צורות ביניים יש רק את תילקואיד מיקוד רצף.
6. להעביר דרך מסלול cpSec1
הערה: לעבור translocon cpSec1 מחייבת את החלבון סטרומה cpSecA112,13, אשר יכול להיות רכש באמצעות ביטוי ב e. coli14,15 או ששוחזרו על ידי ריכוז משתית במהלך תילקואיד בידוד. מצע טיפוסי הוא יחידת משנה 33 kDa של החמצן מתפתח מורכבים (prOE33), כפי שניתן לראות באיור2.
7. הכניסה דרך cpSRP השביל
הערה: השילוב בתיווך cpSRP של אור קציר חלבונים מורכבים (LHCP) ראה באיור 3 דורשת cpSRP54, cpSRP43 ו- cpFtsY16. רכיבים אלה מסופקות התגובה התחבורה דרך סטרומה תמצית מרוכזת, כמתואר עבור פרוטוקול תעבורה cpSec1.
כדי לאמוד את כמות המצע הועברו בהצלחה, זה שימושי לכלול נתיבים "אחוז קלט" אחד או יותר. עבור הנתונים שיובאו להלן, שימש 10% התגובה תחבורה הסופי ללא thylakoids. זה "קלט אחוז" גם עוזר להמחיש את גודל המצע מבשר. האחוז מייצג סכום ידוע, הגדרה של המצע עם אשר כדי להשוות מועבר המצע נגד, וניתן לשנ?...
בידוד כלורופלסט, תילקואיד
שבירה מוגזמת עלולה לגרום ב כלורופלסט המסכן בידוד ובכך תילקואיד המסכן תשואות לאחר ההפרדה במעבר הצבע. מומלץ homogenize את הרקמה שנקטפו בעדינות על-ידי הבטחת כי כל החומר שקוע לפני המיזוג, הפועמים 15 מחזורים s ובודקים באופן מלא. אם יש צורך, להשתמש מספר סיבובים ק...
המחברים אין לחשוף.
כתב יד זה הוכן עם מימון על ידי חלוקה של מדעי הכימיה, מדעי החיים, 408 משרד האנרגיה הבסיסית, למדעי לנו מחלקת האנרגיה דרך גרנט דה-SC0017035
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 - Little Marvel | |
Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved