ליסטריה דלקת של המוח

Summary

במהלך זיהום, ליסטריה הוא מסוגל לחצות את מחסום הדם - מוח ליישב את המוח. ב פרוטוקול זה, נדגים כיצד להעריך מושבת חיידקים של איברים בעקבות זיהום של עכברים. הליך כדי לבצע כל האיבר זלוף לקביעת ספציפי של חיידקי מספרים ב- parenchyma המוח מסופק.

Abstract

ליסטריה הוא פתוגן חיידקי תאיים, אשר קשורה לעיתים קרובות עם זיהום שמקורם במזון. היכולת של ל' monocytogenes לחצות את מחסום הדם - מוח (BBB) היא בנוגע כמו זה יכול להוביל סכנת חיים דלקת קרום המוח, דלקת קרום המוח. BBB מגן microenvironment למוח את מטבוליטים רעילים שונים של חיידקים פתוגנים נמצאו בדם בעקבות זיהום, לכן תומך המוח הומאוסטזיס. המנגנון שבאמצעותו ל' monocytogenes נוכח הדם חוצה BBB לגרום למוח זיהומים אינם מובנים במלואם, ויש גם חוסר מערכת מודל חזקים ללמוד זיהומים במוח על-ידי monocytogenes ל'. כאן, אנו מציגים מודל זיהום עכבר פשוטות כדי לקבוע אם חיידקים חצו BBB וכדי quantitate את הנטל של חיידקים כי השתלטו על המוח בתוך vivo. בשיטה זו, היו נגועים לווריד ל' monocytogenes וחיות היו מורדמים בצורה אנושית על ידי חשיפה CO₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם. זלוף הלב של בעלי החיים בוצעה לפני קצירת האיברים הנגועים. דם נאסף לפני זלוף, המספר של חיידקים לכל איבר או מ"ל של דם נקבע על ידי ציפוי דילולים של homogenates דם או איברים על פלטות אגר והקים ספירת מספר מושבות. בשיטה זו ניתן ללמוד אינטראקציות קולטן הרומן-ליגנד זיהום של המוח על ידי ל' monocytogenes ולשפר ניתן להתאים בקלות לצורך המחקר של פתוגנים חיידקיים רבים.

Introduction

חיידק גראם חיוביים ליסטריה הוא. חיידק תאיים עיצוב גבות ואחד הכי קטלני המועבר במזון פתוגנים ברחבי העולם. בליעה של ל' monocytogenes שזוהמו מזון יכול להוביל ליסטריוסיס בבני אדם, מחלה פולשנית קשה מיקוד נשים בעיקר בהריון, תינוקות, של אנשים זקנים, וגם immunocompromised¹. Monocytogenes ל' היא בין הגורמים המובילים. למוות חיידק המועבר במזון בארה ב, שיעורי התמותה במקרה של ליסטריוסיס גבוה כמו 20-30%, הגבוה ביותר עבור פתוגנים שמקורם במזון כל². אין חיסון כיום קיימת monocytogenes ל' , היכולת של החיידקים כדי להפיץ ביעילות איברים דיסטלי והמוח מאת לחצות את מחסום הדם - מוח (BBB) עלול להוביל סכנת חיים דלקת קרום המוח ו קולוניזציה של המוח^{3 , 4 , 5 , 6}. דלקת קרום המוח היא בדרך כלל חמורה; בעוד רוב האנשים המקבלים טיפול להתאושש, זיהומים יכול לגרום לסיבוכים רציניים, למשל, נזק מוחי, אובדן שמיעה או ליקויי למידה אצל ילדים. Monocytogenes ל' הוא חזה לקחת בחשבון לפחות 10% של כל קהילה רכשה דלקת קרום המוח ארה ב⁷.

כביש מרכזי עבור הפצת החיידק אל המוח ואל קרומי המוח היא דרך מחזור הדם. חיידקים במחזור הדם במוח מסוגלים לעבור BBB לגרום דלקת המוח. BBB היא מערכת מאוד vascularized מכשול זה מגן על המוח מפני חלקיקים זרים במחזור הדם. תאי אנדותל מהווים שכבה המרפדת את השטח הפנימי של כלי הדם^8,9. בנוסף monocytogenes ל', מספר פתוגנים חיידקיים כגון מנינגוקוקוס, סטרפטוקוקוס pneumoniae, Escherichia coliו Haemophilus influenzae סוג b (Hib) מסוגלים להמדינות המוח על ידי חציית^5,64,3,BBB. עם זאת, כאשר בוחנים את הנטל חיידקי במוח של עכברים נגועים, חשוב לקבוע שאם חיידקים חצו BBB, אחרת הנטל חיידקי במוח עשוי לייצג חיידקים שעדיין נמצאים כלי הדם של המוח. לפיכך, יש צורך perfuse העכברים של כל הדם לפני קביעת המושבה יוצרי יחידות (CFU) של המוח homogenates.

במחקר זה, אנו מתארים ויוו שיטות לבחון ל' monocytogenes זיהום של המוח. בשיטות המתוארות כאן, השתמשנו ל' monocytogenes זן 10403S. Monocytogenes ל' 10403S הוא אחד של זנים המעבדה הנפוצה ביותר ללמוד ליסטריוסיס מערכתית במודל עכבר של זיהום¹⁰. פרוטוקול זה מבוסס על תקן ורידיות ל' monocytogenes ואחריו זלוף של העכברים. קו מיתאר סכמטי של פרוטוקול זיהום בעכברים מוצג באיור1. Monocytogenes ל'-המוח נגוע ואיברים אחרים של עכברים ללא perfused או perfused נאספו וקבעה הנטל איברים חיידקי. שיטות אלה הם שימושיים לא רק בקביעת מושבת חיידקים הכולל של המוח אצל בעלי חיים נגועים, אך יש גם מועיל לקביעת אם חיידקים יש שחדר ה BBB ויוו לתווך הפלישה של המוח. חשוב להדגיש כי פרוטוקול המעבדה זה צריך להתנהל בעקבות התייעצות עם הוועדה אבטחה מוסדיים הרלוונטיים וניהול מתקן חיה.

Protocol

כל בעלי החיים הם תוחזקה מטופלים בזהירות מירבית כדי למזער את אי נוחות במהלך ההליך. הנוהל הוא אמור להתנהל בהתאם חיה מוסדיים אכפת. שימוש הוועדה ואת כל חוקי הפדרלי, המדינה והמקומיים. שימו לב גם כי הניסויים מעבדה הם להתנהל על פי הנחיות אבטחה ברמה 2.

1. גידול של ל' monocytogenes ללימודי זיהום העכבר

1. אוטוקלב 500 מ"ל של המוח הלב אינפוזיה (BHI) בינוני אגר בבקבוקון Erlenmeyer 1 ליטר להכין מדיה מלאים צלחות. לאפשר התקשורת מגניב באמבט מים 56 ° C ולאחר מכן להוסיף סטרפטומיצין-ריכוז סופי של 100 µg/mL.
   1. שופכים 25 מ של מדיה/צלחת פטרי לתוך צלחות פטרי. לאפשר את הצלחות לייבוש בטמפרטורת החדר (22 ^oC-25 ° C). במידת הצורך, ניתן לייבש את הצלחות ב 37 ° C עד יבש לחלוטין.
2. באמצעות לולאה לחסן סטרילי הטכניקה aseptic, להשיג לולאה מלא של קפואים ל' monocytogenes זן 10403S^11,12 מתרבות מניות קפוא גליצרול מדיה פלוס 30% BHI ולשמור במקפיא-80 ° C.
   1. רצף ל' monocytogenes על אגר/סטרפטומיצין BHI צלחת כזאת מושבות חיידקים יחיד ניתן לבודד. מקם את הצלחות חממה 37 º C למשך הלילה (18 h ל 24 שעות) לגדול המושבות monocytogenes ל' .
   2. באמצעות לולאה לחסן סטרילי, לבחור אחת ל' monocytogenes המושבה של אגר BHI צלחת, לחסן את המושבה לתוך מבחנה סטרילית המכיל 5 מ ל מרק BHI המכיל סטרפטומיצין µg/mL 100.
3. הצינור תרבות monocytogenes ל' מוטה מעט ב 30 מעלות לילה בחממה סטטי דגירה.
   1. למחרת, בדוק חזותית התרבות monocytogenes ל' עבור צמיחה (התקשורת BHI יהיו עכורים) ו מערבולת בקצרה כדי להבטיח השעיה אחיד של התרבות.
   2. גילוח ורחיצה כירורגית להסיר aliquot של 1 מ"ל של התרבות חיידקי ולמדוד את הצפיפות האופטית-600 nm (OD₆₀₀) באמצעות ספקטרופוטומטרים.
      הערה: ציר סטרילי BHI משמש הריק ספקטרופוטומטרים קריאה לפני מדידת צפיפות אופטית של התרבות monocytogenes ל' . גם יכול להיות מדולל התרבות monocytogenes ל' (שניים עד פי חמישה) ב- BHI לפני קריאת הצפיפות האופטית.
   3. לקבוע מספר ל' monocytogenes המושבה ויוצרים יחידות (CFU) לכל מיליליטר BHI התרבות על ידי ציפוי דילולים טורי 10-fold של התרבות. פעולה זו שימושית ליצור מערכת יחסים בין הצפיפות האופטית של התרבות ל' monocytogenes ואת המספר של חיידקים לכל מ"ל של תרבות. באופן כללי, יתר₆₀₀ של 1.0 ל' monocytogenes תרבות שווה כ – עונה 1 פרק 10⁹ CFU של חיידקים לכל mL.

2. הכנה של ל' monocytogenes זיהום של עכברים

1. שמונה עשרה עד עשרים וארבע שעות לפני זיהום בעלי חיים, לגדול תרבויות ל' monocytogenes BHI מרק המכיל סטרפטומיצין µg/mL 100 ולקבוע את יתר₆₀₀/ ~ CFU לכל מ"ל כפי שמצוין בשלב 1.
   הערה: בדרך כלל מסודרות שבוע אחד לפני זיהום ועכברים הם שאמבטיה למתקן בעלי חיים לפני זיהום מחקרים מבוצעים. במחקר זה, 6-8 שבועות ישנים הנשי BALB/c (5 עכברים לכל קבוצה) שוכנו בסביבה מכשול במתקן הבלימה בעלי חיים ברמת BSL2 הספר לרפואה בהרווארד ועכברים סיפק מזון ומים ad libitum.
2. לקבוע את כמות תרבות ל' monocytogenes הנדרש כדי להדביק את כל עכבר על בסיס ~ CFU לכל מיליליטר התרבות חיידקי. מבצע לדילול של התרבות monocytogenes ל' ב סטרילי באגירה פוספט מלוחים pH 7.2 (PBS) הריכוז המתאים של חיידקים. עכברים נגועים בדרך כלל דרך הווריד עם µL 200 ל- PBS המכיל 1 – 2 × 10⁴ CFU של חיידקים חיים.
3. לאמת את המספר של ל' monocytogenes inoculum על ידי ציפוי דילולים טורי 10-fold על גבי פלטות אגר BHI המכיל סטרפטומיצין µg/mL 100. דגירה הצלחות בחממה 37 ° C בלילה כדי לקבוע את מספר ל' monocytogenes מחוסן לכל העכבר כדלקמן:
   Inoculum (CFU) = (מספר מושבות x פקטור דילול) / mL מצופה x נפח (mL) מוזרק

3. זיהום של עכברים עם ל' monocytogenes דרך וריד הזנב לעירוי הזרקה

1. להסיר את הארגזים המכסה ומזון מן הכלוב המכיל העכברים, ולמקם את הכלוב תחת מנורת חימום אינפרא-אדום 250 W במשך 5 דקות.
   הערה: שיטה זו מאפשרת את הוורידים הזנב להתרחב, המבטיח כי זריקות הם קל יותר לבצע.
   1. בזהירות המקום החיה עכבר בגודל מתאים הרחקה התקן לרסן את החיה בשלום במהלך זריקות וריד הזנב.
2. לערבב את inoculum monocytogenes ל' (שלב 2.2), לטעון את inoculum לתוך מזרק 1 מ"ל מצויד עם מחט 26 גרם.
3. לאתר וריד הזנב לרוחב של העכבר ולנקות ההזרקה בעזרת כרית אלכוהול או אתנול 75% תרסיס צבע.
4. בעדינות להחדיר את העכבר µL 200 של ההשעיה ל' monocytogenes לתוך וריד הזנב לרוחב באמצעות המזרק עם המחט 26 גרם.
   1. השתמש גאזה כותנה בקצרה שתלחצי על ההזרקה לעצור דימום, ולמקם החיה בתוך כלוב חדש.
      הערה: לבצע תהליך זה עבור כל העכברים כדי להיות מוזרק ולסמן את הכלוב עם תוויות המתאימים. כדי לקבוע ריכוז inoculum ל' monocytogenes שלאחר ההזרקה, חזור על שלב 2.3 באמצעות את הסכום הנותר של inoculum. ורידי monocytogenes ל' inoculum זיהום לכל העכבר הוא דיווח הנמדדת CFU הממוצע בין דגימות inoculum מראש, שלאחר הזרקת.
5. לפקח על חיות נגועות מדי יום ורשום סימנים עבירה של המחלה (למשל, רפלד פרווה, הכפוף יציבה, תנועה איטית, ירידה במשקל). הסר את החיות המופיעות כדי להיות משמעותי אדעך לפני 72 שעות לאחר הפגיעה (למשל, 24, 48 שעות לאחר הפגיעה) מן המחקר ולהקריב בצורה הומאנית. המשך פיקוח יומי עד כל בעלי החיים הנותרים הם הקריבו-72 שעות לאחר הפגיעה.
   הערה: מנה קטלנית 50% (LD₅₀) לזן monocytogenes ל' 10403S בעכברים BALB/c הוא ~ 1-2 x 10⁴ CFU/חיה. עכברים נגועים עם LD₅₀ מנות של ל' monocytogenes באמצעות פרוטוקול זה עשוי להפגין סימני מחלה, כמצוין לעיל, חוקרים יכולים לצפות העכברים להתחיל להיכנע הזיהום לאחר 72 שעות לאחר הפגיעה.

4. ניתוח ואת הלב זלוף של עכברים נגועים monocytogenes ל'

1. ב- 72 שעות לאחר הפגיעה (או בנקודת הזמן הרצויים קודם לכן), המתת חסד העכברים הנגועים באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי המוסדיים חיה ועדת האתיקה, כגון CO₂ חנק ואחריו נקע בצוואר הרחם.
   הערה: אם איסוף דם נמצא שיבוצע, למזער קריעה של כלי הדם תוך כדי ביצוע נקע בצוואר הרחם.
   1. אשר יש כבר מורדמים עכברים בגלל היעדר תגובה כפת-עווית.
      הערה: אם זלוף הלב נמצא שיבוצע, להגדיר את מערכת משאבת אוטומטיות/זלוף בספיקה של נפח 4 mL/min.
2. במקום החיה על גבו במחבת לנתיחה ולהחיל 75% אתנול על פני פרווה/עור הבטן.
3. בעזרת מספריים, אעשה חתך בדופן הבטן ולהרחיב את החתך עד מתחת כלוב הצלעות.
4. לחשוף את הסרעפת ואת האיברים מהבטן.
   הערה: יש להיזהר לא lacerate כל האיברים מהבטן.
5. פתח את חלל בית החזה על ידי חיתוך הסרעפת וחותכים את כלוב הצלעות בשני הצדדים כדי לחשוף את החדר השמאלי של הלב.
6. בעזרת מלקחיים בוטה, לאחוז בעדינות את הלב ואת הוספה מחט פרפר 21 G מחובר למערכת זלוף לתוך החדר השמאלי ולאחר מכן לחתוך בזהירות אטריום ימין כדי לאסוף את הדם (~0.2 מ"ל) לתוך צינור 2 מ"ל המכיל 10 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) כדי למנוע קרישה. תרשים כללי של הלב זלוף העכבר מוצג באיור2.
   הערה: אם זלוף אין אפשרות לבצע, דם עשוי שנאספו על ידי ניקוב הלב באמצעות מזרק 1 מ"ל, הועבר במהירות לתוך צינור 2 מ"ל המכיל 10 מ מ EDTA כדי למנוע קרישה. Monocytogenes ל' -נגוע איברים נקצרים מכן כשלב המתואר (5.1).
7. להתחיל זלוף, perfuse החיה במשך 4 דקות עם 15-20 מ"ל של PBS המכיל 10 מ מ EDTA.
   הערה: להעריך זלוף על ידי התבוננות את הדם ואת הפתרון PBS-EDTA זורם דרך אטריום ימין ועל לתוך המחבת לנתיחה. המוח ואת הכבד יופיעו blanched לאחר זלוף מלאה המבטיח כי החיידקים הנותרים הם מן האברים שנקטפו לא במחזור הדם.

5. קצירת האיברים והנחישות של חיידקי בנטל

1. זלוף הבאים, קציר האיברים (למשל, כבד, טחול) על-ידי הסרת בקפידה כל להערכת והרצועות מצורף ולמקם את האיברים בנפרד לתוך צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל המכיל 5 מיליליטר קר סטרילי (4 ° C) PBS. לאחסן דגימות הקרח עד לביצוע עיבוד נוסף.
2. הקציר המוח, לערוף את הראש מאחורי האוזניים באמצעות מספריים וחותכים עור הקרקפת שביניהם. עיניים של החיה למטה האמצע. אם נדרש, לחתוך עודף רקמת לשמור את המספריים נלחץ כנגד הגולגולת.
   1. בעדינות להכניס אחד קצה המספריים מאגנום נקב (החור בבסיס הגולגולת שדרכם עובר חוט השדרה), לחתוך רוחבית לתוך הגולגולת משני הצדדים.
   2. בעדינות לחתוך הגולגולת שביניהם העיניים מכרסם למטה האמצע, הקפד להפעיל לחץ לרוחב. להימנע ההפרעות של המוח ולשמור על קשר מינימלי בין על רקמת המוח את המספריים.
   3. בעזרת מלקחיים עצה בסדר, לפתוח את הגולגולת כדי לחשוף את המוח מקום מרית בין החלק התחתון של המוח בבסיס הגולגולת כדי להסיר את המוח.
      הערה: התוצאה קריעת סיבי עצב במוח.
   4. להעביר בזהירות המוח צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ של PBS קר סטרילי.
   5. למחוק את הגווייה העכבר, חזור על שלבים אלה עבור בעלי החיים הנותרים.
      הערה: לאחר כל האיברים הפנימיים נקצצו, לנקות את האזור הליך ולהתכונן המגון איברים לקבוע נטל חיידקי.
3. לנקות ולחטא את קצה מהמגן רקמות להציב אבטחה הקבינט על-ידי הוספת הטיפ והפעלת את מהמגן עבור 10 s ברצף בתוך 5% מלבין, במים סטריליים, 75% אתנול, סטרילי מים כל הכלול צינור חרוטי נפרד 15 מ"ל.
4. Homogenize המוח נגוע (~ 20 s על הגדרת סל ד 6, מקסימום) בצינור 15 מ"ל חרוט עד אין שברי רקמת גלוי להישאר.
   1. נקי מהמגן כפי שמתואר בשלב 5.3 כדי למנוע בקטריאלי לשאת על זיהום לדגימת האיבר הבא.
   2. בצע תהליך המגון עבור כל האיברים האחרים (למשל, הכבד, הטחול).
   3. עם סיום תהליך המגון, לנקות את מהמגן כפי שמתואר בשלב 5.3 וחנות עד להמשך השימוש.
5. להכין דילולים טורי 10-fold של homogenates איברים ב- PBS סטרילי, צלחת של דילולים על פלטות אגר/סטרפטומיצין BHI כדי לקבוע את CFU לכל איבר.
   הערה: שיטה דומה מבוצעת כדי לקבוע את CFU לכל מיליליטר דם.
   1. לאחר דילולים כל הם מצופים, להעביר את הצלחות חממה 37 ° C בין לילה.
   2. למחרת, לספור את מספר מושבות שהלוח כדי לקבוע את המספר הכולל של חיידקים לכל איבר או מ"ל של דם כדלקמן:
      CFU/איבר = (מספר מושבות x פקטור דילול) / מ של homogenate מצופה x 5
      CFU/מ"ל של דם = (מספר מושבות x פקטור דילול) / מ"ל של דם מצופה

תוצאות

המוח הוא מאוד vascularized וידוע monocytogenes ל' כדי להדביק את סוגי תאים הנמצאים בדם^3,13. הפרוטוקול המתואר משמש כדי להפגין את היכולת של ל' monocytogenes לחצות את מחסום הדם - מוח (BBB) מובילים לזיהום במוח בעכברים. כדי לקבוע אם חיידקים חצו ה BBB- ויוו, ז?...

Discussion

Monocytogenes ל' הוא מסוגל לגרום סכנת חיים meningoencephalitis בני אדם. מחקרים קודמים הראו את היכולת של חיידקים לחצות את-מחסום הדם המוח-(BBB) ליישב את המוח. שלושה מסלולים הפלישה למוח. הוצעו במהלך זיהום: ישיר חדירה של BBB על ידי חיידקים, התגנבות תעבורה על-ידי חיידקים הכלול בתוך תאי תאי³והעברה ע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Heart Infusion media	Becton Dickinson	237200
Streptomycin sulfate	Amresco	0382-50G
Petri dishes	VWR	25384-342
Glycerol	VWR	97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer	IKA	3352109	Model: T18BS1
Spectrophotometer	Beckman Coulter	DU 800 series
BALB/c mice	Jackson Laboratory	Model #000651
1 mL syringes	Becton Dickinson	309659
26 G needles	Becton Dickinson	305115
21 G butterfly needles	Becton Dickinson	367281
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	60004
15 mL conical tubes	VWR	21008-918
Round-bottom test tubes	VWR	60819-546
Phosphate-buffered saline	Corning	46-013-CM
Stainless steel spatula	VWR	82027-520
Stainless steel scissors (6.5 in)	VWR	82027-592
Stainless steel scissors (4.5 in)	VWR	82027-578
Stainless steel blunt forceps  (4.5 in)	VWR	82027-440
Stainless steel fine tip forceps  (6 in)	VWR	82027-406