Оптогенетическое манипулирование нейронными цепями во время мониторинга сна / бодрствования государств у мышей

Резюме

Здесь мы описываем методы оптогенетической манипуляции определенными типами нейронов во время мониторинга состояния сна/бодрствования у мышей, представляя нашу недавнюю работу над ядром кровати stria terminalis в качестве примера.

Аннотация

В последние годы оптогенетика широко используется во многих областях нейронаучных исследований. Во многих случаях опсин, например канал родопсин 2 (ChR2), выражается вирусным вектором в определенном типе нейрональных клеток у различных мышей-кре-драйверов. Активация этих опсинов вызвана применением световых импульсов, которые поставляются лазером или светодиодом через оптические кабели, и эффект активации наблюдается с очень высоким разрешением времени. Экспериментаторы способны остро стимулировать нейроны при мониторинге поведения или другого физиологического исхода у мышей. Оптогенетика может позволить полезные стратегии для оценки функции нейрональных цепей в регуляции сна / бодрствования состояний у мышей. Здесь мы описываем методику изучения влияния оптогенетических манипуляций нейронов с определенной химической идентичностью во время электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и мониторинга электромиограммы (ЭМГ) для оценки стадии сна мышей. В качестве примера мы описываем манипуляции ГАМК нейронов в ядре кровати stria terminalis (BNST). Острое оптогенетическое возбуждение этих нейронов вызывает быстрый переход к бодрствованию при применении во время сна NREM. Оптогенетические манипуляции наряду с записью ЭЭГ/ЭМГ могут быть применены для расшифровки нейрональных цепей, которые регулируют состояния сна/бодрствования.

Введение

Сон необходим для оптимальной когнитивной функции. Последние результаты также свидетельствуют о том, чтонарушения во сне связаны с широким спектром заболеваний 1,^2,3. Хотя функции сна до сих пор в значительной степени нерешенными, значительный прогресс был достигнут в последнее время в понимании нейронных цепей и механизмов, которые контролируют сон / бодрствования государства⁴. У млекопитающих существует три состояния бдительности: бодрствование, небыстрое движение глаз (NREM) сна, и быстрое движение глаз (REM) сна. Пробуждение характеризуется быстрыми колебаниями ЭЭГ (5-12 Гц) низкой амплитуды с целенаправленной и устойчивой двигательной активностью. Сон NREM определяется медленными колебаниями (1-4 Гц) высокой амплитуды (дельтовые волны), с отсутствием сознания и целенаправленной двигательной активностью. REM сон характеризуется относительно быстрыми колебаниями (6-12 Гц) низкой амплитудыи почти полной двусторонней атонии мышц 5.

Борбели предложил теорию регулирования сна бодрствования, известной как две модели процесса^6,7. Гомеостатический процесс, также называемый процессом S, представляет давление сна, которое накапливается во время бодрствования и рассеивается во время сна. Другой процесс, называемый процессом C, является циркадным процессом, который объясняет, почему уровни бдительности колеблются в 24 h цикле. В дополнение к этим двум процессам, аллостатические факторы также важны для регулирования сна / бодрствования^8,9. Аллостатические факторы включают состояние питания и эмоции. Страх и тревога, как правило, сопровождается увеличением возбуждения наряду с вегетативными и нейроэндокринными ответами^10,11,12. Лимбическая система, как полагают, играют определенную роль в регуляции страха и тревоги, и механизмы, лежащие в основе вегетативных и нейроэндокринных реакций были изучены широко, но путь, по которому лимбическая система влияет на сон / бодрствование государства не но были выявлены. Большое количество недавних исследований с использованием опто- и фармакогенетики показали, что нейроны и нейронные цепи, которые регулируют сон / бодрствования государства распространяются по всему мозгу, в том числе кортики, базальный предмозг, таламус, гипоталамус, и ствол мозга. В частности, последние достижения в области оптогенетики позволили нам стимулировать или ингибировать специфические нейронные цепи in vivo с высокимпространственным и временным разрешением. Этот метод позволит прогрессировать в нашем понимании нервных субстратов сна и бодрствования, и как сон / бодрствование государства регулируются циркадных процессов, давление сна, и аллостатические факторы, в том числе эмоции. Эта статья направлена на введение, как использовать оптогенетические манипуляции в сочетании с записью сна / бодрствования, которые могли бы иметь потенциал для обновления нашего понимания коннектомы и механизмы в головном мозге, которые играют роль в регулировании сна NREM, REM сна, и бодрствования. Понимание этого механизма, с помощью которого лимбическая система регулирует состояние сна/бодрствования имеет первостепенное значение для здоровья, потому что бессонница обычно ассоциируется с тревогой или страхом быть не в состоянии спать (сомнифобия).

Считается, что BNST играет важную роль в тревоге и страхе. GAD67-выражение ГАМК нейронов являются основной популяции BNST^12,13. Мы изучили влияние оптогенетических манипуляций этих нейронов (GABA^BNST) на сон / бодрствования государств. Одним из величайших достижений в области неврологии в последние годы были методы, которые позволяют манипулировать нейронами с определенными химическими идентичностями in vivo, с высоким пространственным и временным разрешением. Оптогенетика очень полезна для демонстрации причинно-следственной связи между нервной активностью и специфическими поведенческими реакциями^14. Мы описываем оптогенетику как метод изучения функциональной связи определенных нейронных цепей в регуляции состояний сна/бодрствования. Используя эту технику, большой прогресс был достигнут в понимании нейрональных цепей, которые регулируют сон / бодрствования государства^{15,16,17,18,19} . Во многих случаях, opsins специфически введены в невенарах с определенными химическими тождественноплетениями в селективных зонах мозга комбинацией мышей Cre-водителя и Cre-индуцируемого AAV-опосредованного перехода гена. Кроме того, фокусное выражение фоточувствительных опсинов, таких как каналродопсин 2 (ChR2)²⁰ или архаэродопсин (ArchT)²¹ в сочетании с Cre-loxP или Flp-FRT система позволяет манипулировать селективной нейронной популяции и конкретных нейронный путь²².

Мы описываем здесь эксперименты на ГАМК нейронов в BNST в качестве примера. Для выражения опсинов в назначенной нейрональной популяции наиболее часто используются соответствующие мыши-водители Cre и cre-dependent virus vectors. Трансгенные или стук-в линии, в которых опсины выражаются, в частности, нейронных популяций также полезны. В следующих экспериментах, мы использовали GAD67-Cre стук-в мышах^23, в котором только ГАМК-нейроны выразить Cre рекомбиназы с C57BL/6J генетического фона, и вектор AAV, который содержит ChR2 (hChR2 H134R) сливается с EYFP или EYFP в качестве контроля с переключателем "FLEx (Flip-excision)²⁴. Процедура конкретно описывает оптогенетическое возбуждение ГАМК нейронов в BNST во время мониторинга сна / бодрствования государства²⁵.

протокол

Все эксперименты здесь были одобрены Комитетом по эксперименту и использованию животных Университета Цукуба, в соответствии с руководящими принципами NIH.

1. Хирургия животных, инъекция вируса, электрод для ЭЭГ/ЭМГ и имплантация оптического волокна

ПРЕДЕКТО: Соответствующие методы защиты и обработки должны быть выбраны на основе уровня биобезопасности вируса, который будет использоваться. AAV следует использовать в изолированной P1A градуированной комнате для инъекций, и трубка проведения AAV должны быть стерилизованы с автоклавом после того, как весь объем иссяк. Хирургическое место и весь имплантированный материал должны быть чистыми и стерильными во время использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Посмотреть рисунок 1.

1. Дезинфицировать хирургическое оборудование с автоклавом.
2. Обезлививание мышей с изофлюран с помощью анестезируетического испарителя. Наблюдайте до тех пор, пока мышь не достигнет желаемой глубины анестезии, определяемой потерей реакции на щипать хвост щипками. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить их высыхание.
3. Дезинфицировать хирургическое поле с раствором йода или 70% EtOH (3x) и высохнуть достаточно. Разрешить вирус таять на льду, как операция выполняется. Обложка хирургической области с абсорбирующим лабораторной скамейке бумаги.
4. Закрепите голову мыши в стереотаксическом аппарате с ушными прутьями и щепоткой носа. После подтверждения головы удерживается застойно, сделайте разрез среднего уровня в коже головы, чтобы обеспечить, чтобы положения брегмы и лямбды располагались на одном уровне на горизонтальной линии.
5. Чтобы избежать зазора позиционирования, соответствующим образом отрегулируйте уровни щепотки носа и ушных прутьев вверх и вниз. Брегма и лямбда относятся к пересечению между сутурой saggitalis и sutura coronalis или sutura lambdoidal, соответственно(рисунок 2).
6. Используйте зажимы Серафин держать кожу для поддержания доступа к черепу. После воздействия черепа, дезинфицировать поверхность черепа с йодом или 5% H₂O₂, чтобы черепные швы, включая брегму и лямбду, чтобы быть визуализированы более четко.
7. Подготовка инъекции вектора AAV:
   1. Вымойте внутри шприца 10 мл (см. Таблицаматериалов) последовательно с 70% EtOH, 100% EtOH, и стерилизованной воды, 5 раз каждый. Закрепите шприц в зажиме руки насоса микроинъекции и убедитесь, что все растворы в шприце разряжаются.
   2. Тщательно аспирируйте 2 л минерального масла без пузырьков воздуха, затем аспирируйте назначенный объем раствора вируса. После аспирации, манипулировать поршень кнопку и подтвердить, что вирусное решение возникает на кончике иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем инъекций раствора вируса был определен в пилотных экспериментах с использованием того же штамма мыши и того же вирусного продукта. Взаимосвязь между объемом раствора вируса и масштабами инфекционного участка должна быть оценена заранее.
8. Впрыск вектора AAV:
   1. Отрегулируйте кончик иглы микроинъекций на брегме и обратите внимание на координаты в качестве исходной точки. Переместите наконечник в назначенное место впрыска (для BNST: anteroposterior 0,2 мм, посредственейтеральный 1,0 мм, дорсовентр - 4,2 мм) и поместите кончик иглы на позицию. Наденьте отметку на черепе и просверлите отверстия диаметром около 2 мм с помощью зубного сверла с карбидным резаком диаметром 0,7 мм. Будьте осторожны, чтобы не повредить дюру или ткани мозга.
   2. После удаления крови из вокруг отверстий с ватным тампоном, медленно перемещать иглу в положение BNST. Медленно впрысните назначенное количество раствора вируса (0,07 л/мин) с помощью механического микроинжектора. После завершения инъекции, оставьте иглу на 5 мин, чтобы позволить раствору достаточно проникнуть в ткань BNST. Аккуратно выняйте иглу.
   3. Для двустороннего впрыска повторите шаги 1.8.1-1.8.2 с другой стороны. На протяжении всей процедуры держите череп влажным с применением стерильного солья.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали пользовательские имплантаты ЭЭГ/ЭМГ (W: 5 мм, D: 7 мм, H: 1 мм) с четырьмя эЭГ-электродами (4 мм), двумя электродами ЭМГ (2 мм; разрезать 4 мм электрода до 2 мм с щипцы) и 6 электродов (4,5 мм)(рисунок 2A).
9. Solder два провода из нержавеющей стали (см. Таблицаматериалов), из которых 1 мм изоляции удаляется с обоих концов электродов ЭМГ. Отрегулируйте центр электродов к брегме и отметьте положение каждого эЭГ-электрода (антеропостериор 1,5 мм, посредстверальное - 1,0 мм) и определите положение имплантата(рисунок 2В).
10. Имплантат оптических волокон:
    1. Прикрепите оптоволоконное волокно к манипулятору и поверните руку манипулятора так, чтобы она имеет угол 30 евро против горизонтальной линии (этот процесс необходим только для того, чтобы избежать помех между электродами и оптическими волокнами, например, в случае стимуляции BNST). Положите кончик волокна на bregma и запишите координаты.
    2. Переместите наконечник к целевой линии вставки и отметьте положение на черепе. Также поставьте дополнительные отметки возле места вставки для якорных винтов. Просверлите череп на каждом участке с помощью зубного сверла, чтобы вставить оптическое волокно и зафиксировать винт. Заправьте винт на черепе. Будьте осторожны, чтобы не сломать дюру или повредить ткани винтом.
    3. Вставьте оптическое волокно осторожно, пока не достигнет выше BNST с манипулятором. Ферруле должен опираться на оставшийся череп(рисунок 1B).
    4. Нанесите фотоизлечимый зубной цемент (см. ТаблицуМатериалов), чтобы покрыть волокно и винт. Время реакции для затвердевания клея должно быть определено руководством производителя (Наш материал нуждается в воздействии света, по крайней мере 10 с конкретной длины волны фото-генератора. Нет необходимости сушить клей после этого).
    5. На этом этапе убедитесь, что никакие материалы (винт или клей) не занимают монтажное пространство для электродов. Кроме того, избегайте каких-либо перерывов в цементе для ferrule подключения к оптическому волокну и кабелю. Повторите шаги 1.10.1-1.10.4 на противоположной стороне для двусторонней стимуляции.
11. Просверлить отверстия для электродов ЭЭГ/ЭМГ. Вставьте кончики электродов в отверстия. Держите имплантат и нанесите цианоакрилат ный клей в пространство между черепом и электродами. Вставьте еще раз с вниманием, чтобы не мешать любым материалам.
12. Обложка окружности электродов и оптических волокон с цианоакрилат клей с последующим применениециоакрилат ускорителя на клей. Этот шаг позволяет избежать каких-либо прерываний на ферруле-оптический кабель и электрод-к-ведущий провода подключения зоны(рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цианоакрилат клей и его ускоритель вредны для глаз мыши. Обратите внимание, чтобы не вызвать утечки этих химических веществ. Кроме того, будьте осторожны, чтобы не сильно коснуться электродов и волокон, чтобы избежать неожиданных отклонений сразу после клейки затвердевания.
13. Разоблачить мышцы шеи мыши и вставить провода для электрода ЭМГ под мышцу. Отрегулируйте длину электрода ЭМГ так, чтобы он находится прямо под нуклеальными мышцами. Световая связь между кончиком электрода и мышечной фасцией достаточна для поимки сигнала ЭМГ.
14. Нанесите цианоакрилатный клей, чтобы заполнить имплантаты и затвердеть клей с ускорением жидкости. Затем положите мышь на тепловую площадку для восстановления до тех пор, пока не появится постуральный рефлекс. Отрегулируйте температуру тепловой площадки к температуре тела животного отдыха (36.0 C в 0-12 в случае мышей C57BL6; не превышают 38.0 C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотик не требуется для стерильной хирургии.
15. Следуйте вашим местным институциональным рекомендациям по послеоперационной анальгезии. Держите мышей в домашней клетке в течение периода восстановления, по крайней мере 7 дней.

2. ЭЭГ/ЭМГ Мониторинг с фото-возбуждением целевых нейронов в конкретных состояниях сна

ПРЕДЕКТО: Этот протокол включает в себя использование лазерного оборудования класса 3B или светодиодных устройств. Экспериментаторы должны быть осведомлены о безопасности информации. Требуются защитные очки для глаз.

1. Перед подключением лазерного кабеля к оптическому волокну отрегулируйте интенсивность лазера с помощью масштабирования. Привязывайте кончик лазерного кабеля к неиспользованному оптическому волокну с феррулем и подтвердите, что на стыке между волокном и кабелем нет места.
2. Включите основной переключатель лазера и подождите 20 минут, пока он прогреется.
3. Излучайте лазер к checker интенсивности и отрегулируйтеинтенсивность лазера до 10 mW/mm 2. Измените лазерный режим для транзисторной логики и подтвердите, что световые импульсы излучаются из волокна, контролируемого регулятором шаблона, который устанавливается на уровне 10 мс для продолжительности, 40 мс для отдыха, 20 раз для цикла и 20 раз повторяют (то есть 20 Гц 10 мс световых импульсов для 20 s).
4. После периода восстановления перемещаем мышей в экспериментальную камеру для записи ЭЭГ/ЭМГ. Дом мышей на постоянной 23 КК с 12 ч свет / темный цикл с пищей и водой доступны ad libitum.
5. Подключите имплантированный электрод и кабельный адаптер, который привязан к кольцу скольжения, чтобы избежать путаницы. Рекомендуется покрыть соединение светонепроницаемым материалом, таким как алюминиевая фольга, чтобы предотвратить утечку лазера. Если требуется двусторонний эксперимент, используйте скользячее кольцо с бифуркатным креплением для кабелей.
6. В этом протоколе мы оцениваем задержку до бодрствования от сна NREM или REM сна, поэтому время записи должно быть ограничено в оптимизированном времени zeitgeber (ЗТ0 определяется как время, когда свет горит). Этот протокол был проведен между No 4 - No T10. Пусть мыши свободно остаются в экспериментальной камере, по крайней мере 1 ч в качестве акклиматизации.
7. В течение экспериментального периода, контролировать ЭЭГ и ЭМГ сигналов в том же мониторе и оценить состояние мыши, как бодрствование, NREM сна или REM сна. Используйте контроль усиления для каждой волны, чтобы было легче различать каждое состояние.
8. Для измерения NREM сна до задержки бодрствования, наблюдать стабильный сон NREM в течение 40 с или стабильный REM сон в течение 30 с, затем включите переключатель генератора шаблонов для фотостимуляции (этот протокол генерирует 20 Гц 10 мс световых импульсов для 20 s). Подтвердить лазерное излучение имплантированных оптических волокон.
9. Запись ЭЭГ/ЭМГ сигнализирует до тех пор, пока спящее состояние не изменится к бодрствования. Если необходимы два или более экспериментальных испытаний, ограничьте оптогенетические манипуляции раз в день, потому что фотостимуляция является искусственным вмешательством, которое может повлиять на архитектуру сна/бодрствования.
10. После эксперимента, глубоко обезболилить и наполнить стерильным сольным и параформальдегидом (PFA) для отбора проб всего мозга для иммуногистохимического анализа²⁶.

3. Анализ времени задержки от сна NREM до бодрствования

1. После записи сигналов ЭЭГ/ЭМГ перенесите данные сигнала на компьютер для оценки состояния сна/бодрствования. Этот протокол описывает метод анализа ЭЭГ с помощью программного обеспечения для записи (см. ТаблицуМатериалов).
2. Запустите приложение знака сна и нажмите на вкладку Файл и выберите Open, чтобы выбрать записанные данные (.kcd файл). Нажмите на вкладку Sleep, чтобы выбрать время Эпохи для настройки временного окна для каждой эпохи (мы используем 1 эпоху/4 сек).
3. Ручно оценка состояния сна/бодрствования на основе сигналов ЭЭГ/ЭМГ, в соответствии со следующими критериями: бодрствование, высокое EMG и низкое напряжение ЭЭГ с высокой частотой; NREM, низкий тон ЭмГ и высокое напряжение ЭЭГ с высокой частотой (0,5-4 Гц); и REM, ЕМГ указывает на атония мышц и низкое напряжение ЭЭГ с высокой частотой (6-9 Гц). Состояние, которое последовательно не продолжается в течение 16 с (т.е. 4 эпохи), не определяется как изменение состояния, потому что оно не является стабильным состоянием.
4. Нажмите и удерживайте левую кнопку мыши в первую эпоху и перетащите курсор до тех пор, пока не будет завершена конкретная тенденция более 16 с (4 эпохи). Затем отпустите левую кнопку мыши и выберите соответствующее состояние (бодрствование или NREM сон или REM сон) во всплывающем окне. Повторите эту процедуру, чтобы набрать все сигналы ЭЭГ/ЭМГ, записанные в файле.
5. Найти точное время стимуляции в эпоху, где ЭЭГ показывает NREM или REM сна, и эпоха, показывающая переход состояния после точки стимуляции. Подсчитайте количество эпох между периодами сразу после стимуляции и непосредственно перед переходом к состоянию.
6. Затем умножьте подсчитанное количество эпох на 4 с (А). В эпоху стимуляции, сделать снимок экрана и измерить ширину между точкой стимуляции и конца эпохи. Затем разделите измеренную длину на всю длину эпохи и умножьте на 4 с (B). Аналогичным образом, вычислить продолжительность сна NREM в эпоху изменения состояния, что означает время между началом эпохи и точкой изменения состояния (C).
7. Sum A, B и C, чтобы получить задержку от сна NREM до бодрствования. Та же процедура используется для анализа перехода состояния от сна REM к бодрствунию.

Результаты

Настоящее исследование показало влияние оптогенетического возбуждения нейронов ГАМК^BNST на переходное состояние сна. ChR2-EYFP был focally выражается в ГАМК нейронов в BNST. На месте гибридизации гистохимических исследование показало, что ChR2-EYFP был colocalized в нейронах, выра?...

Обсуждение

Здесь мы представили метод для оценки влияния оптогенетической стимуляции нейронов с особыми химическими идентичностями на состояние переходов сна / бодрствования и дал пример манипуляции ГАМК^BNST нейронов. Наши данные показали, что оптогенетическое возбуждение нейронов ГАМК^...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x1 Fiber-optic Rotary Joints	Doric	FRJ 1x1 FC-FC	for optogenetics
6-pin header	KEL corporation	DSP02-006-431G
6-pin socket	Hirose	21602X3GSE
A/D converter	Nippon koden	N/A	Analog to digital converter
AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP			3.70×1013(genomic copies/ml)
AAV10-EF1a-DIO-EYFP			5.82×1013(genomic copies/ml)
Ampicillin	Fuji film	014-23302
Amplifier	Nippon koden	N/A	for EEG/EMG recording
Anesthetic vaporizer	Muromachi	MK-AT-210D
Automatic injecter	KD scientific	780311
Carbide cutter	Minitor	B1055	φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor
Cyanoacrylate adhesion  (Aron alpha A) and acceleration	Konishi	#30533
Dental curing light	3M	Elipar S10
Epoxy adhesive	Konishi	#04888	insulation around the solder of 6-pin and shielded cable
Fiber optic patch cord (branching)	Doric	BFP(#)_50/125/900-0.22
Gad67-Cre mice	provided by Dr. Kenji Sakimura		Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele
Hamilton syringe	Hamilton	65461-01
High speed rotary micromotor kit	FOREDOM	K.1070	Used with carbide cutter
Interconnecting sleeve	Thorlab	ADAF1	φ2.5 mm Ceramic
Isoflurane	Pfizer	871119
Laser	Rapp OptoElectronic	N/A	473nm wave length
Laser intesity checker	COHERENT	1098293
Laser stimulator	Bio research center	STO2	reffered as pulse generator in text
Optic fiber with ferrule	Thorlab	FP200URT-CANNULA-SP-JP
pAAV2-rh10	provided by PennVector Core
pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA	Addgene	plasimid # 20296
pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA	provided by Dr. Karl Deisseroth
Patch cord	Doric	D202-9089-0.4	0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint
pHelper	Stratagene
Photocurable dental cement	3M	56846
Serafin clamp	Stoelting	52120-43P
Shielded cable	mogami	W2780	Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording
Sleep recording chamber	N/A	N/A	Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder
Sleep sign software	KISSEI COMTEC	N/A	for EEG/EMG analysis
Slip ring	neuroscience,inc	N/A	for EEG/EMG analysis
Stainless screw	Yamazaki	N/A	φ1.0 x 2.0
Stainless wire	Cooner wire	AS633	0.0130 inch diameter
Stereotaxic frame with digital console	Koph	N/A	Model 940
Syringe needle	Hamilton	7803-05
Vital recorder software	KISSEI COMTEC	N/A	for EEG/EMG recording