Listeria monocytogenes Infection du cerveau

Résumé

Au cours de l’infection, Listeria monocytogenes est capable de traverser la barrière hémato - encéphalique pour coloniser le cerveau. Dans ce protocole, nous démontrons comment évaluer la colonisation bactérienne des organes suite à une infection de la souris. Une procédure pour effectuer la perfusion des organes entiers pour la détermination précise du nombre de bactéries dans le parenchyme du cerveau est prévue.

Résumé

Listeria monocytogenes est un bactérie pathogène intracellulaire qui est fréquemment associé à une infection d’origine alimentaire. La capacité de L. monocytogenes de franchir la barrière sang - encéphalique (BHE) est relative car elle peut conduire à la méningite et l’encéphalite mortelle. Le BBB protège le microenvironnement de cerveau de divers métabolites toxiques et agents pathogènes microbiens dans le sang suite à une infection et souscrit donc l’homéostasie du cerveau. Les mécanismes par lesquels L. monocytogenes présents dans le sang traverser la BHE provoque le cerveau les infections ne sont pas totalement comprises, et il y a aussi un manque d’un système robuste de modèle pour étudier les infections cérébrales par L. monocytogenes. Nous présentons ici un modèle d’infection de souris simple pour déterminer si les bactéries ont traversé la BHE et quantifier le fardeau des bactéries qui ont colonisé le cerveau in vivo. Dans cette méthode, les animaux étaient infectés par voie intraveineuse par L. monocytogenes et ont été euthanasiés humainement par l’exposition au CO₂ suivi par dislocation cervicale. La perfusion cardiaque des animaux a été réalisée avant la récolte d’organes infectés. Sang a été prélevé avant la perfusion et le nombre de bactéries par organe ou mL de sang a été déterminée par l’ensemencement de dilutions des homogénats sur plaques de gélose sang ou d’organe et compter le nombre de colonies formées. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les interactions ligand-récepteur roman qui améliorent une infection du cerveau par L. monocytogenes et peuvent être facilement adapté pour l’étude de plusieurs bactéries pathogènes.

Introduction

La bactérie Gram-positive de Listeria monocytogenes est un pathogène intracellulaire facultatif et l’un des plupart pathogènes d’origine alimentaire mortelle dans le monde entier. Ingestion d’aliments de L. monocytogenes contaminés peut conduire à la listériose chez l’homme, une grave maladie invasive ciblant les femmes enceintes pour la plupart, les nouveau-nés, les personnes âgées et immunodéprimées¹. L. monocytogenes est parmi les principales causes de décès par un pathogène d’origine alimentaire aux États-Unis et les taux de létalité de listériose sont aussi hautes que 20 à 30 %, le plus élevé de tous les pathogènes d’origine alimentaire². Aucun vaccin n’existe actuellement pour L. monocytogenes et la capacité des bactéries à diffuser efficacement aux organes distales et le cerveau en traversant la barrière sang - encéphalique (BHE) peut conduire à la méningite mortelle et la colonisation du cerveau^{3 , 4 , 5 , 6}. la méningite bactérienne est habituellement sévère ; Bien que la plupart des gens qui reçoivent un traitement rétablissent, infections peuvent entraîner des complications graves, par exemple, des dommages au cerveau, une perte auditive ou des troubles d’apprentissage chez les enfants. L. monocytogenes est prédit pour en tenir compte au moins 10 % de toutes les communauté acquis méningite dans le US⁷.

Une importante voie de diffusion bactérienne dans le cerveau et les méninges est par le biais de la circulation sanguine. Les bactéries qui circulent dans les vaisseaux sanguins dans le cerveau sont capables de traverser la BHE pour causer une infection du cerveau. Le BBB est un système de barrière fortement vascularisé qui protège le cerveau contre les particules étrangères circulant dans le sang. Les cellules endothéliales constituent une couche qui tapisse la surface interne des vaisseaux sanguins^8,9. En plus de L. monocytogenes, plusieurs bactéries pathogènes tels que Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coliet Haemophilus influenzae type b (Hib) sont capables de coloniser le cerveau en traversant la BBB^3,4,5,6. Toutefois, lors de l’examen des charges bactériennes dans le cerveau des souris infectées, il est important de déterminer que si les bactéries ont traversé la BHE, autrement la charge bactérienne dans le cerveau peut-être représenter des bactéries qui se trouvent encore dans les vaisseaux sanguins du cerveau. Ainsi, il est nécessaire de perfuse les souris de tout le sang avant de déterminer les unités formant colonie (UFC) d’homogénats de cerveau.

Dans cette étude, nous décrivons les méthodes in vivo pour examiner L. monocytogenes infection du cerveau. Les méthodes décrites ici, nous avons utilisé la souche 10403S de L. monocytogenes . L. monocytogenes 10403S est une des souches plus largement utilisés en laboratoire pour étudier la listériose systémique chez la souris de l’infection par¹⁰. Ce protocole est basé sur l’injection intraveineuse standard de L. monocytogenes , suivie d’une perfusion des souris. Une ébauche de plan du protocole infection chez la souris est illustré à la Figure 1. L. monocytogenes-cerveaux infectés et autres organes des souris non perfusés ou perfusés ont été prélevés et la charge bactérienne organe déterminé. Ces méthodes sont utiles pour déterminer non seulement la colonisation bactérienne totale du cerveau chez les animaux infectés, mais sont aussi bénéfiques pour déterminer si les bactéries ont pénétré le BBB en vivo de médiation invasion du cerveau. Il est important de souligner que ce protocole de laboratoire devrait être effectué à l’issue d’une consultation avec l’infogérance Comité et animal de biosécurité institutionnels pertinents.

Protocole

Tous les animaux doivent être entretenus et manipulés avec grand soin afin de minimiser l’inconfort au cours de la procédure. La procédure doit être effectuée dans le respect de toutes les lois fédérales, provinciales et municipales et Comité de l’emploi et l’institutionnel animalier. Notez également que les expériences de laboratoire doivent être effectués conformément aux lignes directrices sur la biosécurité de niveau 2.

1. la croissance de L. monocytogenes pour les études d’Infection de souris

1. Autoclave 500 mL de milieu gélosé perfusion cérébrale du coeur (BHI) dans une fiole d’Erlenmeyer de 1 L pour préparer des plaques des milieux solides. Autoriser les médias à refroidir dans un bain d’eau de 56 ° C et ensuite ajouter streptomycine à une concentration finale de 100 µg/mL.
   1. Verser 25 mL de médias/boîte de Pétri en boîtes de Pétri. Laisser les plaques à sécher à température ambiante (22 ^oC-25 ° C). Si nécessaire, les plaques peuvent être séchés à 37 ° C jusqu'à ce que complètement sec.
2. À l’aide d’une anse d’inoculation stérile et l’asepsie, obtenir une boucle complète de surgelés L. monocytogenes souche 10403S^11,12 d’une culture de stocks congelée en glycérol de médias, plus 30 % BHI et maintenir dans un congélateur à-80 ° C.
   1. Rayure sur plaque de la L. monocytogenes sur une gélose BHI/streptomycine tels que les colonies bactériennes individuelles peuvent être isolés. Placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit (18 h à 24h) pour développer les colonies de L. monocytogenes .
   2. À l’aide d’une anse d’inoculation stérile, choisir une seule colonie de L. monocytogenes de la gélose BHI sur plaque et ensemencer la colonie dans un tube à essais stérile contenant 5 mL de bouillon BHI contenant 100 µg/mL de streptomycine.
3. Incuber le tube de la culture de L. monocytogenes légèrement incliné à 30 ° du jour au lendemain dans un incubateur statique.
   1. Le lendemain, vérifiez visuellement la culture de L. monocytogenes pour la croissance (les médias BHI sera troubles) et vortex brièvement pour assurer une suspension uniforme de la culture.
   2. Enlever une portion de 1 mL de la culture bactérienne de façon aseptique et mesurer la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) à l’aide d’un spectrophotomètre.
      NOTE : Bouillon BHI stérile est utilisé comme le blanc pour le spectrophotomètre lecture avant de mesurer la densité optique de la culture de L. monocytogenes . La culture de L. monocytogenes peut également être diluée (deux à cinq fois) en BHI avant la lecture de la densité optique.
   3. Déterminer le nombre de L. monocytogenes unités formant colonies (UFC) par millilitre de culture BHI en ensemençant des dilutions en série 10 fois de la culture. C’est utile d’établir une relation entre la densité optique de la culture de L. monocytogenes et le nombre de bactéries / mL de culture. En général, une OD₆₀₀ de 1,0 pour une culture de L. monocytogenes est égale à environ 1 x 10⁹ UFC de bactéries / mL.

2. préparation de L. monocytogenes Infection of Mice

1. Dix-huit à vingt-quatre heures avant l’infection animale, cultiver des cultures de L. monocytogenes dans un bouillon BHI contenant 100 µg/mL de streptomycine et déterminer l' OD₆₀₀/ ~ UFC / mL comme indiqué dans l’étape 1.
   Remarque : Les souris sont généralement classés en une semaine avant l’infection et sont acclimatés à l’animalerie avant l’infection, les études sont réalisées. Dans cette étude, 6 – 8 semaines vieilles femelles BALB/c (5 souris par groupe) ont été logés dans un environnement de barrière dans l’installation de confinement animal de Harvard Medical School BSL2-niveau et fourni nourriture et eau ad libitum.
2. Déterminer la quantité de la culture de L. monocytogenes pour infecter chaque souris basée sur le ~ UFC / mL de culture bactérienne. Réaliser une dilution de la culture de L. monocytogenes dans stérile tampon phosphate salin pH 7,2 (PBS) à la concentration appropriée de bactéries. Souris sont généralement infectés par voie intraveineuse avec 200 µL de PBS contenant 1 à 2 × 10⁴ UFC de bactéries/animal.
3. Vérifiez le nombre de L. monocytogenes dans l’inoculum en ensemençant des dilutions sériées 10 fois sur plaques de gélose BHI contenant 100 µg/mL de streptomycine. Incuber les boîtes dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit pour déterminer le nombre de L. monocytogenes inoculés par souris comme suit :
   Inoculum (CFU) = (nombre de colonies x facteur de dilution) / mL plaquée x volume (mL) injecté

3. infection des souris atteintes de L. monocytogenes via une Injection intraveineuse queue veine

1. Enlever les bacs à couvercle et de l’alimentation de la cage contenant les souris et placez la cage sous une lampe de chaleur infrarouge 250 W pendant 5 min.
   Remarque : Cette méthode permet les veines de queue à se dilater, veiller à ce que les injections sont plus faciles à réaliser.
   1. Placer soigneusement l’animal chez une souris de taille appropriée contention périphérique pour freiner en toute sécurité l’animal pendant les injections de veine de queue.
2. Mélanger l’inoculum de L. monocytogenes (étape 2.2) et charger l’inoculum dans une seringue de 1 mL équipée d’une aiguille de 26 G.
3. Localiser une veine latérale de queue de la souris et nettoyer le site d’injection à l’aide d’un tampon d’alcool ou un spray d’éthanol 75 %.
4. Injecter doucement la souris 200 µL de la suspension de L. monocytogenes dans une veine de queue latéral à l’aide de la seringue avec l’aiguille de 26 G.
   1. Gaze de coton permet d’appuyer brièvement sur le site de l’injection d’arrêter tout saignement et placer l’animal dans une cage de nouveau.
      Remarque : Effectuer ce processus pour toutes les souris à doser et marquer la cage avec des étiquettes appropriées. Pour déterminer la concentration après l’injection de l’inoculum de L. monocytogenes , répétez l’étape 2.3 à l’aide de la somme restante de l’inoculum. La voie intraveineuse inoculum infection par L. monocytogenes par souris est signalée comme l’UFC moyenne mesurée à partir des échantillons d’inoculum avant et après l’injection.
5. Surveiller les animaux infectés tous les jours et de noter les signes évidents de maladie (p. ex., hérissé de fourrure, posture voûtée, mouvement lent, perte de poids). Enlever les animaux qui semblent être significativement moribonde avant 72 h après l’infection (p. ex., 24, 48 h après l’infection) de l’étude et humainement sacrifier. Continuer à suivre tous les jours jusqu'à ce que tous les autres animaux sont sacrifiés à l’infection après 72 h.
   Remarque : La dose létale 50 % (DL₅₀) pour la souche 10403S de L. monocytogenes chez des souris BALB/c est ~ 1 – 2 x 10⁴ UFC/animal. Chez des souris infectées avec des doses de₅₀ LD de L. monocytogenes utilisant ce protocole peuvent montrer des signes de la maladie, comme indiqué plus haut, et les enquêteurs pouvaient s’attendre aux souris pour commencer à succomber à l’infection suite à une infection après 72 h.

4. dissection et la Perfusion cardiaque de souris infectées par L. monocytogenes

1. Infection après 72 h (ou à un point plus tôt la durée souhaitée), euthanasier les souris infectées à l’aide d’un protocole approuvé par le Comité d’éthique animale institutionnels, comme le CO₂ asphyxie suivie par dislocation cervicale.
   Remarque : Si le prélèvement de sang doit être effectuée, minimiser la déchirure des vaisseaux sanguins tout en effectuant la dislocation cervicale.
   1. Confirmer la souris ont été euthanasiés par l’absence d’une réponse de patte-secousse.
      Remarque : Si la perfusion cardiaque doit être faite, mis en place un système de pompe/perfusion automatisée à un débit de 4 mL volume/min.
2. Placez l’animal sur le dos dans une casserole de dissection et d’appliquer d’éthanol 75 % sur la surface de la peau abdominale/fourrure /.
3. À l’aide de ciseaux, faire une incision dans la paroi abdominale et développez l’incision pour juste en dessous de la cage thoracique.
4. Exposer le diaphragme et les organes viscéraux.
   Remarque : Veillez à ne pas lacérer les organes viscéraux.
5. Ouvrir la cavité thoracique en coupant la membrane et couper la cage thoracique au niveau bilatéral pour exposer le ventricule gauche du cœur.
6. Avec une pincette émoussé, saisir doucement le cœur et insérer une aiguille à ailettes 21 G connecté à un système de perfusion dans le ventricule gauche et puis découpez soigneusement l’oreillette droite pour collecter le sang (~0.2 mL) dans un tube de 2 mL contenant 10 mM EDTA acide (EDTA) pour éviter la coagulation. Un diagramme schématique de la perfusion cardiaque chez la souris est illustré à la Figure 2.
   Remarque : Si perfusion ne doit ne pas être jouée, sang peut-être être prélevé par ponction cardiaque à l’aide d’une seringue de 1 mL et rapidement transférée dans un tube de 2 mL contenant 10 mM EDTA pour éviter la coagulation. L. monocytogenes -infecté organes sont ensuite récoltées comme décrit (étape 5.1).
7. Commencer la perfusion et perfuse l’animal pendant 4 min avec 15 à 20 mL de PBS contenant 10 mM EDTA.
   NOTE : Évaluer la perfusion en observant le sang et la solution de PBS-EDTA qui coule à travers l’oreillette droite et dans le plateau de dissection. Le cerveau et le foie apparaîtra blanchies après perfusion complete garantissant que les bactéries restantes proviennent des organes récoltées et pas la circulation sanguine.

5. organes et détermination des charges bactériennes

1. Suivant la perfusion, organes de récolte (par exemple, foie, rate) en enlevant soigneusement toute vascularisation et ligaments attachés et placer les organes séparément dans un tube conique stérile de 15 mL contenant 5 mL de stérile froid (4 ° C) PBS. Conserver les échantillons sur la glace jusqu'à ce que le traitement ultérieur se produit.
2. De récolter le cerveau, décapiter la tête derrière les oreilles à l’aide de ciseaux et couper la peau du cuir chevelu entre les deux yeux de l’animal vers le bas de la ligne médiane. Si nécessaire, couper les excès de tissu gardant les ciseaux pressées contre le crâne.
   1. Doucement, insérez un bout des ciseaux dans le foramen magnum (trou à la base du crâne par lequel passe la moelle épinière) et coupez latéralement dans le crâne des deux côtés.
   2. Doucement couper le crâne entre les deux yeux du rongeur vers le bas de la ligne médiane, en veillant à appliquer une pression latérale. Éviter la perturbation du cerveau et de maintenir des liens minimaux entre le tissu cérébral et les ciseaux.
   3. À l’aide de pinces à pointe fine, ouvrir le crâne pour exposer le cerveau et placer une spatule entre le dessous du cerveau et de la base du crâne pour retirer le cerveau.
      Remarque : Cela se traduit par la déchirure des fibres nerveuses cérébrales.
   4. Transvaser avec soin le cerveau d’un tube conique 15 mL contenant 5 mL de solution de PBS stérile froide.
   5. Jeter la carcasse de la souris et répétez ces étapes pour les animaux restants.
      Remarque : Une fois que tous les organes ont été récoltés, nettoyer la zone de la procédure et se préparer à l’homogénéisation de l’orgue déterminer les charges bactériennes.
3. Nettoyer et stériliser la pointe d’un homogénéisateur de tissu placé dans une biosécurité armoire en insérant la pointe et en exécutant l’homogénéisateur pour 10 s dans l’ordre de 5 % d’eau de Javel, eau stérile, 75 % d’éthanol, d’eau stérile chaque contenu dans un tube conique distinct de 15 mL.
4. Homogénéiser le cerveau infecté (~ 20 s sur réglage 6, tr/min maxi) dans le tube de 15 mL conique jusqu'à ce qu’aucun fragment de tissu visible.
   1. Nettoyer l’homogénéisateur, comme indiqué au point 5.3, pour empêcher les bactéries portent sur la contamination de l’échantillon d’organe suivant.
   2. Effectuer le processus d’homogénéisation pour tous les autres organes (par exemple, foie, rate).
   3. Une fois terminé le processus d’homogénéisation, nettoyer l’homogénéisateur tel que décrit dans l’étape 5.3 et magasin avant réutilisation.
5. Préparer des dilutions 10 fois des homogénats orgue dans du PBS stérile et plaque les dilutions sur plaques de gélose/streptomycine BHI pour déterminer l’UFC / orgue.
   Remarque : Une méthode similaire est effectuée pour déterminer l’UFC / mL de sang.
   1. Après que toutes les dilutions sont plaquées, transférer les plaques dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
   2. Le lendemain, compter le nombre de colonies sur chaque plaque pour déterminer le nombre total de bactéries par organe ou mL de sang comme suit :
      UFC/orgue = (nombre de colonies x facteur de dilution) / mL d’homogénat plaqué x 5
      UFC/mL de sang = (nombre de colonies x facteur de dilution) / mL de sang plaquée

Résultats

Le cerveau est fortement vascularisé et L. monocytogenes est connu pour infecter les types de cellules présents dans le sang^3,13. Le protocole décrit est utilisé pour démontrer la capacité de L. monocytogenes de franchir la barrière sang - encéphalique (BHE) conduisant à l’infection du cerveau chez la souris. Pour déterminer si les bactéries ont traversé le BBB en vivo, perfusion de sang ch...

Discussion

L. monocytogenes est capable de provoquer une méningo-encéphalite mortelle chez les humains. Des études antérieures ont démontré la capacité des bactéries à traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) et de coloniser le cerveau. Trois voies d’invasion du cerveau ont été proposées au cours de l’infection : direct pénétration du BBB par des bactéries, stealth transport de bactéries contenues à l’intérieur des cellules mononucléaires³et migration axonale par ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Heart Infusion media	Becton Dickinson	237200
Streptomycin sulfate	Amresco	0382-50G
Petri dishes	VWR	25384-342
Glycerol	VWR	97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer	IKA	3352109	Model: T18BS1
Spectrophotometer	Beckman Coulter	DU 800 series
BALB/c mice	Jackson Laboratory	Model #000651
1 mL syringes	Becton Dickinson	309659
26 G needles	Becton Dickinson	305115
21 G butterfly needles	Becton Dickinson	367281
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	60004
15 mL conical tubes	VWR	21008-918
Round-bottom test tubes	VWR	60819-546
Phosphate-buffered saline	Corning	46-013-CM
Stainless steel spatula	VWR	82027-520
Stainless steel scissors (6.5 in)	VWR	82027-592
Stainless steel scissors (4.5 in)	VWR	82027-578
Stainless steel blunt forceps  (4.5 in)	VWR	82027-440
Stainless steel fine tip forceps  (6 in)	VWR	82027-406