生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

要約

生理活性チラコイドの高収率分離のためにここのプロトコルおよび葉緑体ツイン アルギニン転流 (cpTat)、分泌 (cpSec1)、およびシグナル認識粒子 (cpSRP) のための蛋白質輸送アッセイを提案します。

要約

葉緑体は、緑色植物の多数の重要な代謝経路を運ぶための責任で細胞小器官最も特に光合成。葉緑体には、チラコイド膜システムすべての光合成色素、反応中心複合体、電子キャリアのほとんどを住宅と光依存性 ATP 合成のためあります。葉緑体タンパク質の 90% 以上は、核でエンコードされ、細胞質で翻訳、後葉緑体にインポートします。さらにタンパク質輸送やチラコイド膜は、4 つの転流経路の一つを利用しています。ここでは、3 つのエネルギー依存性 cpTat、cpSec1、および cpSRP を介した経路を介して輸送アッセイと一緒に豆 (エンドウ) からトランスポート主務チラコイドの単離のため高収率手法について述べる。これらのメソッドは、生体膜、チラコイドのタンパク質の局在、輸送エネルギーおよびタンパク質輸送のメカニズムに関する実験を有効にします。

概要

適切な葉緑体機能の責任タンパク質機械のほぼすべては細胞質¹から移行する必要があります。葉緑体エンベロープでタンパク質は、トランスロコン (TOC) の外側の膜と内膜 (TIC)²トランスロコンを通じてインポートされます。さらに、チラコイドにターゲット膜と内腔がツイン アルギニン転 (cpTat)³、分泌 (cpSec1)⁴、信号認識粒子 (cpSRP)⁵自発挿入経路^{6 を通じて行われます。}.生理活性の葉緑体のチラコイド膜高収率分離法はエネルギー論および転流イベント、各経路で多様なトランスポート機構を理解し、ローカライズの体内動態を測定するために必要な葉緑体の六つの異なる区画のいずれかに関心の特定のタンパク質基質です。

葉緑体膜の分離は、輸送エネルギーの測定に影響を与える要因 (塩と基質濃度 ATP/GTP と pH 条件の存在など) をより実験的制御を提供していて、速度論。この体外環境は同じ理由のための転流機構詳細の探査に適しています。さらに、葉緑体タンパク質の局在化の予言するソフトウェアは、^7、8をしましたが、輸送の in vitroアッセイでは、確認のため高速な方法顕微鏡蛍光アッセイ遺伝的コード化蛍光タグ、植物形質転換および/または特定の抗体が必要です。ここでは、輸送アッセイごとエネルギー依存チラコイドの転流経路の最適化のためだけでなく、エンドウ豆 (エンドウ) から葉緑体とチラコイドの隔離のためのプロトコルを提案する.

プロトコル

1. 初期の材料

1. 400 mL の水で 3 時間のエンドウ豆の約 55 g を浸漬し、その後、プラスチック製のトレイに種をまく (35 cm × 20 cm × 6 cm) 土バーミキュ ライトの薄層で覆われています。
2. 12/12 h/暗 (50 Με/m²s) サイクル 9 ~ 15 日の下 20 の ° C でエンドウ豆のトレイを成長します。
3. 推奨される方法に従ってタンパク質基板を準備します。
   注: さまざまな 1 を含む方法を使用して蛋白質の基板を用意) コムギ胚芽抽出または [³H] の存在下でウサギ網状赤血球ライセートを用いた翻訳続く精製プラスミドからの in vitro転写-ロイシンまたは [³⁵S]-メチオニン、2) TnT など結合転写/翻訳キットを使用しての in vitro翻訳キットから上記のように、カイネティックスと Promega、3)大腸菌発現タンパク質の精製。放射性の in vitro翻訳製品一般に 50 mM 冷たいアミノ酸輸送反応における使用前に癒されています。これらの各メソッドは通常各の新しい蛋白質の基質のためのいくつかの最適化を必要です。結合の in vitroシステムの例として、玲とジャービスを参照してください。 (2016)⁹。

2. 葉緑体の分離と定量

注: チラコイドの準備のために最初のステップは、無傷葉緑体¹⁰の分離です。すべての材料は、準備中に冷たい保管すべき。この手順で破損することができます以降チラコイド収量を制限して深刻な葉緑体の巻き上がりが優しく、処理必要があります。

1. 以下のソリューションを事前準備します。
   1. 研削バッファー (2xGB) x 2: 100 mM K HEPES pH 7.3, 660 mM ソルビトール、MgCl₂、2 mM 2 mM MnCl₂, 4 ミリメートルの EDTA、0.2 %bsa。
   2. インポート バッファー (2xIB) x 2: 100 mM K トリシンまたは K HEPES pH 8.0、660 mM ソルビトール、8 mM MgCl₂。
      注: MgCl₂ 3 mM から 10 mM までの濃度は、観測可能な違いなしに使用されています。
2. 連続密度勾配を準備するには、オフ、ブレーキ付け Percoll の 15 mL と 15 mL の 4 ° C で 30 分間固定角ロータで 30,900 gで 2xGB の混合物を遠心分離します。
3. 9 15 日古い豆の約 25 g を収穫し、1xGB 95 mL にホモジナイズしてください。尖った刃をミキサーまたは、ポリトロンが正常に使用されています。目標到達プロセスの Miracloth の少なくとも 2 層を介してこの混合物をフィルター処理します。
   注: 茎組織の量を制限する必要はありませんが、均質化プロセスを簡単、長時間ブレンドで発生する葉緑体破損を減らすことができます。
4. 4 ° C で 5 分間スイング バケツ ローターで 3,000 gでペレットし、1xGB の 1 つの mL で優しく再懸濁します。絵筆は、最も穏やかな再懸濁法にあります。
5. 慎重にブレーキをオフ パーコールと 4 ° C で 10 分間スイング バケツ ローターで 8,000 gで遠心分離機の上に緑の懸濁液を層します。
6. 新鮮なチューブに葉緑体を含む下の緑バンドを慎重に収穫します。4 ° C で 5 分間スイング バケツ ローターで 1,800 gで回復した葉緑体をスピン、上澄みを廃棄し、軽く 1xIB でペレットを再懸濁します。この手順を繰り返します洗ってもう一度 1xIB の 1 mL に最終的な再懸濁のたびに 1xIB 30 mL に再します。
7. 葉緑素 (クロロフィル) 含量を定量化するには、80% アセトン 5 mL、ワットマン 1 ろ紙 (公称厚さ 180 μ m) を介してフィルターを完全に再懸濁の葉緑体の 10 μ L をミックスします。720 で吸光度を記録 nm, 663 nm、および 645 nm の分光光度計¹¹次式を用いたクロロフィル濃度を計算します。
   [クロロフィル] mg/mL = [40.2* (、₆₆₃ -₇₂₀) + 101.4* (₆₄₅ -₇₂₀)] * 0.1
8. 1 mg/mL 1xIB とクロロフィル同等に葉緑体を調整します。

3. チラコイドの単離

注: チラコイドは、葉緑体の低張性換散によって準備されます。これはソルビトールを欠けている低張性バッファーに葉緑体を公開することによって達成されます。分離チラコイドは試金の転流経路のいずれかを使用ことができます、間質抽出 (SE) もあります分離この準備中 cpSec1 または cpSRP のいずれかの経路を調査する場合。

1. 次の解決策を事前に準備します。
   1. 低張性の換散バッファー: 50 ミリメートル K トリシンまたは K HEPES pH 8.0、8 mM MgCl₂。
   2. (SE の濃度) の原油の質バッファー x 2: 100 mM K HEPES pH 8.0、660 mM ソルビトール、8 mM MgCl₂。
   3. (SDS-PAGE、EDTA を添加した) の塩化物イオンとサンプル バッファー: 125 mM Tris pH 6.8, 10% SDS 20% グリセロール、0.05 mg/mL ブロモフェノール ブルー、10% β-メルカプトエタノール、10 mM EDTA。
2. 遠心分離機 4 ° C で 6 分間スイング バケツ ローターで 1,000 gで葉緑体の SE のリカバリに必要な場合
   1. 上澄みを廃棄し、1 mg/ml 低張の換散バッファーに再懸濁します。時折混合との 10 分のため暗闇の中で氷の上を孵化させなさい。
   2. 4 ° C で 8 分のバケツの回転子をスイング 3,200 gで遠心分離によってチラコイドを回復します。換散バッファーの 1 ~ 2 mL で再するたびに二回、チラコイドを洗います。1xIB 1 mL で再懸濁し、葉緑体の隔離のプロトコルの上としてクロロフィルを requantify します。

4. 間質抽出物の回復と濃度

1. SE の回復が必要な場合、無傷葉緑体を分割で 1.5 mL 容マイクロ チューブ 600 μ 因数と 4 ° C で 6 分のバケツの回転子をスイングで 1,000 gで各チューブを遠心分離
   注: このボリュームは便利な 1.5 mL 遠心管を使用するとき残留膜の最終的なペレットの妨害を防ぐことができます。
   1. 低張性の換散バッファーのクロロフィルの 1 mg/mL に再懸濁します、3.2.1 のステップのように、10 分間暗闇の中で氷の上を孵化させなさい。
   2. 4 ° C で 8 分のバケツの回転子をスイングで 3,200 x gで各チューブを遠心分離し、光緑または黄色清次葉緑体換散を粗質バッファー x 2 の等量と新しい微量遠心チューブに転送します。
   3. (0.5 mg/mL の近似) 換散バッファーの 2 つの容積とチラコイドを洗って、4 ° C で 8 分のバケツの回転子をスイング 3,200 gでの遠心分離によって収集1xIB 氷の上でクロロフィルの 1 mg/mL に再懸濁します。
   4. 42,000 g残留膜を削除する 4 ° C で 30 分間固定角ロータで原油の質を遠心します。外側と内側のエンベロープ蛋白の免疫ブロットは、上澄みの純度を確認する使用できます。
   5. 黄緑色の小球を乱すことがなく、各チューブから量の 95% を収集します。各チューブからボリュームに注意してください。
   6. 集中して間質の抽出 (SE) を準備するには、収集した培養上清をプール、5 倍 4 mL 30 kDa MWCO コンセントレーターを使っても集中。
      注意: この方法で用意する SE、2.5 mg/mL 海域で葉緑体由来間質に相当必要に応じて、SE が 5 mg/mL クロロフィル同等物を 10 倍濃縮することができます。SE は黄金色と粘性になります。バケツの回転子を揺動ラボの伝説 RT 遠心分離機に集中して mL あたり約 10 分が必要です。

5. cpTat 経路を通る輸送します。

注: とは異なり、cpSec1 または cpSRP、cpTat 経路水溶性成分を必要としないまたは外因エネルギー源を追加光駆動プロトン動機力だけは必要な³です。したがって、のみ分離チラコイドと基質のタンパク質は、アッセイに必要です。典型的な基板は、それぞれ、(図 1で見られる)、17 kDa の中間フォームと酸素、iOE17、iOE23、23 kDa サブユニットが、前駆体フォーム、prOE17、prOE23、また正常に転送できます。前駆体フォーム中間フォームがターゲット シーケンス チラコイドだけ二部 N ターミナル ターゲット シーケンス全体があります。

1. クロロフィル チラコイド、1xIB と 1xIB、氷の上で準備在庫から 8 mM ジチオトレイトール (DTT) 準備在庫から 5 mM ATP cpTat トランスポート混ぜ 0.33 mg/mL を準備します。照明の下で実施される場合、ATP はこの反作用のため厳密には必要ありません。
2. 1:30 を導入することによる開始の輸送によってボリューム輸送基質タンパク質ミックスします。基質タンパク質は、1xIB の準備ができていない場合は、1:1 希釈 2xIB 最初を使用して 1:30 ボリュームによって希薄化後の基板のトランスポート ミックスでを準備します。
   注: 基板の濃度調製法に基づいて異なります。通常、体外の準備は、マイクロモル金額にナノモル過剰発現は、マイクロモル millimolar 量にしながら。検出方法はまた、放射線写真法と透視が免疫ブロットより敏感考慮されなければなりません。
3. 室温で 10 分間の光合成有効放射 (PAR) の 80-100 Με/m²s のサスペンションを照らします。輸送速度が必要な場合あらかじめ室温にチラコイドと反応の両方のミックスを平衡し、最大で 30 分間点灯します。
4. 冷たい 1xIB の 8 希釈で輸送反応を停止し、4 ° C で 5 分間遠心で 3,200 gでの遠心分離によってチラコイドを回復
5. 運ばれていない残留の基板を取り外して 1xIB の 120 μ L でチラコイド ペレットを再懸濁します 2 mg/mL サーモライシンと 10 mM CaCl₂ 1xIB で 6 μ L 添加による外部のタンパク質を消化します。
6. 40 分間氷の上プロテアーゼ反応を孵化し、25 mM 1xIB で準備 EDTA を使用してボリュームを倍にして、プロテアーゼを消します。
7. 3,200 g 4 ° C で 5 分間遠心機で遠心分離によってチラコイドを回復します。1xIB、新しい管への転送 5 mM EDTA の 120 μ L で回復したチラコイドを洗浄します。
8. 3,200 g 4 ° C で 5 分間遠心機で遠心します。10 mM EDTA を添加した塩化物イオン サンプル バッファーの適切なボリュームで再懸濁します。40 μ L のボリュームは通常は十分に SDS ページのゲルの基板を検出し、繰り返しゲルの必要があるときにサンプルを節約できます。
9. 10 分の沸騰水のお風呂でサンプルを置き、SDS-PAGE により分析します。放射線写真法、透視、または非ネイティブまたはタグ付きのエピトープの蛋白質の西部のしみは、輸送タンパク質の検出のため正常に使用されています。

6. cpSec1 経路を通る輸送します。

注: cpSec1 トランスロコンを通じてトランスポート間質蛋白 cpSecA1^12,13、エシェリヒア属大腸菌^14,15の過剰発現による調達または間質を集中することによって回復できるが必要です。中にチラコイドの分離。典型的な基板は、図 2に見られるように複雑な進化する酸素 (prOE33) の 33 kDa のサブユニットです。

1. クロロフィル チラコイド、0.83 mg/mL クロロフィル相当 SE または組換え cpSecA1 と 5 mM 氷上では、ATP の 1.5 μ g cpSec1 トランスポート混ぜ 0.33 mg/mL を準備し、10 分間インキュベートします。典型的な輸送反応混合物ここは SE 添加による 60 μ L から最大 72 μ L です。
   1. SE ではなく遺伝子組換え cpSecA1 を使用する場合 2xIB の等量と精製 cpSecA1 を調整し、輸送反応 (例えば0.75 μ g/μ L) に追加する便利な濃度に希釈します。
      注: の長期的なストレージ、cpSecA1 に格納されます制御、冷凍室の氷として精製後凍結廃止活動。
2. 1:10 の導入による輸送を開始ボリュームによって輸送基質タンパク質を混ぜます。基質タンパク質は 1xIB の準備ができていない、2xIB と 1:1 希釈を準備し、トランスポート ミックスに 1:10 ボリュームによって希薄蛋白質を追加します。
3. 下で 10 分間室温で反応をインキュベート 80-100 Με/m²のパー。また、長い時間速度または特定の基板の必要があります。
4. 光治療後 8 倍希釈 4 ° C で 5 分間遠心で 3200 gで 1xIB と遠心の冷たい反応
5. サーモライシンと扱うし、5.7 を介して手順 5.5 上として EDTA を消します。
6. 4 ° C で 5 分間遠心で 3,200 gで遠心し、10 mM EDTA を添加した塩化物イオン サンプル バッファーの適切なボリュームでペレットを再懸濁します。沸騰水浴 SDS ページのゲルにロードする前に 10 分間に配置します。

7. cpSRP 経路を介して挿入

注: cpSRP54、cpSRP43、および cpFtsY¹⁶に集光性複合タンパク質 (LHCP)図3 の cpSRP を介した統合が必要です。これらのコンポーネントは、cpSec1 トランスポート プロトコルのとおり濃縮管間質エキス、を通じて輸送反応に供給されます。

1. 準備、cpSRP 0.33 mg/mL クロロフィル、0.83 mg/mL クロロフィル相当 SE と 5 mM ATP の氷の上でミックスを輸送し、10 分間インキュベートします。
2. 1:10 の導入による輸送を開始ボリュームによって輸送基質タンパク質を混ぜます。基質タンパク質は 1xIB の準備ができていない、2xIB と 1:1 希釈を準備し、トランスポート ミックスに 1:10 ボリュームによって希薄蛋白質を追加します。
3. 80-100 Με/m²のパーで 10 分間室温で反応を孵化させなさい。
4. 光治療後 8 倍希釈 4 ° C で 5 分間遠心で 3,200 gで冷たい 1xIB と遠心分離機の反応上澄みを廃棄し、1xIB の 120 μ L でペレットを再懸濁します。
5. 5.5 5.7 からのセクションで上記としてサーモライシンを扱います。サーモライシン消化ここで成功した膜の統合を評価するために必要です。1xIB、新しい管への転送 5 mM EDTA の 120 μ L で回復したチラコイドを洗浄します。
6. 4 ° C で 5 分間遠心で 3,200 gで遠心し、再び 10 mM EDTA を添加した 2 x Laemmli バッファーの適切なボリュームでペレットを再懸濁します。沸騰水浴 SDS-PAGE による分析の前に 10 分間に配置します。
   注: 成熟 LHCP (mLHCP) の統合は、プロテアーゼで保護された分解産物 (mLHCP D) の出現によって評価は約 1.5-2 kDa 分解されていない mLHCP¹⁷より小さい。

結果

正常に輸送基質の量を測定するには、1 つまたは複数の「パーセント入力」車線を含めると便利です。以下に示すデータ、最終輸送反応をせずにチラコイドの 10% 使用しています。この「% 入力」前駆体基板のサイズを視覚化することができます。割合に対して輸送比較基板、基板の知られている、定義された量を表すことができます上下にタンパク質を用意して最初?...

ディスカッション

葉緑体とチラコイドの分離

過度の破損が発生することができます貧しい葉緑体の分離そしてこうして貧しいチラコイドをグラデーションで分離後もたらします。優しくブレンドと完全に均質になるまで 15 秒サイクルでパルスの前にすべての材料を浸漬を確保することによって収穫された組織を均質化することをお勧めします。必要に応じて、各ラウンドで以下の組織とブ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pisum sativum seeds	Seedway LLC, Hall, NY	8686 - Little Marvel
Miracloth	Calbiochem, Gibbstown, NJ	475855-1
80% Acetone	Sigma, Saint Louis, MO	67-64-1
Blender with sharpened blades	Waring Commercial	BB155S
Polytron 10-35	Fischer Sci	13-874-617
Percoll	Sigma, Saint Louis, MO	GE17-0891-01
Beckman J2-MC with JA 20 rotor	Beckman-Coulter	8043-30-1180
Sorvall RC-5B with HB-4 rotor	Sorvall	8327-30-1016
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB	Sigma, Saint Louis, MO	12/3/83	Can be frozen in aliquots for future use
200 mM MgATP in 1xIB	Sigma, Saint Louis, MO	74804-12-9	Can be frozen in aliquots for future use
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)	Sigma, Saint Louis, MO	9073-78-3	Can be frozen in aliquots for future use
HEPES	Sigma, Saint Louis, MO	H3375
K-Tricine	Sigma, Saint Louis, MO	T0377
Sorbitol	Sigma, Saint Louis, MO	50-70-4
Magnesium Chloride	Sigma, Saint Louis, MO	7791-18-6
Manganese Chloride	Sigma, Saint Louis, MO	13446-34-9
EDTA	Sigma, Saint Louis, MO	60-00-4
BSA	Sigma, Saint Louis, MO	9048-46-8
Tris	Sigma, Saint Louis, MO	77-86-1
SDS	Sigma, Saint Louis, MO	151-21-3
Glycerol	Sigma, Saint Louis, MO	56-81-5
Bromophenol Blue	Sigma, Saint Louis, MO	115-39-9
B-Mercaptoethanol	Sigma, Saint Louis, MO	60-24-2