מניפולציה אלקטרואופטיקה של מעגלים עצביים בזמן ניטור שינה/ערות מדינות עכברים

Summary

כאן, אנו מתארים שיטות של מניפולציה אלקטרואופטיקה של סוגים מסוימים של נוירונים במהלך ניטור של שינה/ערנות מדינות בעכברים, הצגת העבודה האחרונה שלנו על גרעין המיטה של מסוף הניסטריה כדוגמה.

Abstract

בשנים האחרונות, אלקטרואופטיקה היתה בשימוש נרחב בתחומים רבים של מחקר נוירודעי. במקרים רבים, opsin, כמו ערוץ הרודוסין 2 (ChR2), מבוטא על ידי וקטור וירוס בסוג מסוים של תאים עצביים בעכברים שונים של מנהלי התקנים. ההפעלה של opsins אלה מופעלת על ידי יישום של פולסים אור אשר מועברים על ידי לייזר או LED באמצעות כבלים אופטיים, ואת ההשפעה של ההפעלה היא נצפתה עם רזולוציה גבוהה מאוד. ניסויים מסוגלים לעורר בחריפות את הנוירונים תוך ניטור התנהגות או תוצאה פיזיולוגית אחרת בעכברים. אלקטרואופטיקה יכולה לאפשר אסטרטגיות שימושיות להערכת תפקוד של מעגלים עצביים בוויסות מצבי שינה/ערנות בעכברים. כאן אנו מתארים טכניקה לבדיקת ההשפעה של מניפולציה אלקטרואופטיקה של נוירונים עם זהות כימית ספציפית במהלך אלקטרונצלגרם (EEG) ו אלקטרומגנט (EMG) ניטור כדי להעריך את שלב השינה של עכברים. כדוגמה, אנו מתארים מניפולציה של הנוירונים GABAergic בגרעין המיטה של מסוף הניסטריה (BNST). הריגוש האופגנטי אקוטי של נוירונים אלה מעורר מעבר מהיר לערות כאשר מיושם במהלך שינה NREM. מניפולציה אלקטרואופטיקה יחד עם הקלטת EEG/EMG יכול להיות מיושם כדי לפענח את המעגלים העצביים כי להסדיר שינה/ערות מדינות.

Introduction

שינה חיונית לתפקוד קוגניטיבי אופטימלי. הממצאים האחרונים גם מראים כי הפרעות בשינה משויכים מגוון רחב של מחלות^1,2,3. למרות שפונקציות השינה הן עדיין לא פתורות, התקדמות משמעותית נעשתה לאחרונה בהבנת מעגלים עצביים ומנגנונים השולטים שינה/ערנות מדינות⁴. ביונקים, ישנם שלושה מצבי דריכות: ערות, התנועה לא מהירה העין (NREM) לישון, ואת העין מהירה תנועה (REM) לישון. ערות מאופיין בתנודות מהירות של EEG (5-12 Hz) של משרעת נמוכה עם פעילות מוטורית מהירה ומתמשכת. שינה NREM מוגדר על ידי תנודות איטיות (1-4 Hz) של משרעת גבוהה (גלי דלתא), עם חוסר הכרה ופעילות מוטורית תכליתי. שינה REM מתאפיינת בתנודות מהירות יחסית (6-12 Hz) של משרעת נמוכה וכמעט מוחלטת של שריר דו צדדי atonia⁵.

Borbely הציע תאוריה של התקנה שינה-ערות המכונה 2 תהליך הדגם^6,7. תהליך הומסטטי, המכונה גם תהליך S, מייצג לחץ שינה המצטבר במהלך הערות ומתמוסס במהלך השינה. תהליך נוסף, המכונה תהליך C, הוא תהליך מעגלי, מה שמסביר מדוע רמות הדריכות משתנים במחזוריות של 24 שעות. בנוסף לשני תהליכים אלה, גורמים allostatic חשובים גם לוויסות שינה/ערות^8,9. גורמים אלוסטטיים כוללים מצבים תזונתיים ורגשות. פחד וחרדה מלווים בדרך כלל על ידי עלייה בהתעוררות יחד עם תגובות אוטונומיות ונוירואנדוקרינים^10,11,12. המערכת הלימבית הוא האמין לשחק תפקיד בוויסות של פחד וחרדה, ומנגנונים בבסיס התגובות האוטונומית האנדוקריניים נחקרו בהרחבה, אבל את השביל שבו המערכת הלימבית משפיע שינה/ערנות מדינות לא עדיין נחשף. מספר רב של מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות opto-ו פרמקוגנטיקה הציעו כי נוירונים ומעגלים עצביים להסדיר שינה/ערות מדינות מופצים ברחבי המוח, כולל את מערבולות, בסיס המוח הקדמי, תלמוס, ההיפותלמוס, וגזע המוח. בפרט, פיתוחים אחרונים באלקטרואופטיקה אפשרו לנו לעורר או לעכב מעגלים עצביים ספציפיים in vivo עם רזולוציות מרחבית וזמני גבוהה. טכניקה זו תאפשר התקדמות ההבנה שלנו של מצעים עצביים של שינה וערות, וכיצד שינה/הערות מדינות מוסדר על ידי תהליכים מעגליות, לחץ שינה, וגורמים allostatic, כולל רגש. נייר זה נועד להציג כיצד להשתמש מניפולציה אלקטרואופטיקה בשילוב עם הקלטת שינה/התעוררות, אשר יכול להיות הפוטנציאל לעדכן את ההבנה שלנו של התחברות ומנגנונים במוח כי לשחק תפקיד בוויסות NREM לישון, ראם לישון, וערות. הבנה של מנגנון זה שבו המערכת הלימבית מסדיר מדינות שינה/ערנות היא בעלת חשיבות עליונה לבריאות, כי נדודי שינה קשורה בדרך כלל עם חרדה או פחד להיות מסוגל לישון (somniphobia).

הוא נחשב לתפקיד חיוני בחרדה ובפחד. גד 67-הבעת הנוירונים הם אוכלוסייה מרכזית של הבנסט^12,13. בדקנו את ההשפעה של מניפולציה אלקטרואופטיקה של הנוירונים האלה (נגבה בידי^ndt) על מדינות שינה/ערות. אחת ההתקדמות הגדולה ביותר במדעי המוח בשנים האחרונות הייתה שיטות המאפשרות מניפולציה של נוירונים עם זהויות כימיות מסוימות בvivo, עם רזולוציות מרחבית וזמני גבוהות. אלקטרואופטיקה היא שימושית מאוד להפגין קשרים סיבתי בין פעילות עצבית ותגובות התנהגותיות מסוימות¹⁴. אנו מתארים אלקטרואופטיקה כשיטה לבחון את הקישוריות הפונקציונלית של מעגלים עצביים מוגדרים בוויסות מצבי שינה/ערנות. באמצעות שימוש בטכניקה זו, הושגה התקדמות רבה בהבנת המעגלים העצביים המוסתים שינה/ערות מדינות^15,16,17,18,¹⁹ . במקרים רבים, opsins מוצגים במיוחד נוירונים עם זהויות כימיות מסוימות באזורי המוח סלקטיבי על ידי שילוב של עכברים מנהל ההתקן והמין-inducible AAV-תיווך העברה גנטית. יתרה מזאת, ביטוי ממוקד של האופינים הרגישים לתמונה כגון המתקשרים 2 (ChR2)²⁰ או הארכדופסין (archt)²¹ בשילוב עם מערכת מסוג-loxp או Flp-frt מאפשר לנו לתמרן אוכלוסיה עצבית סלקטיבית וספציפית . מסלול עצבי²²

אנו מתארים כאן ניסויים על הנוירונים... כדי לבטא את האופינים באוכלוסיה עצבית ייעודית, עכברים מתאימים למנהלי התקנים של מנהלי ההתקנים ודרכי הווירוסים תלויי-היצור שבשימוש תכוף ביותר. שורות העברה או הקפאה, שבהן מתבטאת האופשות באוכלוסיות נוירואליות מסוימות, הן גם שימושיות. בניסויים הבאים, השתמשנו GAD67-יצורים טוק-in עכברים²³ שבו רק gabaergic הנוירונים אקספרס היצורים RECOMBINASE עם רקע גנטי C57BL/6j, ו וקטור aav אשר מכיל ChR2 (hChR2 H134R) התמזגו עם eyfp או eyfp כפקד בבורר "FLEx (היפוך כריתה)"²⁴. הנוהל מתאר במפורש את העירור האפגנטי של הנוירונים האחרים ב-BNST במהלך הניטור של מדינות שינה/ערות²⁵.

Protocol

כל הניסויים כאן אושרו על ידי ועדת ניסוי בעלי חיים של אוניברסיטת טסוקובה, הציות להנחיות של NIH.

1. כירורגיה של בעלי חיים, הזרקת וירוס, אלקטרודה עבור EEG/EMG, ו סיבים אופטיים השרשה

זהירות: הגנה מתאימה וטכניקות טיפול יש לבחור מבוסס על רמת בטיחות של הווירוס לשימוש. AAV צריך לשמש בחדר P1A מבודדים מדורגים להזרקה, ואת הצינור נושאת AAV חייב להיות מעוקר עם החיטוי לאחר כל אמצעי האחסון משמש למעלה. האתר כירורגי וכל חומר מושתל צריך להיות נקי וסטרילי במהלך השימוש.
הערה: ראה איור 1.

1. לחטא את הציוד הכירורגי עם החיטוי.
2. . בעזרת מכשיר הרדמה לצפות עד העכבר הגיע לעומק הרצוי של הרדמה, נקבע על ידי אובדן של תגובה צובט את הזנב עם מלקחיים. החלת משחה אופטלמולוגית על העיניים כדי למנוע מהם להתייבש.
3. לחטא את השדה כירורגי עם יוד פתרון או 70% אטוח (3x) ו יבש מספיק. לאפשר וירוס להפשיר על הקרח כמו הניתוח מבוצע. כסו את האזור הכירורגי עם נייר מעבדה סופג.
4. תקן את ראש העכבר במנגנון הסטרטקטיקה עם פסי האוזן וצביטה באף. לאחר אישור הראש מוחזק באופן בלתי נשכח, לבצע חתך midsagittal בקרקפת כדי להבטיח את המיקומים של ברז ו למדא ממוקמים באותה רמה על קו אופקי.
5. כדי למנוע הפער מיקום, כראוי להתאים את רמות הצביטה האף והאוזניים למעלה ולמטה. הברגמה ולמדא מתייחסים לצומת שבין הסוטורה סאגגיוציס וסוטורה קורוליס או סוטורה, בהתאמה (איור 2).
6. השתמש בתפסים Serafin כדי להחזיק את העור כדי לשמור על הגישה הגולגולת. לאחר חשיפת הגולגולת, לחטא את פני השטח של הגולגולת עם יוד או 5% H₂O₂, כדי לאפשר את התפרים הגולגולת כולל ברז ו למדא להיות דמיינו יותר בבהירות.
7. הכנת הזרקת וקטור AAV:
   1. שטוף את החלק הפנימי של מזרק 10 מ ל (ראה טבלת חומרים) ברצף עם 70% אטוח, 100% אטואה ו מים מעוקרים, 5 פעמים כל אחד. אבטח את המזרק בתפס של זרוע משאבת מיקרוהזרקה וודא שכל הפתרונות במזרק משוחררים.
   2. מוחדרים בזהירות 2 μL של שמן מינרלי ללא בועות אוויר, ולאחר מכן מוחלק את הנפח המיועד של פתרון וירוס. לאחר השאיפה, לתמרן את כפתור הבוכנה ולוודא כי פתרון וירוס מתגלה בקצה של המחט.
      הערה: נפח ההזרקה של פתרון הווירוס נקבע בניסויים פיילוט באמצעות אותו להתאמץ העכבר ואותו מוצר וירוס. יש להעריך מראש את הקשר בין נפח פתרון הווירוסים לבין היקף אזור הזיהום.
8. הכנס וקטור AAV:
   1. התאימו את קצה המחט המיקרוזרקת על הברגמה ושימו לב לקואורדינטות כנקודה המקורית. העבר את העצה לאתר ההזרקה המיועד (עבור ה-BNST: anteroposterior + 0.2 מ"מ, מדיה הצלעות ± 1.0 mm, dorsoventral-4.2 מ"מ) ומניחים את קצה המחט על המיקום. לשים סימן על הגולגולת ולקדוח חורים של כ 2 מ"מ בקוטר באמצעות מקדחה שיניים עם חותך 0.7 מילימטר קרביד. יש להיזהר שלא לפגוע ברקמת המוח או ברקמה המוחית.
   2. לאחר הסרת דם מסביב החורים בספוגית כותנה, הזיזו לאט את המחט לתנוחת ה-BNST. לאט להזריק את הכמות המיועדת של פתרון וירוס (0.07 μl/min) עם מיקרו מזרק מכני. לאחר השלמת הזריקה, להשאיר את המחט 5 דקות כדי לאפשר את הפתרון כדי לחדור מספיק את רקמת BNST. . תוציא בזהירות את המחט
   3. לקבלת הזרקה דו-צדדית, חזור על שלבים 1.8.1-1.8.2 בצד השני. במהלך ההליך, לשמור על הגולגולת לח עם יישומים של תמיסת מלח סטרילי.
      הערה: השתמשנו שתלים מותאמים אישית EEG/EMG (W: 5 מ"מ, D: 7 מ"מ, H: 1 מ"מ) עם ארבעה אלקטרודות EEG (4 מ"מ), שני אלקטרודות EMG (2 מ"מ; לחתוך את האלקטרודה 4 מ"מ 2 מ"מ עם מצבתים) ו 6 אלקטרודות (4.5 מ"מ) (איור 2A).
9. הלחמה שני חוטי נירוסטה (ראה טבלת חומרים) שממנה 1 מ"מ של הבידוד מופשט משני הקצוות לאלקטרודות emg. להתאים את מרכז האלקטרודות אל ברז ולסמן את המיקום של כל אלקטרודה EEG (anteroposterior ± 1.5 mm, mediolateral ± 1.0 מ"מ), ולקבוע את המיקום של השתל (איור 2B).
10. סיבים אופטיים השתל:
    1. לצרף סיבים אופטיים שלטון מניפולטור ולסובב את הזרוע מניפולטור כך שיש לו זווית של ± 30 ° נגד קו אופקי (תהליך זה צריך רק כדי למנוע הפרעות בין אלקטרודות סיבים אופטיים, כגון במקרה של גירוי BNST). שים את קצה החוט על הברז. ותעד את נקודות הציון
    2. הזז את הקצה לשורת ההכנסה הייעודית וסמן את המיקום על הגולגולת. שים גם סימנים נוספים ליד אתר הכניסה עבור בורגי העוגן. לקדוח את הגולגולת על כל אתר עם מקדחה שיניים כדי להכניס את סיבים אופטיים ולתקן את הבורג. . תתקן את הבורג על הגולגולת היזהרו לא לשבור את הדורה או נזק רקמות על ידי בורג.
    3. הכנס את סיבי הראיה בעדינות עד שהגיע מעל ל-BNST עם מניפולטור. הפרשול צריך לנוח על הגולגולת שנותרה (איור 1B).
    4. החלת מלט שיניים פוטולריפוי (ראה טבלת חומרים) כדי לכסות את הסיבים ואת הבורג. זמן התגובה כדי לחזק את הדבק צריך להיות מצוין על ידי המדריך של היצרן (החומר שלנו זקוקה לחשיפה לאור עבור לפחות 10 s עם התמונה באורך גל ספציפי-גנרטור. אין צורך לייבש את הדבק אחרי זה.
    5. בשלב זה, ודא שאין חומרים (בורג או דבק) תופסים את השטח הגובר עבור האלקטרודות. בנוסף, להימנע מלעשות כל הפרעה בבטון עבור חזיות חיבור סיבים אופטיים וכבלים. חזור על הצעדים 1.10.1-1.10.4 בצד הנגדי של גירוי דו-כיווני.
11. מקדחים לאלקטרודות של EEG/EMG. הכנס את קצות האלקטרודות לתוך החורים. החזיקו את השתל והחילו דבק ציאנואקרילי לחלל שבין הגולגולת לאלקטרודות. הוסף שוב עם תשומת לב לא להתערב בחומרים כלשהם.
12. לכסות את ההיקף של אלקטרודות וסיבים אופטיים עם דבק ציאנואקרילי ואחריו יישום של מאיץ ציאנואקריאקרילי על דבק. שלב זה נמנע מגרימת הפרעה בכבל הפרכלל-לאופטי ובאזור חיבור התיל-אל-מוביל (איור 1C).
    הערה: דבק ציאנואקרילי והמאיץ שלו. מזיקים לעין העכבר שים לב לא לגרום לניקוז של חומרים כימיים אלה. כמו כן, להיזהר לא לגעת מאוד אלקטרודות וסיבים כדי למנוע סטייה בלתי צפויה מיד לאחר מיצוק דבק.
13. לחשוף את שרירי הצוואר העכבר ולהכניס את החוטים של האלקטרודה EMG מתחת לשריר. התאימו את אורך האלקטרודה EMG כך שהיא מאתרת רק מתחת לשרירי הזמן. חיבור אור בין קצה של אלקטרודה fascia שרירים הוא מספיק כדי לתפוס את האות EMG.
14. החלת דבק ציאנואקרילי כדי למלא את השתלים ולחזק את הדבק עם נוזל האצה. לאחר מכן, הניחו את העכבר על משטח חום להתאוששות עד שיופיע רפלקס הפוסט-אורל. כוונן את טמפרטורת משטח החום לטמפרטורת הגוף למנוחה בעלי חיים (36.0 ° צ' ב-ZT 0-12 במקרה של עכברים C57BL6; לא יעלה על 38.0 ° c).
    הערה: אנטיביוטיקה אינה נדרשת לניתוח סטרילי.
15. בצע את ההנחיות המוסדיות המקומיות שלך לחוסר כאבים שלאחר הניתוח. לשמור את העכברים בכלוב הבית לתקופת התאוששות של לפחות 7 ימים.

2. מעקב EEG/EMG עם העירור התמונה של נוירונים ממוקדים במצבי שינה ספציפיים

זהירות: פרוטוקול זה כולל שימוש בציוד לייזר מסוג class 3B או בהתקני LED. יש לשים לב למידע על בטיחות. משקפי העין המגן נדרשים.

1. לפני חיבור כבל הלייזר לסיבים אופטיים, להתאים את עוצמת הלייזר עם scaler. לקשור את קצה כבל הלייזר לסיבים אופטיים שאינם בשימוש עם כלל ולוודא כי אין מקום בצומת בין סיבים לכבל.
2. הפעל את המתג הראשי של הלייזר והמתן 20 דקות לחימום.
3. לפלוט את הלייזר לבודק האינטנסיביות ולהתאים את עוצמת הלייזר ל 10 mW/mm². לשנות את מצב הלייזר כדי ההיגיון טרנזיסטור ולאשר כי פולסים אור נפלטים סיבים מבוקרת על ידי הרגולטור דפוס אשר מוגדר ב 10 ms למשך, 40 ms עבור מנוחה, 20 פעמים עבור מחזור, ו 20 פעמים חוזר (כלומר, 20 הרץ של 10 הפולסים האור עבור 20 s).
4. לאחר תקופת ההחלמה, להעביר את העכברים לחדר ניסיוני עבור הקלטת EEG/EMG. עכברים בבית באופן קבוע 23 ° צ' עם מחזור 12 שעות אור/כהה עם מזון ומים זמין ad libitum.
5. לחבר את האלקטרודה מושתל מתאם כבל אשר קשור לטבעת התגית כדי למנוע שזירה. מומלץ לכסות את הצומת עם חומרים בלתי מסוגלים לאור כגון רדיד אלומיניום כדי למנוע דליפת לייזר. אם נדרש ניסוי דו-כיווני, השתמש בטבעת הצמדה עם קובץ מצורף של bifurcate עבור הכבלים.
6. בפרוטוקול זה, אנו להעריך את ההשהיה לערות מ-NREM שינה או שינה REM, כך זמן ההקלטה צריך להיות מוגבל בזמן האופטימיזציה ממוטבת (ZT0 מוגדר כשעה כאשר האור הוא על). פרוטוקול זה נערך בין ZT4-ZT10. תנו לעכברים להישאר בחופשיות בחדר הניסיוני לפחות 1 h כהאקטיזציה.
7. במהלך התקופה הניסיונית, לפקח EEG ו-EMG אותות באותו צג ולהעריך את מצב העכבר כמו ערות, NREM לישון או לישון ראם. השתמש בבקרת הרווח עבור כל גל כדי להקל על ההבחנה בין כל מדינה.
8. למדידת שינה NREM כדי השהיה ערות, להתבונן יציב NREM שינה עבור 40 s או יציב REM לישון עבור 30 s, ואז להפעיל את הבורר של מחולל דפוס עבור פוטוגריית (פרוטוקול זה יוצר 20 הרץ של 10 אלפיות התשעים של האור עבור 20 s). תאשר פליטת לייזר. לסיבים האופטיים המושתל
9. הקלטה של אותות EEG/EMG עד שמצב השינה משתנה לערות. אם יש צורך בשני מבחנים ניסיוניים או יותר, יש להגביל את המניפולציה האופגנטית פעם ביום משום שהגירוי בתמונה הוא התערבות מלאכותית שעלולה להשפיע על אדריכלות השינה/הערות.
10. לאחר הניסוי, מורדם מאוד ומעשה עם תמיסת מלח סטרילי ופאראפורמלדהיד (בכיוון ההוא) לדגימת המוח כולו עבור ניתוח אימונוהיסטוכימיה²⁶.

3. ניתוח זמן ההשהיה מ NREM שינה לערות

1. לאחר הקלטת אותות EEG/EMG, להעביר את נתוני האות למחשב עבור הבקיע שינה/מצבי ערות. פרוטוקול זה מתאר את השיטה לניתוח EEG עם תוכנת הקלטה (ראה טבלת חומרים).
2. הפעל את יישום סימן השינה ולחץ על כרטיסיית הקובץ ובחר באפשרות פתיחה כדי לבחור את הנתונים המוקלטת (קובץ. kcd). לחץ על הכרטיסיה שינה כדי לבחור זמן תקופה להתאמת חלון הזמן עבור כל תקופה (אנו משתמשים ב-1 תקופה/4 שניות).
3. באופן ידני הציון שינה/ערות מדינות המבוססות על אותות EEG/EMG, על פי הקריטריונים הבאים: עירות, EMG גבוהה ומתח EEG נמוך עם תדר גבוה; NREM, בטון נמוך EMG ובמתח EEG גבוה עם δ גבוהה (0.5-4 Hz) תדר; ו REM, EMG מציין שריר atonia ומתח EEG נמוך עם high θ (6-9 Hz) תדר. מדינה שאינה נמשכת ברציפות עבור 16 s (כלומר 4 מנות) אינה מוגדרת כשינוי מדינה משום שהיא אינה מצב יציב.
4. לחץ והחזק את לחצן העכבר השמאלי בתקופה הראשונה וגרור את הסמן עד המגמה הספציפית של יותר מ -16 (4 מנות) הוא הסתיים. לאחר מכן, שחרר את לחצן העכבר השמאלי ובחר את המצב המתאים (ערות או שינה NREM או שינה REM) בחלון המוקפץ. חזור על הליך זה כדי להבקיע כל אותות EEG/EMG שנרשמו בקובץ.
5. מצא את הזמן המדויק של גירוי בתקופה שבה EEG מראה NREM או ראם שינה, ואת התקופה מראה מעבר המדינה בעקבות נקודת גירוי. ספור את מספר הנקודות בין התקופות שלאחר הגירוי ובדיוק לפני מעבר המדינה.
6. לאחר מכן הכפל את מספר האפוקסי הנספר ב -4 s (א). בעידן הגירוי, קחו צילום מסך ומדדו את הרוחב בין נקודת הגירוי לסוף התקופה. לאחר מכן, חלק את האורך הנמדד על-ידי אורך התקופה כולה והכפל ב -4 s (ב). באופן דומה, לחשב את משך שינה NREM בתקופה של שינוי המדינה, מה שאומר את הזמן בין תחילת התקופה ואת נקודת שינוי המדינה (ג).
7. Sum A, B ו-C כדי לקבל את ההשהיה מ-NREM לישון לערות. אותו הליך משמש לניתוח של מעבר המדינה מ REM שינה לערות.

תוצאות

המחקר הנוכחי הראה את ההשפעה של השפעת האופגנטיות של הנוירונים בתוך המדינה במצב שינה. ChR2-EYFP הביע באופן מידי ביטוי בנוירונים. An באתרו היברידיכימית מחקר היסטכימיות הראה כי ChR2-EYFP היה מקומי בנוירונים המבטא גד 67 mRNA אותות, המציין כי אלה הם נוירונים GABAergic. הסיבים האימונוהיסט...

Discussion

אנו כאן הציגו שיטה כדי להעריך את ההשפעה של גירוי אלקטרואופטיקה של נוירונים עם זהויות כימיות מסוימות על מעברים מדינה של שינה/ערות והעניק דוגמה של מניפולציה של הנוירונים בע. הנתונים שלנו הראו כי השפעת השפעת הנוירונים באופן מיידי על ידי הנירע באמצעות מעבר מיידית מ-nrem לישון לערות....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x1 Fiber-optic Rotary Joints	Doric	FRJ 1x1 FC-FC	for optogenetics
6-pin header	KEL corporation	DSP02-006-431G
6-pin socket	Hirose	21602X3GSE
A/D converter	Nippon koden	N/A	Analog to digital converter
AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP			3.70×1013(genomic copies/ml)
AAV10-EF1a-DIO-EYFP			5.82×1013(genomic copies/ml)
Ampicillin	Fuji film	014-23302
Amplifier	Nippon koden	N/A	for EEG/EMG recording
Anesthetic vaporizer	Muromachi	MK-AT-210D
Automatic injecter	KD scientific	780311
Carbide cutter	Minitor	B1055	φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor
Cyanoacrylate adhesion  (Aron alpha A) and acceleration	Konishi	#30533
Dental curing light	3M	Elipar S10
Epoxy adhesive	Konishi	#04888	insulation around the solder of 6-pin and shielded cable
Fiber optic patch cord (branching)	Doric	BFP(#)_50/125/900-0.22
Gad67-Cre mice	provided by Dr. Kenji Sakimura		Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele
Hamilton syringe	Hamilton	65461-01
High speed rotary micromotor kit	FOREDOM	K.1070	Used with carbide cutter
Interconnecting sleeve	Thorlab	ADAF1	φ2.5 mm Ceramic
Isoflurane	Pfizer	871119
Laser	Rapp OptoElectronic	N/A	473nm wave length
Laser intesity checker	COHERENT	1098293
Laser stimulator	Bio research center	STO2	reffered as pulse generator in text
Optic fiber with ferrule	Thorlab	FP200URT-CANNULA-SP-JP
pAAV2-rh10	provided by PennVector Core
pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA	Addgene	plasimid # 20296
pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA	provided by Dr. Karl Deisseroth
Patch cord	Doric	D202-9089-0.4	0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint
pHelper	Stratagene
Photocurable dental cement	3M	56846
Serafin clamp	Stoelting	52120-43P
Shielded cable	mogami	W2780	Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording
Sleep recording chamber	N/A	N/A	Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder
Sleep sign software	KISSEI COMTEC	N/A	for EEG/EMG analysis
Slip ring	neuroscience,inc	N/A	for EEG/EMG analysis
Stainless screw	Yamazaki	N/A	φ1.0 x 2.0
Stainless wire	Cooner wire	AS633	0.0130 inch diameter
Stereotaxic frame with digital console	Koph	N/A	Model 940
Syringe needle	Hamilton	7803-05
Vital recorder software	KISSEI COMTEC	N/A	for EEG/EMG recording