JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול על הדרכת אוכלוסיה התא באמצעות גירויים חשמליים ומכניים הדמיית פיזיולוגיה של הלב. גירוי מכאני חשמלי זה משפר את הפוטנציאל cardiomyogenic של תאים שטופלו, אסטרטגיה מבטיח טיפול בתאי נוספת, מידול המחלה, והתרופות הקרנה.

Abstract

מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה במדינות המפותחות. כתוצאה מכך, הביקוש טיפולים יעילים תא לב יש מוטיבציה חוקרים תאי הגזע והשדות בביו-הנדסה לפיתוח במבחנה אמינות גבוהה האנושי שריר הלב מחקר בסיסי ויישומים קליניים. אולם, פנוטיפ ילדותי של תאי לב היא הגבלה על קבלת רקמות באופן פונקציונלי לחקות מבוגרים שריר הלב, אשר מאופיין בעיקר על ידי אותות מכניים וחשמליים. לכן, המטרה של פרוטוקול זה נועד להכין. ולומדים האוכלוסייה תא היעד באמצעות גירוי מכאני חשמלי, recapitulating פיסיולוגיים. הנדסת רקמות הלב הוא מתפתח לקראת גישות ביולוגיות יותר, אסטרטגיות המבוססת על גירויים biophysical, לפיכך, אתה צובר תאוצה. המכשיר שפותח למטרה זו הוא ייחודי ומאפשר בודדים או בו-זמניים חשמליים ומכניים גירוי, בזהירות מאופיין ואומתו. בנוסף, למרות המתודולוגיה מוטבה זה ממריץ, אוכלוסיה תא ספציפי, זה בקלות ניתן להתאים שורות תאים ומכשירים אחרים. התוצאות כאן מציעים ראיה המחויבות לב מוגברת של האוכלוסייה תא לאחר גירוי מכאני חשמלי. תאים electromechanically מגורה הצג ביטוי מוגבר של סמנים הלב הראשי, כולל גנים מוקדם מבניים, ויסות הסידן. מיזוג התא הזה עשוי להיות שימושי עבור טיפול בתאי משובי נוסף, מידול המחלה תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

Introduction

תפקוד הלב מבוסס על המושבים של עירור חשמלי והתכווצות מכני. בקצרה, צמתי המערכת cardiomyocyte היתר האות החשמלי הפצת לייצר כמעט סינכרונית התכווצויות הלב משאבת הדם מערכתית, דרך מערכת ריאתי. תאי לב, לפיכך, עוברים כוחות חשמליים ומכניים המסדירים ג'ין פונקציה ביטוי וסלולר. בהתאם לכך, קבוצות רבות ניסו לפתח תרבות פלטפורמות המחקים הסביבה פיזיולוגיים לב להבין את התפקיד של גירויים מכניים וחשמליים על התפתחות הלב, הפונקציה ההבשלה. במבחנה חשמליים ומכניים stimulations בנפרד הוחל בהרחבה בהנדסת רקמות הלב לשפר מאפיינים פונקציונליים, להגדיל את התא ההבשלה או לשפר את תא-תא צימוד וסידן טיפול1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. עם זאת, מיזוג אלקטרו-מכאניים סינכרונית נותר מנוצלת בגלל האתגר של פיתוח ממריץ, פרוטוקול, ובשל אופטימיזציה חובה22.

עבודה ראשוני התייחס גירוי מכאני חשמלי כשילוב של גירוי חשמלי זלוף מדיה; עם זאת, הזרם אינו כרוך להרכב מבוסס-זן טיפוסי של מילוי חדרית23,24,25. מאוחר יותר, יותר גישות פיזיולוגיים בשילוב גירויים חשמליים עם דפורמציה פיזי או מתיחה לחקות את isovolumetric התכווצות26,27,28,29,30 ,31. פנג et al. תיאר ההפגנה הראשונה של גירוי מכאני חשמלי בשנת 2005, דיווח משופרת cardiomyocyte גודל ומאפייני כויץ26. וואנג et al. pretreated גזע mesenchymal עם 5-azacytidine והחלת מיזוג חשמליים ומכניים בו זמנית, שיפור recellularization, תא הכדאיות, בידול הלב ואת רקמת שיפוץ27. מאז אותם פרסומים, יש קבוצות יותר דיווחו על גירוי מכאני חשמלי של תאים monolayers או מהונדסים רקמות (למשל, שחור28,29,Vunjak-Novakovic31, קבוצה30) עם תאים ממוזגים הראשון נבדק ויוו30. בקצרה, מורגן ושחור נבדק מספר שילובים של גירויים חשמליים ומכניים, דיווח כי התזמון בין stimulations היה מכריע משום שאיחרו גירוי מכאני חשמלי משולב הניבו את התוצאות הכי טוב28. בשלב הבא, Godier-Furnémont, משתפי פעולה ממוטב פרוטוקול גירוי מכאני חשמלי עבור בונה שריר הלב מהונדסים מתאי הלב עכברוש neonatal, מושגת, בפעם הראשונה, מערכת יחסים של כוח חיובי-תדירות29. לאחר מכן, הקבוצה שלנו דיווחו כי תאי electromechanically preconditioned גדלו הביטוי של סמנים הלב הראשי במבחנה רחבה מועיל אפקטים ויוו, כגון שיפור תפקוד הלב או גדלה צפיפות כלי ב- לאוטם אזור הגבול30. הפרסום האחרון הוכיח כי רקמות הלב מן גזע-תא-derived cardiomyocytes נתון מיזוג אלקטרו-מכאניים הגיעו עם ההבשלה ברמה קרובה להיות אנושית למבוגרים לב מבנה ותפקוד31. בנוסף, פלטפורמות חלופיות גירוי תלת מימדי מהווים פיגומים electroactive המספקים חשמלי, מכני, ומצורפת רמזים הטופוגרפי לתאי32. יתר על כן, דפורמציה מכאנית (תא טפט מתיחה ודחיסה) יכולה להיגרם גם עם אלקטרודות מתיחה מחקה נורמלי בתנאים פיזיולוגיים, כמו גם בתנאים קיצוניים33.

לכן, הרציונל הוא הפריה גירויים אלקטרו-מכאניים בהתבסס על תנאים פיזיולוגיים יכול לשפר את הפוטנציאל cardiomyogenic של תא. אכן, לגירוי הזה יכול להפיק תועלת נוספת שילובים של תאים טיפולית לתוך שריר הלב בתרחיש קליני או להגדיל את רקמת ההבשלה ליישומים סמים-הקרנה.

בנוסף, אנו מבודדים, מאופיין אוכלוסיה של האדם נגזר רקמת שומן ובתאים של הלב מוצא (ATDPCs לב)34. תאים אלה נמצאים השומן epicardial. תאים אלה להציג השפעות מועילות histopathological ופונקציונליים בטיפול של אוטם שריר הלב, גם לתחזק את הלב ואת אנדותל בידול פוטנציאליים. 30 , 35. שיערנו כי יתרונות אלו יגדל לאחר גירוי ביופיזיקלי.

כתוצאה מכך, אנו פיתחה מכשיר משטר גירוי עבור האוכלוסייה תא עניין, חקר את ההשפעות. פרוטוקול זה אלקטרו-מכאניים אסטרטגיה חדשה לזירוז התא הפעיל מתיחה באופן סטרילי, noninvasively לעומת הקודם פרסומים36, בשילוב עם גירוי שדה חשמלי. הטכניקה דיווחו כאן מסביר בפירוט את ההתקן ואת שיטת המשמש את גירוי חשמלי, מכני, אלקטרו-מכאניים של תאים.

מכשיר זה יכול לספק גירויים חשמליים ומכניים, באופן עצמאי או בעת ובעונה אחת. הגירוי מתבצע עם גישה מוזרה אספטי לא פולשנית, הכולל תמיכה תא presterilized, אלקטרודות בתוך צלחת רגילה תרבות, ובעל פלטפורמה המשרה כלפי כוחות מכניים וחשמליים (איור 1).

הפלטפורמה יכולה להכיל עד 6 צלחות ותרבות מורכב מבנה כריך של לייזר poly(methyl methacrylate) וחתיכות המעגלים המודפסים. האבטיפוס פלטפורמה מתבסס על שילוב של monophasic לתכנות מבוקר-מחשב חשמל ממריץ, לוח מעגלים מודפסים עבור החיבור חזקים של אלקטרודות, ו 6 10 מ מ x 10 מ מ x 5 מ מ מ נאודימיום-קבוע מגנטים הניח ליד צד אחד של הלוחות תרבות. במלון יש גם בר אלומיניום עם שישה נהיגה מגנטים (לדוגמא) הניח לפני הצד השני של הלוחות תרבות ועבר עם במנוע סרוו ליניארי. המנוע הוא מונע על ידי בקר מנוע, המופעל באמצעות יציאת RS-232 על ידי תוכנה מסחרית (ראה את הטבלה של חומרים). דרך ממשק המשתמש ממריץ לתכנות, זה ניתן לתכנת את עוצמת חשמל, המשך את הדופק, תדר, התדירות של גירוי מכני, מחזור חיים שלה, מספר פולסים, הדופק משרעת (טיול מגנט), המדרון.

figure-introduction-6137
איור 1 : ממריץ אלקטרו- (א) PDMS המבנה המשמש את מיזוג התא. (B) ציור של הבונה PDMS, כולל אלקטרודות ומגנטים. (ג) פירוט של הלוח מעגל מודפס (פלטפורמה) המשמש לביצוע ההתניה אלקטרו-מכאניים. לוח זה שונה מ- Llucià-Valldeperas et al.30. (ד) תמונה של גירוי מכאני חשמלי פלטפורמה וממשק משתמש (מחשב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ממריץ את וגם את שיטת אלקטרו-מכאניים מיזוג מלא מתוארים שני הפטנטים הבינלאומי, וו-2013185818-A137 ו וו-2017125159-A138.

שהסיליקון מסתיימים מבנים שנועדו לספק תמיכה מבנית לתאים, אלקטרודות של מגנטים כבר שתוארה קודם לכן10,21. בקצרה, הם מורכבים של polydimethylsiloxane (PDMS), יצוק ולרפא בטמפרטורת החדר, עם מודול האלסטיות של MPa 1.3, קרוב רמות פיזיולוגיים. הבונה מכיל בריכה התרבות תאים באזור גמיש (10 מ מ x 10 מ"מ x 2 מ"מ), שני חריצים רוחביים הפנימי להחזיק את האלקטרודות, ושניים משובצים 6 מ"מ x 2 מ"מ x 4 מ מ ממ נאודימיום מגנטים. האלקטרודות בנויים על 0.2 מ מ פלטינום תיל כרוכים סביב 2 מ"מ x 3 מ"מ x מ מ 12 טפלון (PTFE) core בר (21 ס מ לכל אלקטרודה, פונה כ 23) והניח בשני צידי אזור גמיש כדי ליצור שדה חשמלי להשראת גירוי חשמלי. מתיחה מכנית מושגת באמצעות משיכה מגנטי בין מגנטים נעוץ התמיכה מגנטים חיצוני להציב ליד הלוחית תרבות, על זרוע אלומיניום נע. בדרך זו, ניתן להרחיב את התמיכה התא מבלי לשבור את מחסום סטרילי. גישה זו מתאימה טפט תא אבל יכול להיות מותאם מבנים תלת-ממדי, כמו גם.

בנוסף, דפוס קבוע יכול להיות מוטבעים בו התאים אינם נזרע, שימוש סריג עקיפה הנשלטים (1,250 חריצים מ"מ). פריט חזותי ישיר של תאים תרבותי על הבונה PDMS תחת brightfield ומיקרוסקופים פלורסנט אפשרי בשל שקיפות 0.5 מ מ עובי. במקרה הנוכחי, בבריכה תרבות PDMS יש דפוס פני שטח אנכי, אנכי כוח מתיחה, כדי ליישר את התאים בניצב לשדה חשמלי, אשר מצמצם את המילוי ההדרגתי של שדה חשמלי על פני התא.

איור 1 מציג תיאור מפורט של מבנה, מכשיר המשמש את הגירוי. PDMS לבנות, מאפיינים ממוטבים עבור תא מתיחה (איור 1 א', ב'). ממריץ הוא פיתח ואומת עבור יישום אפקטיבי של הגירוי הרצוי חשמליים ומכניים לתאים המחוברים הבונה PDMS. תהליך זה כולל הקפדה טובה operability בקישוריות המשתמש באמצעות ממשק תוכנה (איור 1C, יח).

ההליך עבור תא גירוי באמצעות התקן בהזמנה אישית זה מתוארת בסעיף פרוטוקול.

Protocol

מחקר זה משתמש ATDPCs הלב האנושי מדגימות החולה. השימוש שלהם אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית, כל המטופלים נתן הסכמה מדעת. פרוטוקול המחקר תואמת העקרונות המתוארים את הצהרת הלסינקי.

1. תכשירים

  1. פינצטה אוטוקלב שתי אלקטרודות PTFE פלטינה 12 סטימולציה חשמלית, מגבות נייר, ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  2. לחטא PDMS 12 בהזמנה אישית בונה (איור 1א').
    1. לשטוף כל לבנות עם 5 מ ל מים מזוקקים, סטרילי עם עצבנות מגנטיים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    2. רחץ 1 x 5 מ של 70% אתנול עם עצבנות מגנטיים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    3. רחץ 5 x 5 מ של מים מזוקקים, סטרילי עם עצבנות מגנטיים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לכל שטיפת, כדי להסיר שאריות אלכוהוליים.
    4. יבש את בונה על מגבות נייר סטרילי בתוך הלילה ארון זרימה.
    5. לאחסן אותם 50 מ ל סטרילי צנטריפוגה צינורות עד השימוש.

2. התא זריעה (יום-1)

  1. לפני תא זריעה, להעביר את המבנים PDMS נקי סטרילי צלחות, חושפים את האור האולטרה סגול במשך 5 דקות כדי להבטיח להשלים עיקור.
  2. העברת כל לבנות 35 מ מ תא תרבות צלחת או לוח 6-ובכן, עבור תא מיידית זריעה.
  3. Trypsinize בקבוקון T75 confluent ATDPCs לב.
    1. לשטוף את הבקבוקון T75 עם 5 מ של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
    2. להוסיף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לנתק את התאים.
    3. הוסף 5 מ של בינוני מלא כדי להשבית את טריפסין-EDTA.
    4. לאסוף כל תאי צינור 15 מ"ל, לשטוף הבקבוקון 2 x 5 מ של PBS כדי לאסוף את כל התאים הנותרים.
    5. צנטריפוגה ב x 230 גרם במשך 5 דקות ב 22 ° C, הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים 2 מיליליטר בינוני מלא לספור אותם עם תא hemocytometer.
  4. זרע µL 200 של הלב ATDPCs (2.5 x 105 תאים למ"ל) לתוך הבריכה תא של המבנה PDMS 12 (איור 1א', ב') יש ~ 80% של השטח זריעה מכוסה על ידי תאים ביום שאחרי, דגירה-CO 37 ° C ו-5%2.
    הערה: לאחר 2 – 4 h, צריכה להיות מחוברת התאים. תא inoculum מוכן לפי גודל התא צמיחה. עבור תאים קטנים יותר, להגדיל את צפיפות זריעה.
  5. להוסיף בעדינות 2 מ"ל של מדיום מלאה prewarmed (α-מ בתוספת 10% עוברית שור סרום, 1%-גלוטמין ו- 1% פניצילין-סטרפטומיצין) לכל צלחת.
  6. דגירה המבנה-תרבות תנאים (בדרך כלל 37 ° C ו- 5% CO2) בן לילה.

3. אלקטרו-מכאניים גירוי ההתקנה (יום 0)

  1. לפני תחילת ההליך, לקחת שישה מבנים לגירוי אלקטרו-מכאניים ושישה כפקדי nonstimulated. עם צלחות פחות מ-6 לכל גירוי, השתמש מבנים ריקים באותו אמצעי אחסון בינוני כדי להבטיח גירוי שדה חשמלי תקין.
  2. לנקות את יחידת גירוי עם אתנול 70% ולמקם אותו בזרם בארון.
  3. מביאים את אלקטרודות סטרילי פינצטה בפנים הארון זרימה.
  4. הסר 90% של המדיה לצלחת תרבות לתמרן בקלות את אלקטרודות וקבועים. מקום ראשון, המבנה PDMS בתנוחה הנכונה כדי להבטיח משיכה מגנטית (PDMS הזחה בתוך לוח תרבות לכיוון המגנט) בין מגנטים קבועים וניידים. בשלב הבא, לחבר את החוט פלטינה המחברים אלקטרודה ואת החלק PTFE בחלל המיועד שלה הבונה PDMS.
  5. להוסיף 2.5 מ של טרי prewarmed מדיום מלאה בכל מבנה.
    הערה: לשמור על עקרות לאורך כל ההליך, לנתח את המבנה אחד בכל פעם. לשמור על שאר המבנה בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 עד השימוש.
  6. לאחר כל המבנים PDMS הם ממוקמים, מחוברים חשמלית פלטפורמת, להחזיר את הפלטפורמה לתוך החממה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2
  7. לחבר את מקור חשמליים ומכניים.
  8. הגדר את תוכנית גירוי. ציין גירויים חשמליים ומכניים משטרים דרך ממשקי המשתמש של אחד האביזרים המקובלים לגירוי חשמלי לבין היישום, אשר שולטת על גירוי מכני. הגדר את synchronism כדלקמן.
    1. . הפעילי את אחד האביזרים המקובלים לגירוי חשמלי המתן לתפריט הראשי מופיעים בתצוגה.
      1. לאחר מכן, בחר אפשרות 2: עריכת רצף + Enter.
      2. ערוך את רצף התפריט כדלקמן.
        1. השתמש בכרטיסיה ' מצב ' כדי לבחור או מתח או זרם. בחר הנוכחי על ידי לחיצה + והקש Enter.
        2. עבור הכרטיסייה משרעת , בחר 1 (תואר שני) עם + /- והקש על Enter.
        3. עבור התקופה (T), בחר 1000 (ms) עם + /- והקש על Enter.
        4. הגדר את משך פעימה (Tw) 2 (ms) עם + /- והקש Enter.
        5. עבור הכרטיסייה מפעיל מצב , בחר חיצוני על-ידי תוכנת והקש על Enter.
        6. בחזרה התפריט הראשי, בחר באפשרות 4: ליצור רצף והקש Enter.
          הערה: אחד האביזרים המקובלים לגירוי חשמלי נח המתנה עד שהוא מקבל פקודה ההדק מהיישום ממריץ מכני דרך היציאה הטורית.
    2. בצע את השלבים הבאים במקטע גירוי מכני של יישום הבקרה (איור 2C).
      1. לכתוב 1,000 (ms) בפקד טקסט הדופק תקופה .
      2. כתוב 500 (ms) בפקד טקסט על זמן (Tw) כדי לקבוע את משך פעימה מכני.
      3. כתיבה 2,000 (AU) בפקד טקסט טיול לספק של התארכות לבנות 10%. . זה מספר הצעדים של המנוע בקרה ליניארית.
        הערה: פרוטוקול גירוי להחיל כאן מורכב הנוכחי לסירוגין 2 מילי-שניות monophasic פולסים מרובע-גל של mV 50/cm-1 הרץ ו-10% מתיחה במשך 7 ימים. הטיימס עלייתו ונפילתו של הדופק מכני מוגדרים ב-100 מילישניות, לחקות את צורת האח לחץ הדופק בערך. כמו כן, מצב החזרה מוגדר רציף ויש מונה הצגת מספר פולסים.
  9. לשנות את המדיה 2 x בשבוע (יום שני, חמישי אחר הצהריים). ראשית, להסיר את המדיה הישנה; לאחר מכן, הוסף התקשורת חמים על צידי תמיכה PDMS, אף פעם לא ישירות על שפת הבריכה תא.
    הערה: אם התאים יש שיעור צמיחה גבוה, המדיה צריך להיות שונה 3 x שבוע (למשל, שני, רביעי, ושישי). יש צורך לנתק ולהתחבר כל הכבלים, אך אין צורך להסיר את לוחות התרבות ואת אלקטרודות ממקום מגוריהם.
  10. לאסוף הדגימות לאחר ביצוע הניסויים.

4. המדגם אוסף בסוף הניסויים (יום 7)

  1. עבור ניתוחים RNA
    1. לשטוף את הבונה 2 x עם 3 מ"ל של PBS 1 x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. להוסיף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA כל צלחת (מספיק כדי לכסות את כל הבונה) לחכות 5 דקות ב 37 º C.
    3. לאחר התאים מנותקים, להוסיף 2 מיליליטר בינוני מלא כדי להשבית את טריפסין-EDTA.
    4. לאסוף כל התאים 15 מ"ל צינור ולשטוף את הבונה 2 x עם 3 מ"ל של PBS כדי לאסוף את כל התאים הנותרים.
    5. צנטריפוגה ב x 230 גרם במשך 5 דקות-22 מעלות צלזיוס.
    6. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ב 1 מ"ל ל- PBS.
    7. העברת הפתרון תא צינור 1.5 מ ל ו צנטריפוגה ב x 230 גרם במשך 5 דקות.
    8. הסר את תגובת שיקוע ולאחסן בגדר ב-80 מעלות צלזיוס ב- 700 µL של פירוק ריאגנט לבידוד RNA עוד יותר.
    9. לבודד RNA באמצעות ערכת מסחרי, ההוראות של היצרן.
    10. הפוך-לתמלל הרנ א מבודדים באמצעות ערכת hexamers אקראיים, על-פי הפרוטוקול של היצרן.
    11. עבור ריכוזים RNA קטנים, preamplify ו, אז, לדלל 1:5 עם מים ללא RNase לפני תגובת שרשרת של פולימראז עוקבות שעתוק במהופך בזמן אמת (RT-PCR) מבוצע. להמשיך עם הפרוטוקול הסטנדרטי עבור בזמן אמת RT-PCR וסמנו סמני הלב הראשי.
      הערה: סמני לב אופייני מהוות סמנים מוקדם ומאוחר מקטגוריות שונות, כגון גורמי שעתוק הלב (2A גורם ספציפי myocyte משפר [MEF2A], גאטה מחייב חלבון 4 [גאטה-4]) ומבניים (טרופונין לב אני [cTnI], לב טרופונין T [cTnT], α-actinin) ותקנות סידן (Connexin43 [Cx43], sarco-/ רשתית תוך-פלזמית Ca2 +-ATPase [SERCA2])30. בידוד חלבון יכול להתבצע גם אם יש צורך. ניתן לבצע בו זמנית בידוד RNA וחלבונים באותה דגימת זרע, באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית וערכות (טבלה של חומרים) אם הכמות מדגם קטן.
  2. עבור immunostainings
    הערה: זה מבוצע ישירות על התאים מחוברים לבריכה תא של הבונה PDMS. לכן, אנו ממליצים הנחת, בכל פעם, מכסה 1 ס"מ על 1 ס"מ של פרפין סרט על גג הבריכה תא, מלבד הצלחת, כדי למזער את האידוי של הפתרונות הדגירה.
    1. לשטוף את הבונה 2 x עם 3 מ"ל של PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. לתקן את התאים מחובר הבונה עם 2 מיליליטר 10% פורמלין למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לשטוף את התאים 3 x עם 3 מ"ל של PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחסון לטווח ארוך, להשאיר את הדגימות ב- PBS עם 0.1% אזיד הנתרן ב 4 º C.
    4. Permeabilize התאים עם 3 מ"ל של PBS + 0.5% חומר ניקוי (3 x, כל זמן 5 – 10 דקות, בטמפרטורת החדר).
    5. דגירה התאים עם 100 µL של PBS + סרום סוס 10% + 0.2% סבון + 1% שור אלבומין בטמפרטורת החדר במשך ה' 1, כדי לחסום את איגוד נוגדן ספציפי.
    6. דגירה התאים עם 100 µL של PBS + סרום סוס 10% + 0.2% סבון + אלבומין פרה 1% + נוגדן ראשוני בטמפרטורת החדר מאובטח. לדוגמה, ראשי נוגדנים נגד Cx43 (1: 100), sarcomeric α-actinin (1: 100), גאטה-4 (1:50), MEF2 (1:25), ו- SERCA2 (1:50).
    7. רחץ 3 x 3 מ של PBS בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    8. דגירה התאים עם 100 µL של PBS + נוגדנים משניים בטמפרטורת החדר בחושך 1 h.
      הערה: נוגדנים משניים מצומדת עם fluorophores שונים, סוכן counterstaining שימשו.
    9. לשטוף אותם 3 x 3 מ של PBS בטמפרטורת החדר בחושך במשך 5 דקות.
    10. דגירה התאים עם 100 µL של גרעיני מכתים (0.1 µg/mL) ב- PBS בטמפרטורת החדר בחושך למשך 15 דקות.
    11. לשטוף אותם 3 x 3 מ של PBS בטמפרטורת החדר בחושך במשך 5 דקות.
    12. אחסן את הדגימות 3 מ"ל של PBS עם 0.1% אזיד הנתרן ב 4 ° C עד הרכישה.
      הערה: מיקרוסקופ רכישה אפשרית באתר מיקרוסקופים פלורסנט, קונאפוקלית הפוך עם יעדים מרחק רב-לעבוד בגלל העובי לבנות הוא כ- 0.5 מ מ.

תוצאות

איור 2 מייצג את כללי הסכימה עבור גירוי התא. בקצרה, התאים היו נזרע על הבונה PDMS, נתון גירוי מכאני חשמלי, עם שינוי המדיה לבצע פעמיים בשבוע. תאים nonstimulated שימשו בתור פקד מיזוג אלקטרו-מכאניים. בנוסף, הוספנו פקד נוסף הניסוי, תת עורית ATDPCs שימשו פקד עבור ATDPCs הלב. ATDPCs תת...

Discussion

גירוי מכאני חשמלי שנראה חלופה בטוחה עבור הכנת תאי הלב סביבה עוינת ושיפור מחויבותם הלב. . הנה, פרוטוקול המתואר ובתאים לב מוגברת הביטוי של סמנים הלב הראשי, היה דיווח להיות מועיל עבור שלהם השרשה הבא על שריר הלב מאתר infarcted30. באופן כללי, ATDPCs לב electromechanically מגורה עלה הביטוי של גנים הקשו...

Disclosures

המחברים אין לחשוף, פרט לכך גירוי ההתקן ואת פרוטוקול היו בעבר פטנט (WO-2013185818-A1, וו-2017125159-A1).

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות חברי תכנית המחקר של ICREC (IGTP, בדלונה) ואת אלקטרונית קבוצה במכשור ביו-רפואי (UPC, ברצלונה), במיוחד פרופסור ג'יי Rosell-פרר. בנוסף, המחברים להכיר תאי גזע Translational רפואה יומן ולחץ AlphaMed עבור המתיר את העיבוד של דמויות שפורסמו בעבר (Llucià-Valldeperas, et al. 30)-הפיתוח של האב-טיפוס הזה, העיצוב של הפרוטוקול נתמכו Ministerio דה Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio דה Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), הנציבות האירופית (תכנית המסגרת השביעית RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), פונדציו La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502), Fundación פארא לה Innovación y la Prospectiva en סאלוד en אספניה (FIPSE; 00001396-06-15).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Stimulator
nickel plated neodymium magnetsSupermagneteQ-10-10-05-N
nickel-plated neodymium magnetsSupermagneteQ-06-04-02-HN
polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer KitDow Corning Corp184
ruled diffraction grating (1250 grooves/mm)Newport05RG150-1250-2
Motor controllerFaulhaberMCLM-3006-S
LabviewNational Instruments
Cell culture
phosphate-buffered saline (PBS)Gibco70013-065
0.05% trypsin-EDTAGibco25300-120
35 mm cell culture dishBD Falcon45353001
fetal bovine serum (FBS)Gibco10270-106
L-Glutamine 200 mM, 100xGibco25030-024
Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mLGibco15140-122
Minimum essential medium eagle (alfa-MEM)SigmaM4526-24x500ML
Protein & RNA analyses
protease inhibitor cocktailSigmaP8340
QIAzol Lysis ReagentQiagen79306
AllPrep RNA/Protein KitQiagen50980404
Rneasy mini kitQiagen74104
iTaq Universal Probes One-Step KitBio-Rad Laboratories172-5140
Random hexamersQiagen79236
TaqMan PreAmp MasterMix 2xApplied Biosystems4391128
TaqMan Universal PCR MasterMixApplied Biosystems4324018
Immunostaining
10% formalinSigmaHT-501128-4L
horse serumSigmaH1138
Triton X-100SigmaX100-500ML
Bovine Serum Albumina (BSA)SigmaA7906-100G
PARAFILMSigmaP6543
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)SigmaD9542
Phalloidin Alexa 568InvitrogenA12380
sodium azideSigmaS8032-100g
Hoechst 33342Sigma14533
Connexin-43 rabbit primary antibodySigmaC6219 lot#061M4823
sarcomeric α-actinin mouse primary antibodySigmaA7811 lot#080M4864
GATA-4 goat primary antibodyR&DAF2606 VAZ0515101
MEF2 rabbit primary antibodySanta Cruzsc-313 lot#E0611
SERCA2 goat primary antibodySanta Cruzsc-8095 lot#D2709
Cy3 secondary antibodyJackson ImmunoResearch711-165-152
Cy3 secondary antibodyJackson ImmunoResearch715-165-151
Cy3 secondary antibodyJackson ImmunoResearch712-165-150
Cy2 secondary antibodyJackson ImmunoResearch715-225-150
Cy2 secondary antibodyJackson ImmunoResearch711-225-152
Cy2 secondary antibodyJackson ImmunoResearch705-225-147

References

  1. McDonough, P. M., Glembotski, C. C. Induction of atrial natriuretic factor and myosin light chain-2 gene expression in cultured ventricular myocytes by electrical stimulation of contraction. Journal of Biological Chemistry. 267, 11665-11668 (1992).
  2. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, 155-173 (2009).
  3. Serena, E., et al. Electrical stimulation of human embryonic stem cells: cardiac differentiation and the generation of reactive oxygen species. Experimental Cell Research. 315, 3611-3619 (2009).
  4. Tandon, N., et al. Optimization of electrical stimulation parameters for cardiac tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5, 115-125 (2011).
  5. Zhang, X., Wang, Q., Gablaski, B., Lucchesi, P., Zhao, Y. A microdevice for studying intercellular electromechanical transduction in adult cardiac myocytes. Lab on a Chip. 13, 3090-3097 (2013).
  6. Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6, 989-999 (2013).
  7. Pietronave, S., et al. Monophasic and biphasic electrical stimulation induces a precardiac differentiation in progenitor cells isolated from human heart. Stem Cells and Development. 23, 888-898 (2014).
  8. Pavesi, A., et al. Electrical conditioning of adipose-derived stem cells in a multi-chamber culture platform. Biotechnology and Bioengineering. 111, 1452-1463 (2014).
  9. Baumgartner, S., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 20, 104-112 (2015).
  10. Llucià-Valldeperas, A., et al. Electrical stimulation of cardiac adipose tissue-derived progenitor cells modulates cell phenotype and genetic machinery. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 76-83 (2015).
  11. Llucià-Valldeperas, A., et al. Physiological conditioning by electric field stimulation promotes cardiomyogenic gene expression in human cardiomyocyte progenitor cells. Stem Cell Research and Therapy. 5, 93 (2014).
  12. Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (52), 18129-18134 (2004).
  13. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
  14. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12 (4), 452-458 (2006).
  15. Birla, R. K., Huang, Y. C., Dennis, R. G. Development of a novel bioreactor for the mechanical loading of tissue-engineered heart muscle. Tissue Engineering. 13, 2239-2248 (2007).
  16. Salameh, A., et al. Cyclic mechanical stretch induces cardiomyocyte orientation and polarization of the gap junction protein connexin43. Circulation Research. 106, 1592-1602 (2010).
  17. Galie, P. A., Stegemann, J. P. Simultaneous application of interstitial flow and cyclic mechanical strain to a three-dimensional cell-seeded hydrogel. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (5), 527-536 (2011).
  18. Leychenko, A., Konorev, E., Jijiwa, M., Matter, M. L. Stretch-induced hypertrophy activates NFkB-mediated VEGF secretion in adult cardiomyocytes. PLoS One. 6, 29055 (2011).
  19. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
  20. Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35, 2798-2808 (2014).
  21. Llucià-Valldeperas, A., et al. Unravelling the effects of mechanical physiological conditioning on cardiac adipose tissue-derived progenitor cells in vitro and in silico. Scientific Reports. 8, 499 (2018).
  22. Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
  23. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, 781-787 (2013).
  24. Barash, Y., et al. Electric field stimulation integrated into perfusion bioreactor for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1417-1426 (2010).
  25. Maidhof, R., et al. Biomimetic perfusion and electrical stimulation applied in concert improved the assembly of engineered cardiac tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 6, 12-23 (2012).
  26. Feng, Z., et al. An electro-tensile bioreactor for 3-D culturing of cardiomyocytes. A bioreactor system that simulates the myocardium's electrical and mechanical response in vivo. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 24 (4), 73-79 (2005).
  27. Wang, B., et al. Myocardial scaffold-based cardiac tissue engineering: application of coordinated mechanical and electrical stimulations. Langmuir. 29 (35), 11109-11117 (2013).
  28. Morgan, K. Y., Black, L. D. Mimicking isovolumic contraction with combined electromechanical stimulation improves the development of engineered cardiac constructs. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1654-1667 (2014).
  29. Godier-Furnémont, A. F., et al. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  30. Llucià-Valldeperas, A., et al. Electromechanical Conditioning of Adult Progenitor Cells Improves Recovery of Cardiac Function After Myocardial Infarction. Stem Cell Translational Medicine. 6 (3), 970-981 (2017).
  31. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  32. Gelmi, A., et al. Direct Mechanical Stimulation of Stem Cells: A Beating Electromechanically Active Scaffold for Cardiac Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (12), 1471-1480 (2016).
  33. Poulin, A., et al. An ultra-fast mechanically active cell culture substrate. Scientific Reports. 8 (1), 9895 (2018).
  34. Bayes-Genis, A., et al. Human progenitor cells derived from cardiac adipose tissue ameliorate myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (5), 771-780 (2010).
  35. Bagó, J. R., et al. Bioluminescence imaging of cardiomyogenic and vascular differentiation of cardiac and subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells in fibrin patches in a myocardium infarct model. International Journal of Cardiology. 169, 288-295 (2013).
  36. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
  37. Rosell Ferrer, F. X., Sánchez Terrones, B., Bragós Bardia, R., Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A. Methods and devices for mechanical and electrical stimulation of stem cell monolayer and 3d cultures for tissue engineering applications. Spanish patent. , (2013).
  38. Bayés Genís, A., Llucià Valldeperas, A., Soler Botija, C., Bragós Bardia, R., Rosell Ferrer, F. X. Method for Conditioning Stem Cells. Spanish patent. , (2017).
  39. Roura, S., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A. Myocardial healing using cardiac fat. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 16 (4), 305-311 (2018).
  40. Zhang, Y. M., Hartzell, C., Narlow, M., Dudley, S. C. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation. 106 (10), 1294-1299 (2002).
  41. Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. A. Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
  42. Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
  43. Kim, C. iPSC technology--Powerful hand for disease modeling and therapeutic screen. Biochemistry and Molecular Biology Reports. 48 (5), 256-265 (2015).
  44. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A Fast Track for Engineered Human Tissues in Drug Development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  45. Bruyneel, A. A., McKeithan, W. L., Feyen, D. A., Mercola, M. Will iPSC-cardiomyocytes revolutionize the discovery of drugs for heart disease. Current Opinion inPharmacology. 42, 55-61 (2018).
  46. Farley, A., Johnstone, C., Hendry, C., McLafferty, E. Nervous system: part 1. Nursing Standard. 28 (31), 46-51 (2014).
  47. Brotto, M., Bonewald, L. Bone and muscle: Interactions beyond mechanical. Bone. 80, 109-114 (2015).
  48. Park, S. J., et al. Neurogenesis Is Induced by Electrical Stimulation of Human Mesenchymal Stem Cells Co-Cultured With Mature Neuronal Cells. Macromolecular Bioscience. 15 (11), 1586-1594 (2015).
  49. Vianney, J. M., Miller, D. A., Spitsbergen, J. M. Effects of acetylcholine and electrical stimulation on glial cell line-derived neurotrophic factor production in skeletal muscle cells. Brain Research. 1588, 47-54 (2014).
  50. Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143ATDPCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved