JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מספקים זרימת עבודה המאפשר זיהוי תאים בריאים ופתולוגיים בהתבסס על צורתם תלת-ממדי. אנו מתארים תהליך השימוש מתאר הקרנה 2D מבוססת על משטחים 3D לאמן מפה העצמי אשר יספקו קיבוץ באשכולות אובייקטיבית של אוכלוסיות תאים ובדוקים.

Abstract

את המראה ואת התנועות של תאים חיסוניים מונעים על ידי הסביבה שלהם. כתגובה לפלישה הפתוגן תאים חיסוניים גייסו לאתר של דלקת, מופעלים כדי למנוע מריחה נוספת של הפלישה. זה משתקף גם על-ידי שינוי אופן הפעולה ואת המראה מורפולוגי של תאים חיסוניים. ברקמה סרטנית, נצפו שינויים morphokinetic דומים בהתנהגותם של תאים microglial: מיקרוגלייה אינטרה-tumoral יש פחות מורכב צורות תלת-ממדי, נתקל קנים פחות תהליכים תאיים, ולעבור במהירות רבה יותר מאשר אלה בריא רקמות. בחינת מאפייני morphokinetic כזו דורשת טכניקות במיקרוסקופ תלת-ממדית מורכבת, אשר יכול להיות מאתגר ביותר בעת ביצוע longitudinally. לכן, ההקלטה של צורה תלת-ממדית סטטי של תא הוא הרבה יותר פשוט, כי זה אינו דורש מדידות intravital ולא ניתן לבצע רקמת נכרת גם כן. עם זאת, הוא חיוני להחזיק כלי ניתוח המאפשרים את תיאור מהיר ומדויק של צורות תלת-ממד ומאפשר את הסיווג אבחון של דגימות רקמה פתוגניים ובריאה על סמך מידע סטטי, הקשורות צורה. כאן, אנו מציגים את ערכת כלים מנתח את הרכיבים פורייה בדידה של החלוקה לרמות של קבוצת בהקרנת 2D 3D תא משטחים באמצעות מפות העצמי. היישום של שיטות בינה מלאכותית מאפשרת המסגרת שלנו ללמוד על צורות שונות של תא, כאשר היא חלה על דגימות רקמה יותר ויותר, בעוד שזרימת העבודה נשאר פשוט.

Introduction

נחישות בזמן, פשוט ומדויק על מצב פתולוגי של רקמה ביולוגית היא של הריבית הגבוהה ביותר במחקר ביו-רפואי. העכבר מודלים מספקים את האמצעים ללמוד מגוון של מצבים פתולוגיים, כמו החיסון תגובות או התפתחות סרטן, בשילוב עם 3D מורכבים וטכניקות מיקרוסקופ D 4 (3 ממדים מרחביים וזמן). מחקרים מיקרוסקופ ניתן שבוצעו באמצעות intravital או רקמות טוחנות פוטון 2 מיקרוסקופ, מיקרוסקופ אור גיליונות, ולעומק ברקמות מוגבלת של 100 מיקרומטר-מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית. על מנת לקבל מידע הקשור לזמן על התנהגות התאים בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגית, יש צורך לנטר את הרקמה לתקופה ממושכת של זמן, אשר בדרך כלל דורשת intravital1,הדמיה2 . באופן טבעי, תחולתה של טכניקה זו מוגבלת מודלים בעלי חיים בגלל invasiveness שלה. טכניקות פולשני זמינים גם עבור יישומים האנושי, כולל מגוון שיטות טומוגרפיה ממוחשבת (MSOT, CT, וכו '), אך כל השיטות שאין צורך מרחבית - והרזולוציה לעיתים קרובות הטמפורלי-ללמוד התנהגות ברמה התאית.

מידע סטטי לגבי המראה של תאים עשויים להיות נגישים בקלות רבה יותר באמצעות 3D שונים בטכניקות הדמיה להורג ב טוחנות דגימות רקמה. . כאן, התנהגות קינטי של התאים לא נמדד, ולכן יש צורך לאמץ טכניקות ניתוח הרומן כי הם מסוגלים לקבוע את מצב פתוגניים של התאים שנבדקו על סמך שלהם מורפולוגיה3. גישה כזו שימשה לקשר התנהגות פתולוגית-4,-5,-6תאים צורות ומרקמים רקמות.

בשיטה החדשה המתוארים כאן, התאים משוחזרים כמו משטחים תלת-ממד, הצורה שלהם מאופיין באמצעות 3D-כדי-2D הקרנות הינם רצופים מבוססי פורייה הפריפריה-צורה ניתוח7,8. על-ידי הפחתת הממדים בין 3 ל- 2, הבעיה היא פשוטה. זה גם אפשרי לאפיין את המשטחים תא תלת-ממד על-ידי החלת ניתוח הרמוניות, כפי שנהגו לעשות תמונות רפואיות9. עם זאת, הרמוניות לא מסתדר עם צורות חדות מחוספס, הדורשים רשת מידה מרובה שתוקם על פני הספרה יחידה. בנוסף, מספר רכיבים הדרושים הרמוניות יכול להיות גדול (50-70), עם החישובים שבבסיס מאוד תובעניים ואת התוצאות קשה לפרש10,11,12.

בשיטה שלנו החדש המוצע, הפעילות מצטמצמת לסדרה של צורה דו-ממדית תיאורים, איפה המספר של ההקרנות 2D עד באנליסט, ניתן להתאים בהתאם למורכבותו של הצורה התלת-ממדית. ההשתקפויות נוצרות אוטומטית באמצעות קובץ script פיתון הפועל בתוך כלי אנימציה תלת מימדית. ההשתקפויות 2D מתוארים על ידי הרכיבים שינוי צורה (DFT) פורייה בדידה של הפריפריה שלהם, מחושב על ידי תוסף13 פיג'י זה מסופק כאן כחלק מחבילת התוכנה שלנו. DFT חלה כאן על מנת לפרק את קווי המתאר מורכבת של התא לתוך סדרה של פונקציות חטא ו- cos. בדרך זו, אנו יכולים לתאר את קווי המתאר עם מספר קטן יחסית של רכיבים DFT, ובכך להקטין את המורכבות של הבעיה (עבור עוד פרטים ראו סעיף משוואות). הרכיבים DFT מוכנסים לתוך מפת העצמי מיומן (סום14), איפה קיומה של צורה אשכולות יכול להיות אובייקטיבי נבדקו8. ל- SOMs לספק כלי למידה מודרכת ולמידה תחרותי מהשדה של בינה מלאכותית. הם מורכבים של מערך מקושר של נוירונים מלאכותיים אשר מתקשרים אחד עם השני באמצעות הפונקציה מרחק השכונה משוקלל. המערכת העצבית מגיב האלמנט הראשון ערכת הנתונים קלט, הנוירונים תגובה של מי הוא החזק ביותר "קיבוץ" קרוב אחד לשני. מערכת עצבית מקבל יותר ויותר קלט, נוירונים נתונים שוב ושוב להגיב בחריפות להתחיל להקים אשכול מוגדרת היטב בתוך המערכת. לאחר הכשרה מתאימה ב- dataset גדול המכיל מידע צורה דו-ממדית בצורה של קבוצה של רכיבים DFT, DFT רכיבים כל תא בודד ניתן להכניס ה-SOM מיומן ולחשוף אם התא סביר שייך בריא או קבוצת תאים פתוגניים. אנו מצפים כלי כה להיות תוספת נהדרת לשיטות של אבחון מדעית וקלינית.

Protocol

1. פרוטוקול דרישות

  1. להשיג נתונים ברזולוציה גבוהה deconvolved תלת מימד (3D) מיקרוסקופיה deconvolved תואם קריטריון נייקוויסט עם מרווח הדגימה לפחות פעמיים את תדירות מרחבית הגבוהה של הדגימה כדי לקבל תמונה ברזולוציה גבוהה.
  2. השתמש תוכנת עיבוד תלת-ממד עבור משטח ושיפוץ ייצוא.
  3. להשתמש תוכנת אנימציה תלת מימדית יכול להריץ סקריפטים פייתון (ניתן להוריד את התסריט פיתון מהמאגר github: https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) כדי ליצור תחזיות 2D.
  4. השתמש פיג'י13 כדי לנתח את התחזיות 2D ולחלץ את הרכיבים DFT.
    1. השתמש ההתפלגות פיג'י הנוכחי. אם כבר קיימת גירסה מותקנת של פיג'י, ודא כי הגירסה המותקנת היא האחרונה. אפשר להשיג בקלות על-ידי הפעלת של עזור | אפשרות עדכון .
    2. השתמש את מתאר פעיל תוסף15, אשר ניתן להוריד מאתר http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start, צריך להיות מועתקים אל התיקיה תוספים.
    3. להוריד את התוסף פיג'י צל מן המאגר github העתקה לתוך תיקיית התוספים.
  5. השתמש בתוכנת מתמטיקה חישובית מסוגל לחשב מפות העצמי.

2. לשחזר את תמונת התלת-ממד.

הערה: לצורך בדיקה, dataset דוגמה מסופק במאגר github (ראה לעיל).

  1. הפעל את תוכנת שחזור תלת-ממד ופתח את נתוני תמונה תלת-ממדית.
  2. יצירת משטח תלת-ממד של אובייקטים (הכל).
    1. בחר באפשרות תצוגת תלת-ממד ולחצו על משטחים. לחץ על הלחצן ' הבא ' (העיגול הכחול עם משולש לבן) כדי להמשיך אשף יצירת משטח.
    2. בחרו בערוץ תמונה של פני שטח הבנייה מחדש.
    3. החלת פונקציה החלקת להימנע משטחים נקבוביים.
      1. בחר ערך החלקת אינו מסתיר את הפרטים של פני השטח, אך מונע משטחים נקבוביים.
    4. בחר שיטת קביעת סף כדי למצוא את המשטחים.
      1. השתמש על הסף אינטנסיביות מוחלטת כאשר האובייקטים היטב מופרד מהרקע, יש רמת בהירות כ אחיד.
      2. החל סף ניגודיות מקומי כאשר האובייקטים משתנות בעוצמתן, אך עדיין ניתן להפריד את הרקע המקומי ומן האובייקטים האחרים הסובבים אותם. להגדיר את שטח החיפוש המקומי הסף לפי הערך של הקוטר הצפוי של האובייקטים המשוחזרת.
    5. לסנן את המשטחים המשוחזרת לפי הפרמטרים מורפולוגי של עניין, למשל, אמצעי אחסון, sphericity, יחס השטח-כדי-נפח, וכו ', ולסיים את השחזור משטח.
  3. שמור וייצא את המשטחים שנוצר בתבנית התואמת תוכנת אנימציה תלת מימדית אשר ישמש בשלב הבא.

3. שינוי צורה 3D שיחזר משטחים לתחזיות 2D

  1. להפעיל את הבלנדר, עבור אל הכרטיסיה פלט לחלון צד ימין. בחר תבנית TIFF מהתפריט הנפתח ולהגדיר את עומק הצבע ל- 8 סיביות RGBA.
  2. לעבור למצב Scripting, פתח את קובץ ה-script שסופק "GUI_AutoRotate.py" מהמאגר סיפק עבודה זו (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis).
  3. לחץ על להפעיל Script. בחר את תיקיית הקבצים המירוצים העולמית כאשר תתבקש לעשות זאת עבור קלט.
  4. במידת הצורך, יצירת סיבובים יותר בעת עבודה עם משטחים מורכבים יותר: ללכת GUI והגדר את תיבת סבבים לערך מעל 6.
    הערה: סיבוב של זוויות שונות 6 יכול להיות מספיקה כדי להבחין את אוכלוסיות תאים שונים. לא מומלץ ליצור פחות מ-6 סיבובים לכל השטח, בגלל אובדן מידע פוטנציאלי.
  5. הפעל את ה-script על-ידי לחיצה על לחצן סובב ב- GUI. שמור ההשתקפויות של משטחים נפרדים באותה תיקיה בה שימש את התיקיה קלט (שלב 2.3). כברירת מחדל, התמונות נשמרות 8 קצת Tiff לעצב (ראה שלב 2.1), אשר הוא הפורמט הנדרש על-ידי תוסף פיג'י צל.

4. מצא הפריפריה ולחשב את הרכיבים פורייה באמצעות פיג'י.

  1. פתח פיג'י ובחר בצל בתפריט תוספים. להתחיל עם ערכי ברירת המחדל, לכוונן את הפרמטרים בהמשך. לחץ על אישור כאשר מוכן להפעיל את התוכנית.
    1. בחר ערך הסף הדרגתיות עבור סף של תמונת הקלט.
    2. בחר את מספר האיטרציות המירבי. המספר של איטראציות ככל שהערך גבוה יותר, מדויק יותר השחזור של הפריפריה. לקבלת צורות פשוטות יותר, מספר נמוך מספיקה בדרך כלל.
    3. השתמש בפרמטר מספר של Dilations כדי לקבוע עד כמה גדול המסכה המוצא לעומת התא בפועל. בדרך כלל צורות מורכבות יותר צריך עוד צעדים התארכות ממצא תקין הפריפריה.
    4. סמן את תיבת הסימון של רקע כהה אם הצורות המוקרנת בהירים יותר הרקע.
    5. להפעיל את תיבת הסימון הצג תוצאות ביניים רק בעת שימוש dataset מבחן קטן כדי לקבוע את הביצועים בצל. הפעלת אפשרות זו עבור datasets גדול מוריד את היעילות חישובית, ואולי יכול לעצור את מערכת עם זיכרון וידאו נמוכה.
    6. בדוק את תיבת הסימון שמור טבלאות תוצאה להשתמש בתוצאות בצל כקלט עבור שלב 5. אם התיבה מסומנת, כל התוצאות נשמרות קבצי csv בודדים. סיכום של נתוני הפלט מופק תמיד בקובץ ששמו "Result_collection_of_all_DFT_calculations.csv".
  2. בחר את התיקיה נתוני הקלט המכילה את קבצי TIFF שנוצרו בשלב 3.
  3. לספק את תיקיית הפלט של נתונים.
  4. לחץ על אישור כדי להפעיל את התוסף.

5. ארגון-עצמי מפות

הערה: רשתות סום מסוגלים רק לסיווג הנתונים כאשר הם מאומנים על מערכת נתונים גדולה אשר מכיל קלט מהמשתמש כל סוגי תאים הצפוי ותנאים. למטרות הדגמה, כזה dataset הינה מסופקת, ניתן למצוא במאגר שלנו ("AllCells_summary_normalised.csv" מ https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis

  1. פעל לפי ההנחיות הבאות אם יש אין סום מיומן זמין עדיין עבור נתוני הקלט; אחרת המשך לשלב 5.2.
    1. הפעל תוכנת מתמטי חישובית המסוגלים לבצע סיווגים רשת עצבית.
    2. בחר קובץ נתונים שישמש עבור הדרכה ברשת סום. זה הנתונים (dataset) צריך להכיל כל התנאים ניסיוני להכשיר ה-SOM על סוגי לתא מסוים ותנאים ניסיוני.
      הערה: זה גם ניתן להשתמש AllCells_summary_normalised.csv סיפקה לבדיקת המערכת.
    3. להתחיל. את האימון ולא לחכות עד ההכשרה הושלמה לפני שתמשיך. כברירת מחדל, קובץ ה-script מוגדר לפעול איטראציות 2000 ("תקופות").
      הערה: מספר האיטראציות תלוי קצב למידה משתמשת בהתאם לנתוני קלט זה רצוי לבדוק מספר שהשרתים גבוהות ונמוכות ולבחון את היציבות של דפוס משתמשת בעת שימוש ה-script מסופקים, ניתן לשנות את מספר האיטראציות תחת קו 32. ניתן לשנות את גודל הרשת בשורה 34 (כברירת מחדל שזה מוגדר כ- 12-12).
    4. לאחר סיום ההכשרה, לבחון את הטופולוגיה של הרשת (שכן מרחקים, מטוסים קלט, דוגמת להיטים, וכו '). הרשת שאומן כעת ולא ניתן לשמור לשימוש עתידי.
  2. לטעון בה-SOM, בעת שימוש במפת כבר מיומן (זה יכול לצאת מ- 5.1 שלב או ממקורות אחרים) על מנת אשכול dataset.
    1. ייבוא קובץ ה-csv כדי להיבדק עם משתמשת מיומן שנטענו מראש בחר את הפלט csv של התוסף צל משלב 4 באמצעות נתונים שהוכנו על ידי תוסף צל.
      הערה: זה גם ניתן להשתמש בדוגמה שקבצי הנתונים "InteractingCells_summary_normalised.csv", "MobileCells_summary_normalised.csv" או "PhagocytosingCells_summary_normalised.csv" הינם מסופקים באמצעות github.
    2. לאחר הסיווג, הערכת התוצאות של ה-SOM כמו שלב 5.1.5.
      1. לבחון את hitmap שנוצר מתוך קובץ ה-csv. כל תא של המפה מראה כמה פעמים את ערכת הנתונים "להיטים" תא מסוים זה של משתמשת מיומן כאשר קבוצה של תאים מקובצים באזור קטן של המפה הזו, זה מציין ערכת הנתונים היא הומוגנית למדי. אשכולות מרובים יציין כי קבוצות סביר קיים ב- dataset.
      2. לבחון את המרחקים משקל של השכונה. אזורים של המפה הזו מופרדים היטב להתאים קבוצות של אובייקטים המתנהגים בצורה מאוד שונה מנקודת המבט של ה-SOM. עם רכיבים DFT כמו נתוני הקלט, משמעות הדבר היא שיש קבוצות תאים אלה צורות מאוד שונה של משטחים תלת-ממד תואם.
      3. לבחון את המטוסים משקל למידע על התרומה על ידי כל רכיב של וקטור תכונה. במקרה של שימוש הרכיבים DFT 20 כפי שהוסבר קודם, מפות 19 יופיע כאן. בעת שימוש את ערכת הנתונים לדוגמה שסופקה, המטוסים משקל קודם 5 או 6 יהיה שונה, אך כולם יופיעו דומים למדי. במקרה זה ניתן להסיק שמקדם שזה יהיה מספיק כדי להשתמש ברכיבים DFT כ 7.

תוצאות

אנחנו מוחלים DFT כדי לחשב את הרכיבים העיקריים של הצורה המתאימה ההשתקפויות תא. מתארי פורייה התקבלו על-ידי החלת האלגוריתם DFT זוגות קואורדינטת ה-xy של הפריפריה מצויד של ההשלכות תא, להשיג גם הפלט של החלק AbSnake של זרימת העבודה שלנו. זוגות xycoordinate אלה יכולות להיות מטופלות כמו וקטור ערכים מתחם 2D "g":
figure-results-365

מפני נתיב "g", אנו משתמשים DFT לחישוב הספקטרום פורייה ערכים מרוכבים:
figure-results-564
בהתבסס על נוסחאות ידועים של הספקטרום פורייה בדידה, באמצעות מספר מרוכב תיוג של "g" כמו:
figure-results-723
אנחנו מקבלים:
figure-results-809(1)
אפשר לחשב ה-אמת ("A") ורכיבי ("B") הדמיוני של figure-results-936 :
figure-results-1013(2)
figure-results-1094(3)
. כאן, רכיב G הראשון DFT0 מקביל m = 0, אשר נותן:
figure-results-1238(4)
figure-results-1319(5)
כתוצאה מכך, רכיב זה מתאר למרכז גיאומטרי של האובייקט המקורי.
הרכיב השני של הספקטרום קדימה DFT, דור1, מקביל m = 1:
figure-results-1530
figure-results-1601(6)

Eq.6 נוכל להסיק כי נקודות אלה יוצרות עיגול עם רדיוס של figure-results-1797 והזווית ההתחלה figure-results-1880 , היכן המעגל מתאר אחת מלאה המהפכה כאשר שהצורה נמצא במעקב פעם אחת. במרכז המעגל, הינו ממוקם על המקור (0, 0), הרדיוס הוא | G1| נקודת המוצא היא:

figure-results-2167figure-results-2234(7)

באופן כללי, עבור מקדם פורייה יחיד figure-results-2409 , מתוארים את נקודות הציון:

figure-results-2571
figure-results-2642(8)

בדומה ל Eq.6, Eq.8 גם מתאר מעגל, אבל עם רדיוס Rm= | Gm|, זווית הפתיחה figure-results-2875 , נקודת התחלה בבית figure-results-2962 , איפה קווי המתאר נמצא במעקב פעם תוך העיגול עובר דרך "m" מסלולים מלאה16,17.

הצורה פרמטרים כקלט סום
זרימת העבודה, כמתואר באיור 1, היה מוחל על deconvolved (באמצעות פונקציה נמדד התפשטות נקודה) מיקרוסקופיה פוטון מרובה intravital dataset של תאים microglial לאפיין שלהם שינויים מורפולוגיים בריא או סרטניים בקליפת המוח רקמה18. רכיבים DFT עשרים חושבו עבור כל הקרנה 2D של משטחים 3D המשוחזרת, התוצאות שימשו קלט עבור ההכשרה סום. בתנאים פיזיולוגיים, הציג מיקרוגלייה צורה מורכבת למדי עם מספר מאוד הקנים תהליכים (איור 2 א). כאשר הם ממוקמים בסביבה סרטניים (מודל הגידול בקליפת המוח), מיקרוגלייה שינתה צורה פשוטה יותר, יותר כמו צירים (איור 2b).

ה-SOM מיומן נבחנה על מנת להעריך את יכולתו להבחין בין תאים בריאים סרטניים. האוכלוסייה תא בריא היה מוקרן על גבי אזור יחיד של ה-SOM (איור 2 c). ה-SOM הגיב לערכת מיקרוגלייה סרטניים עם אזור פעיל בצורת המשקולת (איור דו-ממדי). ערכת נתונים קלט מעורב בצורה עיוורת זה כללה DFT צורה הרכיבים הבריאים והן הקבוצה סרטניים היה מוקרן על ידי ה-SOM לשתי קבוצות נפרדות, תוך שמירה על הצורה של קווי בודדים שלהם דומים לאלו של קבוצות נפרדות ( איור 2e; להשוות עם 2 c ו- 2d.) ניתן להסיק שמקדם ערכת הנתונים מעורב היה התקבצו בהצלחה על ידי משתמשת

בדקנו את הביצועים של ה-SOM על-ידי השוואת תחזיות שלו עם הניתוח ידנית של אותם נתונים על ידי מומחה רפואי, אשר מסווגים את ערכת הנתונים בהתבסס על התנהגותם-עתיים. המומחה זיהה קבוצות תאים נפרדים ארבע (resting תאים תאים phagocytosing, שמעצבת תאים, התאים ניידים18), אשר היו משוחזרות, היינו מתאמנים עם 12 x 12. תודה הרשת מיומן (איור 3 א) מציגה קבוצות של נוירונים מלאכותית גבוהה להיט-ערך, במיוחד ב בפינה השמאלית התחתונה ואזורי האמצעי של משתמשת התגובה של הרשת מיומן נבדקה גם יחד עם ארבעה שנבחרו באקראי קבוצות משנה (אשר לא היו חלק ערכת הנתונים הדרכה) של תמונות מתוך ארבע קבוצות שונות המזוהה על-ידי מומחה18. קבוצות אלה תמונה משנה הביאו ארבע תשובות מוגדרים היטב על-ידי ה-SOM, כפי שמוצג באיור 3b. התאים resting התערוכה הצורה המורכבים ביותר והראו ההפרדה הגבוהה ביותר בתוך הרשת העצבית (איור 3b "נח" לוח). שלושה סוגי תא מזוהה האחרים משותף אזור משותף של ה-SOM בפינה השמאלית התחתונה, אבל אחרת היו מופרדים על ידי משתמשת בפינה השמאלית התחתונה באזור סום ובכך מקביל הערכים DFT התחתונה-index.

החוסן של הגישה סום נבדקה באמצעות ה-SOM מיומן עם שלוש קבוצות משנה אקראית של אותו - נח - תא סוג (לא חלק ערכת הנתונים הדרכה). תגובת ה-SOM זה קלט מוצגים תגובה דומה מאוד (איור 3 c, קבוצות משנה 1-3), הממחיש את היציבות של הגישה שלנו.

שינויי הצורה של התא תלויי-זמן מאופיינים בדיוק DFT
כדי לבחון את ההשפעה של שינויים תלויי-זמן של צורת התא על הרכיבים DFT, אחד עד שלושה תאים לכל תת קבוצה (ראה איור 3b) היו מסומנים עבור נקודות הזמן 13-28. איור 4 מציג DFT עשרת הראשונים מרכיבי תא ניידים (איור 4a) ואשר תא אינטראקציה (איור 4b), שורטטו כפונקציה של הזמן. התא הנייד תערוכות לצמיתות שינוי צורה (ראה וידאו משלימים 4 ב- 8), הבא לידי ביטוי על ידי משטח DFT גסים. להתפרצות משרעת DFT בשליש הראשון של מסלול הזמן עבור התא שמעצבת חופפים שינויי הצורה תא העצום ומהירה כמוצג משלים וידאו 5 ב 8.

מסלול הזמן של כל הרכיבים DFT 19 התאפיינה גם עבור אלה שני תאים בנקודות זמן נפרד שלוש במהלך המעקב של תא ניידים (איור 5a) ושל תא אינטראקציה (איור 5b). הצירים בניצב מייצגים בזאת את הזוויות סיבוב 6 ולציין כי כל התחזיות חשובים באותה מידה עבור אפיון הצורה עבור שני סוגי תאים.

figure-results-7326
איור 1. צעד אחר צעד זרימת עבודה של עיבוד נתונים כדי לזהות תאים קיבוץ באשכולות המבוססת על הצורה של תאים. משטחים משוחזר ב- 3D שימשו כקלט בבלנדר עבור הקרנות תלת-ממד-כדי-2D אוטומטית. הפריפריה של כל הקרנה היה ממוקם, הרכיבים DFT חושבו. הרכיבים שימש קלט גם אל סום מיומן ב- Matlab, או להכשיר את משתמשת חדשה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7934
באיור 2. מראה אופייני של תאים קורטיקליים מיקרוגלייה העכבר בתנאים שליטה (א), רקמה סרטנית (b) צילומי מסך של משטחים מיקרוגלייה המשוחזרת. תחזיות סום נוצרו מקבוצות שלוש דוגמאות מיקרוגלייה מאזור הקליפה העכבר: לשלוט תאים (לא tumorous) (ג), תאים סרטניים (ד), אוכלוסייה מעורבת של תאים (e). איור זה השתנה עם הרשאה8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-8573
איור 3- (א, משמאל) ארגון-עצמי מפת dataset מיקרוגלייה העכבר המורכב וקטורים התכונה קלט 768. ערכת הנתונים שימש לאמן של 12 פרק 12 רשת עצבית מלאכותית, באמצעות גאומטריה השכונה משושה, אתחול אקראי שהשרתים 2000. (, מימין) ה-SOM המתאימים קלט מטוסים של רכיבי DFT הראשון 10 (ב') את התגובות של ה-SOM מתואר ב (א), אחד אקראי VRML קובץ ערכת משנה כל מכל הסוגים התא ארבע "נייד," "אינטראקציה," "מנוחה", "phagocytic" כמו הראשון שמתואר באיור 5 של . Bayerl et al. 18. (ג) התגובה של ה-SOM אותו כמו (a, משמאל) כדי שלוש קבוצות משנה אקראית של כל הנתונים (dataset) (אשר ובכך לא היו חלק ערכת הנתונים הכשרה) "התאים resting"-סוג משטחים תלת-ממד. הדמיון בין התגובות שלוש ראויה לציון. איור זה השתנה עם הרשאה8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-9646
איור 4. (א) זמן התלות של הרכיבים DFT הראשון 10 במהלך ניסוי הדמיה intravital של העכבר מיקרוגלייה. לוח זה מציג נתונים עבור תא מסוג "תאים ניידים". ציר ה-x מתאים לנקודות זמן הניסוי ברזולוציה 60 s זמן, ציר ה-y מציגה את משרעת של רכיבי DFT ביחידות שרירותי (א"א), ואילו ציר z מתייחס הרכיב DFT מ 1 עד 10. (ב) כמו ב (א) אלא עבור תא מהתאים"אינטראקציה" הקלד. איור זה השתנה עם הרשאה8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-10351
איור 5. (א) את ההתנהגות של כל הרכיבים DFT 19 תא של הסוג "תאים ניידים" בהתחלה, באמצע, בסוף הניסוי. המספרים על ציר ה-x תואמות מזהה רכיב DFT מ 1 עד 19. ציר ה-y מציגה את משרעת רכיב DFT ביחידות שרירותי (א"א), בעוד z-ציר מסמן את שש זוויות סיבוב אקראי. (ב) כמו (א) אלא עבור תא מהתאים"אינטראקציה" הקלד. איור זה השתנה עם הרשאה8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

זיהוי מצבים פתולוגיים שעלולים באמצעות דגימות רקמה קטן, ללא פגע, יש חשיבות גבוהה. טכניקות אלה יבטיחו לתגובה בזמן המחלות הזיהומיות, אגרסיביים סוגי סרטן. התגובות קינטי, מורפולוגיים של תאים חיסוניים שונים, למשל, מיקרוגלייה ו מקרופאגים, האופייניים של התגובה החיסונית של הגוף. אמנם ברוב המקרים זה לא מעשי או אפשרי לפקח על אופן הפעולה קינטי של תאים אלה, זה די פשוט לרכוש תמונות תלת-ממדי כדי לאחזר את צורתם. בדרך כלל, תאים חיסוניים מניח צורה מורכבת רקמה בריאה ובטופס לחשבוני תחת תנאים מודלק או סרטניים18. בעוד המאפיינים תלויי-זמן של שינוי צורה כזו היה מוסיף להבנת התפתחות התגובה החיסונית, שימוש רק הצורה התלת-ממדית של נציג קבוצת תאים ניתן גם מספיקות לקבוע את טיבה בריא או פתולוגי של הרקמה.

אפיון השטח תלת-ממדי של תא אינה משימה פשוטה. היישום של הרמוניות היא דרך לייצג את משטח תלת-ממד עם מספר גדול יחסית (50-70) של רכיבים11,12. בנוסף, הקובע את הרמוניות יקר שהמפתחות; הקרנת צורות מורכבות מאוד על גבי לספרה יחידה בלתי אפשרי או קשה מאוד בשל הצורך להחיל רשתות מרובות של טוהר שונים על פני הספרה יחידה; לבסוף, הפרשנות משמעות של הספקטרום של רכיבי הרמוניות רחוקה מלהיות טריוויאלית.

בעבודתנו המובאת כאן, נחליף את המשימה הקשה של ניתוח פני שטח תלת-ממד ישירה בגישה פשוטה יותר של שימוש בהקרנת 2D השטח המקורי כדי לקבל מידע מורפולוגי מספיק כדי לזהות מצבים פיפטות. הפגנו בכל שלב של זרימת עבודה זו באמצעות מיקרוסקופ 3D נתונים מתאי מיאלואידית, בעוד מצביע בבירור כי כל השלבים היו פשוטות להשלים, המפות 2-ממדי וכתוצאה מכך היו קלים לפירוש.

באופן טבעי, הקרנה 3D-כדי-2D תוביל לאובדן מידע על המבנה של פני השטח. ב- dataset שלנו דוגמה של מיקרוגלייה במודל הגידול קורטיקלית של עכברים, זה הספיק כדי להשתמש שש זוויות בעת יצירת ההשתקפויות 2D. עם זאת, צורות מורכבות יותר, או פחות בולט שינויים מורפולוגיים עשויים לדרוש כי מספר גדול יותר של הקרנות נוצרו כדי להיות אמינה לזהות קבוצות תאים עם משתמשת מסיבה זו, הגישה שלנו נועד להיות מסוגל ליצור ולנתח כל מספר של הקרנות. פשוט על ידי בחירת מספר גבוה יותר של תחזיות עבור צורות מורכבות יותר, זה אפשרי לשנות את קנה המידה של אובדן מידע למינימום נסבל. לדוגמה, סוג התא שמעצבת דמות 4a , 4b ידרוש מספר גדול יותר של הקרנות כדי לייצג את המשטח מורכב כהלכה.

כמו כל שיטה משוער, זרימת העבודה המוצעת בזאת היה כנגדם יש התוצאות של תהליך מיון ידני מיקרוגלייה18. התוצאות שהוצגו קודם לכן אישר את המהימנות של זרימת עבודה אוטומטית. יתר על כן, זרימת העבודה הוא יעיל יותר זמן, לעומת ניתוח קונבנציונלי. המומחה הרפואי אשר מסווגים את התאים מיקרוגלייה ידנית צורך כ- 4 שבועות והניתוח של ערכת הנתונים, ואילו את זרימת העבודה שלנו צריך רק כ- 1 יום. החוסן של הגישה שלנו הוכח בבירור גם על ידי הפארמצבטית של ה-SOM מיומן לקבוצת משנה של נתונים שייך סוג התא אותו אך לא שימש הרכבת ה-SOM, כפי הצג ב- c איור 3.

אף-על-פי הגישה שלנו לקחו בחשבון מידע קינטי, בדקנו את השפעת עיתוי על ניתוח צורה מבוססת-DFT. הדוגמה הטיפוסית להתנהגות תלויי-זמן נמצא בקרב האוכלוסייה תא ניידים, איפה התרומה של הרכיבים DFT אינדקס גבוה יותר היה בבירור הנצפה, כמו באיור 4a. זה דורש תשומת לב החשיבות של ניצול מספר גבוה מספיק מרכיבים DFT בהתמודדות עם סוגי תאים שסביר להתנהג בצורה מאוד תלויי-זמן. בשל הטבע אוטומטי מהירות ביצוע גבוהה של כלי תוכנה שלנו, המספר מוגברת של הרכיבים DFT ותחזיות יגדיל את הדיוק והאמינות של התוצאות, בזמן שהם לא ניכרת יעכב את הביצועים חישובית.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

המחברים מודים בנימין קראוס על דיון פורה והתמיכה שלו. המחברים נוספת תודה רוברט גינתר שלו בסיוע מיקרוסקופ תא חי.

העבודה נתמכה על ידי סיוע כספי DFG NI1167/3-1 (ג'ימי) כדי R.N. ותמיכה Z.C., DFG פיננסיים CRC 1278 PolyTarget פרוייקט Z01 Z.C., C01 ב TRR130 R.N., SFB633, TRR130, Exc257 A.E.H., J.B.S. BfR סיפק תמיכה מגזר SFP1322-642 עבור F.L.K וא. ל.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Imaris 9.1.2, softwareBitplane, Zürich, Switzerlandv.9.1.23D image reconstruction and surface generation; this was used by us!
Blender 2.75a, softwarehttps://www.blender.org/v.2.75a3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python
Fiji /ImageJ, softwarehttps://fiji.sc/ImageJ v.1.52bOpen source multi-D image analysis toolkit
MATLABMathWorks, www.mathworks.comR2017bGeneral computational mathematical software
MATLAB Machine Learning kitMathWorks, www.mathworks.comR2017bCan only be used together with MATLAB
Fiji plugins: SHADEhttps://github.com/zcseresn/ShapeAnalysisv.1.0
Fiji plugins: ActiveContourhttp://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?
id=plugin:segmentation:active_contour:start		absnake2
ComputerAnyNASee Imaris instructions for minimum computer requirements

References

  1. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  2. Niesner, R. A., Hauser, A. E. Recent advances in dynamic intravital multi-photon microscopy. Cytometry A. 79 (10), 789-798 (2011).
  3. Ho, S. Y., et al. NeurphologyJ: an automatic neuronal morphology quantification method and its application in pharmacological discovery. BMC Bioinformatics. 12, 230(2011).
  4. Yin, Z., et al. A screen for morphological complexity identifies regulators of switch-like transitions between discrete cell shapes. Nature Cell Biology. 15 (7), 860(2013).
  5. Yu, H. Y., Lim, K. P., Xiong, S. J., Tan, L. P., Shim, W. Functional Morphometric Analysis in Cellular Behaviors: Shape and Size Matter. Advanced Healthcare Materials. 2 (9), (2013).
  6. Johnson, G. R., Buck, T. E., Sullivan, D. P., Rohde, G. K., Murphy, R. F. Joint modeling of cell and nuclear shape variation. Molecular Biology of the Cell. 26 (22), 4046-4056 (2015).
  7. Wang, S. -H., Cheng, H., Phillips, P., Zhang, Y. -D. Multiple Sclerosis Identification Based on Fractional Fourier Entropy and a Modified Jaya Algorithm. Entropy. 20 (4), 254(2018).
  8. Kriegel, F. L., et al. Cell shape characterization and classification with discrete Fourier transforms and self-organizing maps. Cytometry Part A. 93 (3), 323-333 (2017).
  9. Styner, M., et al. Framework for the Statistical Shape Analysis of Brain Structures using SPHARM-PDM. Insight Journal. (1071), 242-250 (2006).
  10. El-Baz, A., et al. 3D shape analysis for early diagnosis of malignant lung nodules. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. 14 (Pt 3), 175-182 (2011).
  11. Williams, E. L., El-Baz, A., Nitzken, M., Switala, A. E., Casanova, M. F. Spherical harmonic analysis of cortical complexity in autism and dyslexia. Translational Neuroscience. 3 (1), 36-40 (2012).
  12. Kruggel, F. Robust parametrization of brain surface meshes. Medical Image Analysis. 12 (3), 291-299 (2008).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Kohonen, T. Essentials of the self-organizing map. Neural Networks. 37, 52-65 (2013).
  15. Andrey, P., Boudier, T. Adaptive Active Contours. ImageJ user and developer conference. , Luxembourg. (2006).
  16. Burger, W., Burge, M. J. Principles of Digital Image Processing. , Springer-Verlag. (2013).
  17. Lestrel, P. E. Fourier Descriptors and their Applications in Biology. , Cambridge University Press. (2008).
  18. Bayerl, S. H., et al. Time lapse in vivo microscopy reveals distinct dynamics of microglia-tumor environment interactions-a new role for the tumor perivascular space as highway for trafficking microglia. Glia. 64 (7), 1210-1226 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1402

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved