הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

Summary

כאן, אנו מתארים אסטרטגיית לשחזור ויעילה כדי לייצר כייל נוגדנים, בקרת איכות קבוצות של וקטורים adeno-הקשורים וירוס. היא מאפשרת למשתמש לקבל הכנה וקטור עם כייל גבוה (≥1 x 10¹³ וקטור הגנום/mL) ואת טוהר גבוהה, מוכן לשימוש במבחנה או ויוו .

Abstract

ג'ין משלוח כלי מבוסס על וירוסים adeno-הקשורים (AAVs) הם בחירה פופולרית עבור מסירת transgenes על מערכת העצבים המרכזית (CNS), כולל יישומים טיפול גנטי. וקטורים AAV הם ללא שכפול, מסוגל להדביק החלוקה והן הלא-חלוקת תאים ולספק ביטוי transgene לטווח ארוך. חשוב, כמה אשר נגרמו מהזנים אליהם, כגון PHP שתואר לאחרונה. B, יכול לחצות-מחסום הדם המוח-(BBB) במודלים של בעלי חיים, שלאחר משלוח מערכתית. וקטורים AAV יכול להיות מיוצר באופן יעיל במעבדה. עם זאת, פרוטוקולים לשחזור ועמיד נדרשים להשיג AAV וקטורים עם רמות טוהר מספיק וערכי כייל נוגדנים גבוה מספיק עבור יישומים ויוו . פרוטוקול זה מתאר את אסטרטגיית לשחזור ויעילה לייצור וקטור AAV, המבוסס על אסטרטגיית טיהור הדרגתיות iodixanol. שיטת טיהור iodixanol מתאימה להשגת קבוצות של וקטורים AAV כייל גבוה של טוהר גבוהה, בהשוואה לשיטות טיהור אחרות. יתר על כן, הפרוטוקול הוא בדרך כלל מהר יותר מאשר שיטות אחרות כיום המתואר. בנוסף, שרשרת פולימראז כמותיים התגובה (qPCR)-אסטרטגיה מבוסס מתואר לקבלת החלטה מהיר ומדויק של כייל את וקטור, כמו גם כסף מכתים שיטה לקבוע את הטוהר של אצוות וקטור. לבסוף, התוצאות נציג של המסירה הגן מערכת העצבים, בעקבות ניהול מערכתי AAV-PHP. B, מוצגים. תוצאות כאלה צריך להיות אפשרי במעבדות כל באמצעות פרוטוקולים המתוארות במאמר זה.

Introduction

במהלך 30 השנים האחרונות, AAVs פראי-סוג יש מהונדס ליצירת וקטורים AAV רקומביננטי, אשר הוכיחו להיות כלי שימושי במיוחד עבור העברה גנטית לתוך מערכת העצבים המרכזית^{1,2,3,4, 6 5,}טיפול גנטי מתקרב ל-^4,המחלה (כולל ה-FDA-EMA-אישרה טיפולים)⁷. להתאמתם לשימוש מערכת העצבים נובעת במידה רבה היכולת שלהם להדביק תאים ללא הפרדה, שלאחר mitotic, נמצאו בדרך כלל ב- CNS⁸. עם זאת, מבוססת AAV וקטורים יש גם יתרון המאפשר ביטוי לטווח ארוך של כל^4,transgene טיפולית נתון⁹ תוך העלאת לתגובה החיסונית מתון לעומת ויראלי וקטורים אחרים^{7, 8,10,11,12}.

האלמנטים העיקריים של כל וקטור AAV הם הגנום של capsid. AAVs פראי-סוג הם חד-גדילי (הה) ה-DNA וירוסים עם הגנום של 5 kilobases (kb)¹³. לייצור של וקטורים AAV רקומביננטי, הגנים. נציג ו cap (הכרחי עבור שכפול גנום לבין ההרכבה של capsid ויראלי) נמחקים מן הגנום של AAV פראי-סוג וסיפק טרנס, השארת מקום קלטת ביטוי המכיל את ה-^14,transgene¹⁵. הפוך מסוף חוזר הרצפים (ITRs) של הגנום הנגיפי המקורי הם האלמנטים יתרת היחידה וקטור AAV, כמו אלה הם חיוניים עבור שכפול ואריזות^3,10,14. . ניתן לתכנן AAV וקטורים כדי לשפר את הביטוי transgene; מוטציה באחד ITRs מוביל היווצרות לולאה מכבנה המאפשר ביעילות את הדור של משלים דנ א סטרנד^3,7,15. היתרון העיקרי של תצורה זו, כינה את הגנום העצמי-משלימים (sc), הוא זה עוקף את הצורך שנייה-strand סינתזה טיפוסי במחזור החיים המקובלת של AAVs, להגדיל באופן משמעותי את המהירות ואת רמות ביטוי transgene ¹. יחד עם זאת, שימוש של הגנום scAAV מפחית את קיבולת מטען של וקטור כ 2.4 kb. זה כולל רצפים transgene, כמו גם כל רצפי רגולטוריות כגון היזמים או אתרים מחייב microRNA, להגבלת ביטוי סוגי תאים מסוים¹⁶.

Capsid AAV קביעת האינטראקציה תא וקטור-מארח, מקנה מידה של tropism סוג או רקמת תאים עבור serotype AAV, אשר ניתן לנצל גם כדי להגביל את הביטוי transgene למיקומים ספציפיים. מספר AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם נמצאים בטבע, ואילו אחרים הופקו במעבדות באמצעות גישות רקומביננטי (קרי, PHP. B). בנוסף, יש capsids גם להעניק מאפיינים שימושיים אחרים, כגון היכולת חוצה BBB, וכתוצאה מכך המסירה של transgenes ברחבי מערכת העצבים לאחר ניהול מערכתי. זה הוכח AAV9, כמו גם את PHP תיאר לאחרונה. B capsid¹⁷. כתוצאה מכך, הם אלה אשר נגרמו מהזנים אליהם להוכיח להיות רלוונטיים במיוחד עבור גישות טיפול גנטי חדשות^1817,1,הפרעות ניווניות.

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר שיטה חסכונית לייצור בקנה מידה קטן של וקטורים AAV עם כייל נוגדנים גבוה וטוהר. למרות התוצאות המובאות כאן להשתמש את PHP. B capsid, קלטת ביטוי scAAV, הפרוטוקול מתאים בייצור של AAV וקטור אשר נגרמו מהזנים אליהם מספר תצורות הגנום, ומאפשר גמישות מקסימלית ניסיוני. עם זאת, התשואה וקטור וטוהר הסופי יכול להשתנות בהתאם serotype שבחרת.

הפרוטוקול עצמו הוא וריאציה של השיטה הקלאסית tri-תרביות תאים לייצור וקטור ויראלי, משלב את השימוש ההדרגתי iodixanol עבור וקטור לנקות, אשר, לעומת השימוש הקלאסי של צסיום כלוריד (CsCl), מעברי צבע, כבר דיווח לייצר AAV וקטורים של טוהר גבוהה יותר יעיל יותר זמן באופן^19,20,21.

השלבים תרביות תאים, היטהרות, ריכוז נועדו לבצע לפי מעבדה (GLP) במעבדה תרביות רקמה מדורג לעבודה וקטור ויראלי. כל פעילות צריכה להתבצע בהתאם החקיקה המקומית והארצית הרלוונטיים הנוגעים וקטור ויראלי הייצור ולהשתמש. עבודה צריך להתבצע תחת תא למינארי, בתנאים סטריליים. בתוך המתקן וקטור, מומלץ ללבוש סינר של המעבדה, בנוסף המעבדה תרביות רקמה רגילה. יתר על כן, זוג כפול של כפפות, כמו גם overshoes פלסטיק, צריך להיות משוחק בכל עת.

לפני החל בייצור וקטור, להבטיח את כל הציוד הנדרש, פלסמידים הינם זמינים. 1) פלסמיד pCapsid מכיל את הגן נציג מקודד חלבונים שאינם מבניות ארבע הכרחי עבור שכפול, כלומר Rep78, Rep68, Rep52 ו Rep40, הגן קאפ מקודד חלבונים מבניים capsid שלוש, כלומר VP1 VP2, VP3. 2) פלסמיד pHelper מכיל את הגנים E4, E2Aו- VA אדנו, המספקות AAV ייצור בתאים HEK293T. 3) פלסמיד pTransgene מכיל את הקלטת ביטוי transgene, ולצדו שני ITRs. פלסמידים אלה יכול להיות מסונתז דה נובו במעבדה בעזרת רצפים זמינים באינטרנט²². עבור פלסמידים גרם דה נובו, במיוחד אלה המכילים transgenes הרומן, רצף נדרש, כדי לוודא כי transgene ואת ITRs נכונים. לחלופין, פלסמידים premade ניתן לרכוש ישירות באמצעות מאגרים מקוונים פלסמיד. בעת הצורך, פלסמידים יכולים להיות מוגבר, מטוהרים באמצעות ערכות רגיל, על פי הוראות היצרן²³.

וקטור כייל וטוהר עלולה להשפיע לרעה על יכולת התמרה חושית של וקטור. פרוטוקולים נוספים מסופקים כדי להעריך את האיכות של וקטור המיוצר. הווקטורים הסופי יהיה שימושי עבור מחקרים של הפונקציה cell CNS ביישומים גם במבחנה וגם ויוו .

Protocol

פתרון	קומפוזיציה
תרבית תאים, תרביות תאים
DMEM1	DMEM 1 x
	1% FBS (v/v)
	1% GlutaMAX (וי/v)
DMEM10	DMEM 1 x
	10% FBS (v/v)
	1% GlutaMAX (וי/v)
150 מ מ NaCl	4.380 g NaCl
	עד 500 מ"ל מים הנדסה גנטית
Desalting וטיהור AAV
NaCl 5 מ'	146.1 g NaCl
	עד 500 מ"ל מים הנדסה גנטית
1 מ' טריס HCl (pH 8.5)	בסיס טריס 12.11 g	זהירות
	עד 100 מ ל מים הנדסה גנטית
	להוסיף 1 HCl M באמצעות פיפטה פסטר כדי לצמצם את רמת ה-pH 8.5
מאגר פירוק	15 מ"ל של NaCl 5 מ'
	25 מ של 1 מ' טריס HCl (pH 8.5)	זהירות
	עד 500 מ"ל מים הנדסה גנטית
10 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)	80 גר' NaCl
	2 גרם אשלגן כלורי	זהירות
	14.4 g נה2HPO4
	2.4 g ח'2PO4
	עד 1 מים ddL
MgCl 1 מ'2	20.33 g MgCl2-6 H2O
	עד 100 מ ל מים הנדסה גנטית
אשלגן כלורי 1 מ'	7.45 גרם אשלגן כלורי	זהירות
	עד 100 מ ל מים הנדסה גנטית
5 x פתרון מניות PBS מגנזיום אשלגן (PBS-ח"כ)	250 מ של 10 x PBS
	2.5 מ של MgCl 1 מ'2
	6.25 מ של 1 מ' אשלגן כלורי	זהירות
	למעלה עד 500 מ"ל מים Ultrapure H2O
15% Iodixanol	מ"ל של Optiprep צפיפות בינונית מעבר צבע	זהירות
	10 מ"ל של NaCl 5 מ'
	10 מ"ל של 5 x PBS-ח"כ
	17.5 מ ל מים הנדסה גנטית
25% Iodixanol	20.8 מ של Optiprep צפיפות בינונית מעבר צבע	זהירות
	10 מ"ל של 5 x PBS-ח"כ
	19.2 מ ל מים הנדסה גנטית
	µL 100 של פנול אדום
40% Iodixanol	33.3 מיליליטר Optiprep צפיפות בינונית מעבר צבע	זהירות
	10 מ"ל של 5 x PBS-ח"כ
	6.7 מ ל מים הנדסה גנטית
60% Iodixanol	50 מ של Optiprep צפיפות בינונית מעבר צבע	זהירות
	µL 100 של פנול אדום	זהירות
AAV טוהר שליטה
10 x טריס אצטט EDTA (תה) מאגר	44.8 g טריס בסיס	זהירות
	חומצה אצטית 11.4 mL (17.4M)
	3.7 גרם EDTA
	עד 1 מים הנדסה גנטית L
Agarose ג'ל	agarose הנדסה גנטית 0.8 g
	עד 100 מ ל 1 x תה מאגר
מאגר ג'ל	181.7 g טריס בסיס	זהירות
	1.5 g למען חברה דמוקרטית	זהירות
	להתאים את ה-pH ל 8.45 עם 1 M HCl	זהירות
	עד 500 מ"ל מים הנדסה גנטית
קטודה מאגר 10 x	בסיס טריס 121.14 g	זהירות
	179.2 g Tricine	זהירות
	1% מרחביות (w/w)	זהירות
	עד 1 מים הנדסה גנטית L
אנודת מאגר 10 x	בסיס טריס 242.3 g	זהירות
	עד 1 מים הנדסה גנטית L
	להתאים את ה-pH ל 8.9 עם 1 M HCl	זהירות
לדוגמה מאגר 5 x	עבור 20 מ:
	בסיס טריס 605 מ ג	זהירות
	4 g למען חברה דמוקרטית	זהירות
	10 מ ג Serva בלו ז
	12 גרם גליצרול
	להתאים את ה-pH ל 6.8 עם 1 M HCl, aliquot ולאחסן ב-20 ° C	זהירות
ג'ל הערימה	עבור 2 ג'לים:
	אקרילאמיד 400 µL	זהירות
	מאגר ג'ל 750 µL
	1.85 מ ל מים הנדסה גנטית
	TEMED 4 ΜL	זהירות
	20 µL 10% APS (v/v)	זהירות
	להוסיף TEMED ו-10% APS מיד לפני לשפוך את הג'ל. השתמש בשני כימיקלים ברדס כימי.
פתרון ג'ל	עבור 2 ג'לים:
	3.32 mL אקרילאמיד	זהירות
	3.35 מ ל ג'ל מאגר
	1.14 מ"ל מים הנדסה גנטית
	2.12 מ ל 50% גליצרול
	TEMED 6 ΜL	זהירות
	50 µL 10% APS (w/v)	זהירות
	להוסיף TEMED ו-10% APS מיד לפני לשפוך את הג'ל. השתמש בשני כימיקלים ברדס כימי.
Butanol רווי מים	10 מ ל n-butanol	זהירות
	1 מ"ל מים הנדסה גנטית
התראה: עיין בטבלה חומרים לקבלת הנחיות על השימוש של כימיקלים מסוכנים.

טבלה 1: ההרכב של הפתרונות הנדרשים.

1. Tri-תקנים של תאים HEK293T

הערה: נא עיין טבלה 1 להרכב של מאגרים, פתרונות שימוש בפרוטוקול.
הערה: ביצועים של קטע זה של הפרוטוקול לוקח כ 4 ימים.

1. הפשרת בקבוקון של כליה אנושית עובריים (HEK) תאים 293T באמבט מים להגדיר ב- 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: השתמש רק תאים יש כבר passaged פחות מ 20 x כדי להבטיח יעילות אופטימלית תרביות תאים.
2. זרע תאים HEK293T על צפיפות של 2 x 10³ 6 x 10³ תאים/cm² ב DMEM10 בקוטר 15 ס מ תא תרבות מנות.
3. לגדול תאי זרימה 70 – 80% בחממה סטנדרטי להגדיר ב- 37 מעלות צלזיוס, עם 95% לחות ו-5% CO₂.
   הערה: הייצור של אצווה אחת של וקטורים AAV באמצעות פרוטוקול זה דורש תא 18 תרבות מנות (קוטר 15 ס מ). תא זרימה של 70% - 80% מקביל 6 x 10³ 7 x 10³ תאים/cm², בהשתתפות 17 – 20 מ של DMEM10 תרבות בינוני.
4. הכנת polyethylenimine (פיי) / אן מערבבים ביחס ריכוז של 1/3.5 (w/w).
   1. להכין את התמהיל דנ א 18 מנות תרבות תא בצינור חרוט 50 מ ל אחד על ידי ערבוב 360 µg של pΔF6, 180 µg של pCapsid µg 180 של pTransgene ב- 18 מ של 150 מ מ NaCl.
   2. להפיץ את התמהיל DNA מעל שלושה 50 מ ל חרוט צינורות (6 מ של ה-DNA לערבב למחזור חרוט).
   3. להכין את תערובת פיי עבור תא שש מנות תרבות צינור חרוטי 50 מ על ידי ערבוב µg 840 של פיי (µg 1/µL) ב- 6 מ של 150 מ מ NaCl.
   4. להכין את תערובת פיי/DNA על-ידי הוספת 6 מ של המיקס פיי (להכין בשלב 1.4.3), טיפה על ידי ירידה, באחד הצינורות חרוט המכיל את התמהיל דנ א (להכין בשלב 1.4.2), תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: לאחר 20 דקות של דגירה, המיקס פיי/DNA יהפוך מעט עכורים.
5. קח 6 מנות התרבות התא מתוך החממה, לגמרי מחוק לגמרי האמצעי כל מנה תרבות בתוך תא למינארי. להסיר את העקבות של המדיום בשטיפת הכלים עם 5 מ של תמיסת פוספט באגירה של Dulbecco prewarmed (DPBS).
6. להבטיח את ההפצה של DPBS על פני השטח כולו בהטיית בעדינות את המנה.
7. בעדינות וארוקן את DPBS ומוסיפים 12 מ של DMEM1 כל מנה.
   הערה: הימנע ניתוק התאים על-ידי הוספת המדיום אט אט מן פיפטה ממוקם בקצה של המנה.
8. מערבבים את פיי/ה-DNA על-ידי pipetting למעלה ולמטה 3 x - 5 x. להוסיף 2 מ של המיקס פיי/DNA כל אחת מהמנות תרבות six תא באופן טיפה-מאת-שחרור, בזהירות להפיץ אותו על פני השטח כולו. ברגע המיקס מתווסף כל מנה, למקם את הכלים בחזרה בחממה. חזור על צעדים 1.4.3– 1.8 עבור המנות תרבות הנותרים.
9. דגירה את התאים transfected עבור 5 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, עם לחות 95% ו-5% CO_2-
10. להוסיף אוטם 12 נוספים של DMEM10 כל מנה תרבות מבלי להסיר את המדיום הקיימת מראש (סה כ נפח בינוני = 25 מ ל).
11. דגירה התאים transfected למעלה כדי 72 h תקנים שלאחר ב 37 מעלות צלזיוס, עם 95% לחות ו-5% CO₂.

משלים איור 1: מורפולוגיה תאים HEK 293T דמיינו ידי שלב ניגודיות מיקרוסקופ (משמאל) עם אישור של ביטוי GFP דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית הדמיה (מימין)- (א) תרביות תאים מוצלחת של תאים HEK293T עם pTransgene קידוד ה-GFP אושר על ידי קרינה פלואורסצנטית הדמיה. HEK293T (B) תאים שטופלו אך ורק תרביות תאים ריאגנטים להראות אין ביטוי GFP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

12. לקצור את המדיום ולהבין את תרביות תאים של פוסט-72 h תאים. להשתמש במגרדת תא להתנתק בקפידה תאים מן המנה תרבות. לאסוף את המדיום התאים צינור חרוטי 50 מ ל שמר על קרח.
    הערה: ניתן לאסוף את התוכן של שתי מנות של התרבות תאים לתוך צינור חרוטי בודד 50 מ. בסוף שלב זה, כל אחד הצינורות תשעה יכיל כ 50 מ של מדיום.
13. Centrifuge צינורות חרוט ב x 420 גרם 10 דקות ב 4 ° C עם האצה והאטה לצנטריפוגה מוגדר מקסימום.
14. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע מהצינור כל. אל תשתמש פיפטות כדי למנוע האובדן של חומר. במקום זאת, בעדינות שופכים את תגובת שיקוע לתוך מיכל האשפה ולמקם הצינורות המכילים את כדורי תא בחזרה על הקרח.
15. Resuspend גלולה כל תא ב- 2 מ של פירוק מאגר ישירות בצינור חרוט 50 מ על-ידי pipetting למעלה ולמטה x 5 – 10. לא מערבולת. מאגר של lysates משפופרות שלושה ביחד.
    הערה: בשלב זה, יהיו 50 מ ל שלוש חרוט, צינורות-כל אחד המכיל 6 מ של התאים resuspended במאגר פירוק.

2. AAV וקטור טיהור

הערה: הביצועים של סעיף פרוטוקול זה לוקח כ- 1 יום. בצע את השלבים הבאים בעת ובעונה אחת על כל אחד 50 מ ל שלוש חרוט הצינורות המכילות את התאים resuspended במאגר פירוק (ראה בהערה הקודמת).

1. הקפאה והפשרה התאים resuspended 3 של x lyse אותם ולשחרר את החלקיקים AAV. לבצע את הצעד הקפאה על ידי הנחת הצינורות בתוך דלי המכיל קרח יבש מעורב עם אתנול. לבצע מפשיר על-ידי הצבת מיד את התאים בתוך אמבט מים להגדיר ב- 37 מעלות צלזיוס.
2. לאחר השלב השלישי המפשיר, צנטריפוגה ב x 1,167 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
   הערה: גלולה מורגש המורכב שאריות תאים יכול להיווצר. בעת טיפול הצינורות, להימנע תנועות פתאומיות כמו אלה יכול לגרום להתנתקות בגדר לתוך תגובת שיקוע, אשר תסכן את הטוהר של הווקטור הסופי.
3. להעביר בזהירות את supernatants כדי לנקות צינורות חרוט 50 מ ל ולאחר מכן להוסיף נוקלאז כל שפופרת, כדי ריכוז סופי של 50 U/mL supernatant.
4. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. מערבולת הצינורות חרוט 50 מ ל בעבודת יד כל 10 דקות כדי להבטיח כי נוקלאז ביסודיות מעורבב עם תגובת שיקוע.
5. להבהיר את תגובת שיקוע על ידי צנטריפוגה ב x 13,490 g למשך 20 דקות ב 4 º C.
6. לצרף מסנן מיקרומטר 0.45 מזרק 10 מ"ל ומניחים אותו על גבי צינור חרוטי נקי 50 מ. בזהירות להסיר את הבוכנה ולמלא את המזרק עם תגובת שיקוע מהשלב 2.5.
7. השתמש הבוכנה כדי לכפות את lysate דרך המסנן. השתמש במסנן חדש עם מזרק לכל שפופרת של תגובת שיקוע שהושג בשלב 2.5.
   הערה: השבר שהושג המכונה 'גולמי lysate'.
8. להכין את כל השברים iodixanol 15%, 25%, 40% ו- 60% חרוט ארבעה צינורות נפרדת 50 מ ל, ובהתאם להוראות טבלה 1.
9. להכין את מעברי צבע iodixanol שלושה צינורות ultracentrifugation באמצעות הסדר הבא של שברים iodixanol: 8 מ של 15% iodixanol, 5.5 מ של 25% iodixanol, 5 מ של 40% iodixanol ו- 4.5 מ של 60% iodixanol.
   התראה: Iodixanol יכול לגרום לגירוי בעיניים, בעור של ספינלי את מערכת העיכול, מערכת הנשימה. בעת טיפול מעברי צבע iodixanol, ללבוש כפפות ולעבוד תחת תא למינארי.
   1. פיפטה 8 מ של 15% iodixanol לתוך כל שפופרת ultracentrifugation.
   2. פיפטה 5.5 mL של 25% iodixanol פתרון לתוך צינור חרוטי נקי 50 מ ל (איור 1 א').
   3. להשתמש על פיפטה פסטר שאינו בוגר (כמו בצוואר של הצינור ultracentrifugation צר מדי פיפטות בוגר קונבנציונלי) כדי בזהירות שכבה 5.5 mL של הפתרון iodixanol 25% להלן הפתרון iodixanol 15% (איור 1B).
      הערה: זה יכול להיות בהצלחה מושגת על-ידי הוספת את iodixanol בשלושה צעדים מאז פיפטה פסטר מסוגלת להחזיק רק בסביבות 2 מ"ל.
   4. להוסיף 40% ל-60% iodixanol הפתרונות כפי שמתואר בשלב 2.9.3. נא לא להפריע את הממשקים iodixanol שונים במהלך לקרנל.
      הערה: הכנה נכונה של שברים iodixanol שונים יכול להיות שמחייבות אישור חזותי הודות פנול אדום להוסיף שברים iodixanol (עיין בהוראות טבלה 1). מאז כל שבר יש צפיפות ספציפיים, הם לא התמזגות במהלך השלב לקרנל, אם זה מבוצע כראוי (עיין איור 1C).
10. שכבת הגולמי את lysate על גבי המילוי ההדרגתי iodixanol 15% עם פיפטה פסטר. המשך ירידה על ידי שחרור כדי להימנע מהפרעה הממשק בין הגולמי את lysate ואת הפתרון iodixanol.
11. למלא את הצינור ultracentrifugation פירוק מאגר עד מניסקוס מגיע לבסיס של שפופרת הצוואר על מנת להבטיח שהצינורית לא קרסו תחת הכוחות גבוהה מאוד שנוצרו במהלך ultracentrifugation (איור 1C).
12. סגור את הצינורות ultracentrifugation להשתמש במכסים המתאים. השתמש בקנה מידה דיגיטלי כדי לוודא שלכל הצינורות ultracentrifugation שלושה שיש באותו המשקל. להתאים את המשקל, במידת הצורך, על-ידי הוספת עוד מאגר פירוק מעל 'גולמי lysate'.
    הערה: הפרש המשקל בין הצינורות ultracentrifugation חייב להיות מתחת 0.1 g כדי להבטיח את הפעולה בטוחה של ultracentrifuge. Ultracentrifuges אמורה לשמש רק על ידי צוות מיומן כהלכה, הינם חלקים מסוכנים של ציוד.
13. Centrifuge הצינורות ב 301,580 x g, שימוש קבוע-זווית טיטניום הרוטור, עבור 1 h ו- 40 דקות ב 12 ° C, באמצעות המהירות המרבית של האצה והאטה.
14. להוסיף בזהירות מחט בוטה מפלדת 40% או 60% iodixanol ממשק.
    1. לצרף את המחט מזרק 5 מ ל (איור 1E).
    2. האחות רק השבר ברורה, החלקיקים וקטור.
       הערה: לנפח הכללי שנאסף הוא כ 2.5-3 מ. הימנע האוסף של חומר מממשק 25-40%, מאז זה יהיה להגדיל את רמת ההידבקות באצוות וקטור הסופי, בשל נוכחותם של חלבונים שאינם רצויים.
    3. לעבד את השבר שנאספו (desalting וריכוז) או לאחסן אותו בן לילה ב 4 º C.

איור 1: כיוונון עבור וקטור עוקבות אוסף וטיהור הדרגתיות iodixanol. (א) לפני pipetting iodixanol שונים מעברי הצבע לתוך הצינור ultracentrifugation, pipette אמצעי הולם של כל פתרון iodixanol לתוך צינור חרוטי נפרדים. פיפטה (B) ואז להשתמש פסטר להעביר באופן רציף כל פתרון iodixanol הצינור ultracentrifugation: שכבות של ריכוז גבוה יותר ויותר iodixanol אמור להתווסף בחלק התחתון של הצינור מתחת לשכבות קודמות. (ג) שכבה הווקטור גולמי lysate על גבי פעם מעבר הצבע הוכן. וקטור אוסף המערכת משתמשת מחטים חדים, מציג סיכון של פציעות 'needlestick'. (ד) A-נירוסטה 316-מזרק המחט מוחדרת דרך מעבר הצבע iodixanol עד הממשק iodixanol 60% / 40%. וקטור (E) חלקיקים נמצאים בשלב iodixanol 40% והם נאספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

3. desalting וריכוז של וקטור AAV

הערה: ביצועים של קטע זה של הפרוטוקול לוקח כ 2 h.

1. Prerinse קרום מסנן של צנטריפוגלי מסנן על-ידי הוספת 5 מ ל 1-PBS-ח"כ וצנטריפוגה עבור 5 דקות ב x 4,000 גרם.
2. הוסף 5 מ של 1 x PBS-ח"כ כדי השבר וקטור AAV שנאספו, לערבב ולאחר מכן להוסיף את הנפח הכולל המסנן. על תוספת של 1 x PBS-ח"כ, עכירות נצפית. צנטריפוגה ב 4,000 x גרם עד האחסון הנוכחי מסנן בצורת חרוט הופחת ל 1 מ"ל. למחוק את הזרימה דרך שהצטברו בצינור אוסף החיצוני.
3. להוסיף 13 מיליליטר 1 x PBS-ח"כ מסנן בצורת חרוט, חזור צנטריפוגה צעד כמה פעמים לפי הצורך (מינימום 3 x), עד שם הוא עכירות עוד לא ציין מתי טרי 1 x PBS-ח"כ נוסף.
4. בגמר לשטוף צעד, להוסיף 13 מיליליטר PBS + 0.01% (v/v) ללא יונית חומרים פעילי שטח, צנטריפוגה ב x 4,000 גרם עד האחסון מופחתת ל- 300-350 µL.
5. לאסוף את השבר הנותר נוכח מסנן על ידי pipetting אמצעי האחסון כולו לתוך צינור microcentrifuge הילך סטרילי.
   הערה: השבר הזה מכיל את הווקטור AAV desalted ומרוכז. בשלבים הבאים של פרוטוקול זה, שבר זו נחשבת השבר 'ראשי'. כדי להתמודד עם הצינור מתחת למכסה המנוע ואחסן אותו ב 4 º C.
6. לשטוף את המסנן עם µL 200 1 x PBS-ח"כ כדי לאסוף את החלקיקים וקטור לשארי נשמר מסנן. לאסוף צינור microcentrifuge סטרילי.
   הערה: זהו וקטור מדולל מניה, אשר עשוי להיות מתאים עבור יישומים מסוימים הדורשים התחתון וקטור titers. צעדים עתידיים, שבר זו נחשבת השבר "משניים".
7. לאחסון לטווח קצר, לאחסן את fraction(s) וקטור ב 4 ° C (פחות מ- 2 שבועות). Aliquot, חנות וקטור ב ‑20 ° C כאשר נדרש לאחסון לטווח ארוך.
8. לבצע בקרת איכות כמתואר בסעיף 4.

4. טיטור של וקטור על ידי תגובת שרשרת פולימראזית כמותיים

הערה: ביצועים של קטע זה של הפרוטוקול אורכת כ-3 שעות.

1. עיקול רגיל
   1. Linearize את transgene-ביטוי פלסמיד (pTransgene) משמש תרביות תאים תאים HEK-293T בסעיף 1.
   2. הכנת המיקס תקציר הגבלת צינור microcentrifuge 0.5 mL (עיין בטבלה 2 עבור ההרכב של המיקס תקציר הגבלה).
      הערה: התאם את ההרכב של המיקס תקציר הגבלה על פי האנזים המשמש את ההנחיות הקשורות מהיצרן.
   3. דגירה המיקס תקציר הגבלה עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
   4. בדוק היעילות של עיכול הגבלה על-ידי הפעלת את פלסמיד ליניארית ב- 0.8% (w/v) agarose ג'ל ב- 100 וולט לעיכול מלאה ח' 1 פלסמיד צריך לייצר קטע אחד של גודל מוגדר.
   5. לטהר את פלסמיד ליניארי הדנ א באמצעות ערכת טיהור PCR, בעקבות ההוראות של היצרן²⁴, ולמדוד את ריכוז הדנ א עם ספקטרופוטומטרים על ידי מדידת בליעת ב 260 ננומטר. לאחר טיטור, לאחסן את aliquot הנותרים של פלסמיד ליניארי-‑20 ° C לשימוש נוסף.
   6. לחשב את המולקולות (כלומר עותקים DNA) של המניה פלסמיד לכל microliter כדלקמן.
      1. ראשית, לחשב את המשקל המולקולרי של פלסמיד. בהנחה כי המשקל הממוצע של זוג בסיס DNA (bp) הוא 650 Daltons (Da) ושוקל את השומה אחת של bp 650 g, המשקל המולקולרי של כל תבנית ה-DNA גדילי כפול יכול להיות מוערך על ידי המכפלה של אורך (bp), משקל לכל זוג בסיסים.
         משקל מולקולרי פלסמיד [g/mol] = גודל פלסמיד [bp] x 650 [Da/bp]
      2. בשלב הבא, לחשב את מספר שומות של פלסמיד לכל microliter.
         שומות של פלסמיד לכל microliter = ריכוז פלסמיד [g/µL] / משקל מולקולרי פלסמיד [g/mol]
         הערה: ההופכי של משקל מולקולרי הוא המספר של שומות של פלסמיד נוכח 1g של החומר.
      3. לאחר מכן, לחשב את מספר מולקולות פלסמיד לכל microliter, באמצעות מספר אבוגדרו של (6.022 x 10²³ מולקולות/שומה).
         מולקולות של פלסמיד לכל microliter = שומות של פלסמיד לכל microliter [שומות/µL] x מספר אבוגדרו [מולקולות/שומה]
      4. לבסוף, לדלל את המניה פלסמיד (מולקולות/µL) כדי לקבל פתרון µL 100 עם הריכוז הרצויה של עונה 1 פרק 10⁹ מולקולות (וקטור הגנום (vg) לכל microliter).
         פלסמיד מניות (100 µL) = (הרצוי ריכוז [מולקולות/µL] x 100 µL) / מולקולות פלסמיד [מולקולות/µL]
   7. להפוך דילולים טורי של המניה פלסמיד (1 x 10⁹ vg/µL) triplicates:
      µL 10 עונה 1 פרק 10⁹ פלסמיד vg/µL מניות + 90 µL של H₂O = פתרון vg/µL⁸ עונה 1 פרק 10
      µL 10 עונה 1 פרק 10⁸ דילול vg/µL + µL 90 של H₂O = פתרון vg/µL⁷ עונה 1 פרק 10
      µL 10 של דילול vg/µL⁷ עונה 1 פרק 10 + 90 µL של H₂O = פתרון vg/µL⁶ עונה 1 פרק 10
      µL 10 עונה 1 פרק 10⁶ דילול vg/µL + µL 90 של H₂O = פתרון vg/µL⁵ עונה 1 פרק 10
      להמשיך לקבל פתרון vg/µL¹ עונה 1 פרק 10.
   8. לשמור את דילולים טורי של המניה פלסמיד רגיל על הקרח עד מעמיסים אותם על הצלחת qPCR (סעיף 4.3).

רכיב	כמות
10 x מאגר אנזים הגבלה	5 ΜL
אנזים הגבלה	ΜL 2, 5
פלסמיד	5 µg
H2O	µL עד 50

טבלה 2: הגבלת תקציר מיקס ההרכב.

טבלה 3: מחשבון נפח פלסמיד מניות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.

2. מן הווקטור AAV החילוץ דנ א
   1. לערבב 2 µL של AAV וקטור במלאי (השבר העיקרי מהשלב 3.5) עם µL 198 של DNase אני מאגר (1 x) רצועת צינורות (המבחנות) ולהוסיף 2 µL של DNase אני.
      הערה: DNase שלבזות את כל חומר גנטי שאינו נכלל בתוך capsid וקטור (אשר לעוות את התוצאות qPCR). פתרון זה נקרא דילול 'dil1 x 10^-2'.
   2. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, ואחריו 10 דקות ב 95 ° C.
      הערה: הפרוטוקול ניתן לעצור בנקודה זו, החומר ניתן לאחסן ללא הגבלת זמן-4 ° C, כדי למנוע הידרדרות המוצר.
   3. להוסיף 2 µL של proteinase K הפתרון dil1 x 10^-2 (שלב 4.2.1), תקופת דגירה של 60 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, ואחריו 20 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס.
      הערה: שלב זה לפרק את capsid וקטור AAV ונשחרר את הגנום וקטור AAV הפתרון. להוסיף proteinase K עודף החלבון (capsid) תוכן של המדגם אינו ידוע. שימו לב, זה חיוני כדי להבטיח כי כל פעילות proteinase K הוסר על ידי דנטורציה, לפני qPCR, כדי למנוע בעיות עם השפלה פולימראז (חלקית) המשפיעים על התוצאה הסופית.
   4. הכן 1:10 דילולים טורי של proteinase K שטופלו dil1 x 10^-2 הפתרון (שלב 4.2.3) 1.5 mL microcentrifuge צינורות כדלקמן:
      10 µL dil1 x 10^-2 + 90 µL של H₂O = dil1 x 10^-3 דילול
      10 µL dil1 x 10^-3 + 90 µL של H₂O = דילול dil1 x 10^-4
      µL 10 of dil1 x 10^-4 + µL 90 של H₂O = dil1 x 10^-5 דילול
   5. שמור את דילולים טורי של DNA שחולצו מן הווקטור על הקרח עד מעמיסים אותם על הצלחת qPCR (סעיף 4.3).
3. טיטור מאת SYBR Green המבוסס על זיהוי qPCR
   1. היכונו המיקס מאסטר qPCR בשפופרת microcentrifuge 1.5 mL, המדגם והן את הסטנדרטים. השתמש µL 10 של SYBR Green מאסטר מיקס, µL 1 של פריימר לפנים (המניות 10 מיקרומטר), µL 1 של פריימר הפוכה (10 מיקרומטר מניות) ו- 3 µL של H₂O לכל תגובה. ראה הפרוטוקול בטבלה 4 עבור רצפי פריימר.
   2. Pipette את המיקס מאסטר qPCR למעלה ולמטה, אבל לא מערבולת.
   3. הוסף µL 15 של מיקס מאסטר qPCR, ואחריו גם µL 5 של העקומה סטנדרטי מוכן בסעיף 4.1 או ה-DNA שחולצו מן הווקטור AAV בסעיף 4.2, כל טוב. לכלול משלוש בארות המכיל רק את qPCR מאסטר מיקס, כפקד שלילי. עיין איור 2 עבור הפריסה צלחת.
   4. לאטום את הצלחת עם סרט איטום ו centrifuge בקצרה את הצלחת qPCR ב x 1,500 גרם ל 30 s-4 מעלות צלזיוס.
   5. להפעיל את תגובת qPCR מבוסס על הצלחת בזמן אמת PCR הגברה וזיהוי מכשיר, באמצעות התנאים הציע ב טבלה 5.

פריימר שם	רצף
פריימר לפנים	5'-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3'
פריימר הפוכה	5'-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3'

טבלה 4: פריימר רצפים תוכנן כנגד האמרגן כקבוצת.

איור 2: צלחת פריסה עבור טיטור וקטור מבוסס qPCR. הדגימות מסומנים בצבעים: ירוק = עיקול רגיל; כחול = H₂O שליטה; גריי = שבר הראשי; כתום = שבר משני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שלב	זמן	טמפרטורה	מחזורים	המטרה
הדגירה קדם	5 דקות	95 ° C	x1	DNA דנטורציה של פולימראז הפעלה (חם-start התגובה).
הגברה	10 דקות	95 ° C	x1	. שכפול ה-dna אולי ניתן למטב את הגדרות אם נעשה שימוש חלופי תחל עם טמפרטורות שונות מחזק.
	10 s	95 ° C	x40
	40 s	60 ° C
	1 s	72 ° C
קירור	10 s	40 ° C	x1	צלחת קירור. סוף PCR.

טבלה 5: פרוטוקול אופניים תרמית עבור SYBR מבוסס-ירוק qPCR טיטור.

4. ניתוח נתונים כדי לקבוע את AAV וקטור כייל נוגדנים
   1. למלא את התאים הנתונים בגיליון האלקטרוני (טבלה 6A) עם הערכים Ct השיג עבור דילולים שונים המדגם סטנדרטי מוכן בסעיף 4.1 ליצירת עיקול רגיל.
      הערה: המשוואה של העקומה הרגיל יוצג (y = ln (x) + b) יחד עם יעילות² R(טבלה 6B). QPCR חייב להיות יעילות ל 100 אחוז ו- R² קרוב 1.0 (≥ 0.96).
   2. השתמש את הערכים המחושבים של ו b כדי למלא אותם התאים הנתונים בגיליון האלקטרוני (טבלה 6C).
   3. להשלים את הגיליון האלקטרוני עם הערכים Ct השיג עבור דילולים שונים המדגם AAV המבושלות בסעיף 4.2.
   4. לחשב את ממוצע AAV וקטור כייל נוגדנים ב וקטור הגנום לכל microliter של 'השבר הראשי' על-ידי שימוש בנוסחה הבאה:
      
      הערה: הגורם 400 משמש הגנום נטושים יחיד, בעוד sc הגנום להשתמש פקטור הכפלה של 200²⁵. . למעשה, כמויות ה-DNA כפול במהלך כל מחזור qPCR, sc-DNA הוא זיהה 2 x לעומת הגנום האס. אס. המטרה של טיטרציה היא לחשב את הריכוז מבחינת הגנום וקטור לכל microliter. תיקון הוא הכרחי עבור הפעלת את qPCR בעת שימוש µL 2 של הפעלת חומר (שלב 4.2.1). דיל מייצג את הגורמים לדילול מהשלב 4.2.4. ניתן לחשב את כייל של השבר וקטור AAV "משנית" (שלב 3.6) בו זמנית.

טבלה 6: תבנית עבור ניתוח נתונים qPCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

5. טוהר שליטה על ידי עמודים מרחביות צביעת כסף

הערה: ביצועים של קטע זה של הפרוטוקול לוקח כ 5 שעות.

1. השתמש אתנול 70% (v/v) לנקות ביסודיות את צלחות זכוכית המשמש ליציקת של ג'לים.
2. להרכיב מערכת הליהוק ג'ל. ודא כי שהסוליות של הזכוכיות הם לא מרוסקת, כדי למנוע דליפה של תערובת אקרילאמיד בעת השלכת את הג'ל.
3. להכין הערימה את הפתרונות ג'ל פתרון שני צינורות חרוט נפרד 50 מ. השמט את tetramethylethylenediamine (TEMED) ו- 10% (w/v) קירור (APS), כפי שהם אחראים פלמור של הג'ל. להוסיף אותם מיד לפני השלכת את הג'ל.
   הערה: האחוז הסופי של אקרילאמיד הג'ל השפעות לפרופיל ההפרדה של החלבונים: בדרך כלל, ריכוז 10% (v/v) הסופי של אקרילאמיד יהיה מספיק כדי לבדוק את טוהר הכנה וקטור AAV.
4. מערבבים בעדינות על ידי מתערבל הצינור המכיל את הרכיבים ג'ל. לא מערבולת, מאז חמצון מוגזם עלול לפגום הפילמור.
5. הוסף TEMED ו 10% (w/v) APS לפתרון ג'ל פתרון. לערבב, ואז שופכים לתוך המחזיק ג'ל עד שהוא מגיע 1-2 ס מ מתחת לקצה העליון של לוח הזכוכית הקטנה.
6. מניחים שכבה של רווי מים butanol בראש התערובת אקרילאמיד. פעולה זו תבטיח את היווצרות של משטח שטוח בזמן הפילמור. אין להשאיר את הג'ל תחת אלכוהול יותר מ 30 דקות זה מייבשים את הג'ל, לפגום את תפקידה.
   התראה: Butanol. הוא דבר מסוכן במקרה של מגע עם העור הוא גם מציג סכנת שריפה. . לטפל.
7. המתן הג'ל פולימריזציה ולאחר מכן יוצקים את butanol. עצה: בדוק אם לערבב ג'ל עודף בצינור התחזק. הפילמור מתרחש בתוך פחות מ 20 דקות לשטוף פני השטח של הג'ל עם H₂O, ואז לייבש אותו בעזרת מגבות נייר, דואגת שלא להפריע את פני השטח של הג'ל.
8. להוסיף TEMED ו 10% (w/v) APS לג'ל הערימה ויוצקים את הג'ל לתוך המחזיק ג'ל על הפרדת הג'ל.
9. מקם את המסרק שסופקו הג'ל. בצע פעולה זו עם תנועה קבועה אחת כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בתוך הבארות.
10. להמתין לפחות 20 דקות על הג'ל פולימריזציה. עצה: בדוק שאם מערבבים הג'ל עודף הצינור חרוט התחזק.
11. להכין את תערובות שני (טבלה 7) עבור העיקרית והן את AAV משני וקטור שברים (צעדים 3.5, 3.6, בהתאמה).

	כמות גבוהה	סכום נמוך
צילומים של וקטור AAV	5 ΜL	1 ΜL
5 x דוגמת המאגר	3 ΜL	3 ΜL
H2O	7 ΜL	11 ΜL

טבלה 7: ההרכב של תערובות הדגימה הדרושים עבור צביעת כסף.

12. מלא denature את תערובות לדוגמה על ידי חימום אותם עבור 5 דקות ב 95 ° C. להרכיב למיכל אלקטרופורזה, תשומת לב לכיוון האלקטרודה.
13. למלא את המיכל 1 x מאגר הקתודה בתוך מכלול אלקטרודה ו- 1 x אנודת מאגר מבחוץ.
    הערה: מאגר אנודת ניתן למחזר מ לרוץ--לרוץ. עליך להשתמש תמיד מאגר קטודית טריים.
14. להסיר הג'ל המסרק ונקה הבארות של הג'ל עם מאגר קטודית 1 x.
15. לטעון µL 1 של הסולם חלבון בבאר. לטעון את תערובות מדגם בבארות שונים על הג'ל אותו (איור 3). להפעיל את הג'ל 50 V עד הדגימות להזין את הג'ל פתרון. אז תגביר את המתח ל-100 V עד לחזית לצבוע את הגבול התחתון של הג'ל מגיע.
16. לחלץ את הג'ל בקפידה הזכוכיות, את הכסוף מכתים קיט (לפי הוראות היצרן²⁶) כדי להמחיש את חלבונים ויראלי (VP1 VP2, VP3 subunits) המרכיבות את capsid AAV, כמו גם כדי לבדוק אם אפשרי חלבון זיהום (איור 3).

איור 3: הערכה של טוהר וקטוריות באמצעות מרחביות-דף וצביעת כסף- באמצעות ג'ל Tricine-מרחביות, 5 µL של ההכנות וקטור השונים הופרדו. חלבונים אותרו לאחר מכן על ידי צביעת כסף. וקטורים נחשבים טהור כאשר VP1 (82 kDa), VP2 (67 kDa), ו- VP3 (60 kDa) גלויים ב- 1:1: יחס 10 (ליין 1), ללא רקע מוגזמת (ליין 2) או שאינם ספציפיים להקות (ליין 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תוצאות

AAV9 נחשב, עד לאחרונה, להיות serotype וקטור AAV היעיל ביותר חוצה BBB ו transducing תאים של מערכת העצבים, בעקבות ניהול היקפיים. הושגה התקדמות משמעותית בעיצוב capsid כאשר Deverman et al. דיווח על השימוש של שיטת הבחירה capsid בשם Cre מבוססי רקומבינציה האבולוציה, ממוקדות AAV (צור)¹⁷. באמצעות שיטה זו, הם זיהו capsid חדש, בשם PHP. B, הם דיווחו מסוגל מגלי רוב האסטרוציטים הנוירונים באזורים CNS מרובים, בעקבות הזרקת מערכתית¹⁷. בשלב זה, זה צריך להיות ציין כי למרות PHP. B מספק תוצאות חיוביות בעכברים C57/Bl6 (אשר היה המתח המשמשים את הניסויים בידוד הראשוני), דיווח ראשוני מציע שהיעילות שלה עשויים להשתנות באופן תלוי-זן. לניסויים נוספים וויל, בלי ספק, לשפוך אור נוסף על בעיה זו³¹.

עם זאת, למרות בעיות אלה, PHP. B מציע אפשרויות מרגשות עבור מניפולציה ג'ין לא פולשנית של מערכת העצבים של עכברים, כולל הוכחה הרעיון ג'ין טיפול ניסויים במודלים של המחלה. לכן, בחרנו להעריך את היעילות של transgene ביטוי באמצעות PHP. B נגד AAV9, אשר היה הווקטור "תקן הזהב" עבור התמרה חושית CNS בעקבות ניהול היקפיים מאז 2009². כדי לבצע השוואה ישירה של שני אשר נגרמו מהזנים אליהם, בתנאים מיטביים עבור ביטוי transgene, השתמשנו תצורה של הגנום sc³². שני וקטורים נשא את transgene של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת השליטה של האמרגן β-אקטין (כקבוצת) עוף בכל מקום. עכברים C57/Bl6 נקבה ביום כמחנכת 42 (כ 20 גר' במשקל) קיבל מנה של עונה 1 פרק 10 vg¹² לכל העכבר של גם scAAV2/PHP. B-כקבוצת-GFP או scAAV2/9-כקבוצת-GFP. וקטור המינהל היה שבוצעו באמצעות הזרקת וריד הזנב. הניסויים אושרו על ידי הוועדה האתית של ליובן KU.

Postinjection שלושה שבועות, העכברים עברו transcardial זלוף עם PBS קר כקרח, ואחריו 4% (w/v) paraformaldehyde קר כקרח (PFA). המוח שלהם נבצרו ועברתי עוד יותר postfixation על ידי דגירה לילה אותו לשבועיים, לפני העברת 0.01% (w/v) Na-אזיד/PBS לאחסון עד ניתוח נוסף. לאחר מכן, המוח היו למחלקה באמצעות מיקרוטום רוטטת ולאחר אימונוהיסטוכימיה בוצעה על 50 מיקרומטר חלקים עבה.

כדי להעריך את רמות הביטוי transgene, קטעים היו מוכתמים העיקרי נוגדנים נגד GFP (ארנב אנטי-GFP), עם זיהוי באמצעות נוגדנים משניים מצומדת כדי הפלורסנט (אנטי-ארנב אלקסה עבור חיל הים 488) (איור 4A, B ). מדידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית (ביחידות שרירותי [au]) אישר עלייה משמעותית בביטוי GFP כאשר sc הגנום, את PHP. B capsid שימשו ביחס AAV9. העלאות GFP נצפו במוח (2105 ± 161 לעומת 1441 ± 99 au; p = 0.0032), המוח הקטן (2601 ± 196 לעומת 1737 ± 135 au; p = 0.0032), ואת גזע המוח (± 319 3082 לעומת 2485 au ± 88; p = 0.0038) (איור 4C).

איור 4: משלוח מערכתית של scAAV2/PHP. B-כקבוצת-GFP מוביל ביטוי GFP גבוהה ב מערכת העצבים. scAAV2/PHP. B-כקבוצת-GFP או scAAV2/9-כקבוצת-GFP (1 x 10¹² vg/עכבר) היה מנוהל בת 6 שבועות לעכברים C57/Bl6 באמצעות הזרקת וריד הזנב. GFP זוהה באמצעות אימונוהיסטוכימיה על המוח הילתית סעיפים 3 שבועות postinjection. (א) המוח לבין (B) המוח, גזע המוח מוצגים. גודל ברים = 1 מ מ. (ג) כימות של עוצמות קרינה פלואורסצנטית היחסי בוצע כדי לקבוע את הרמות של אות ה-GFP מושגת עם כל וקטור (סעיפים 10 לכל עכבר; שלושה עכברים לכל וקטור קבוצה). בוצע מבחן ANOVA בכיוון אחד, ואחריו דו-זנבית של סטודנט t-מבחן; הנתונים מבוטא הממוצע ± סטיית התקן; p < 0.01; au. יחידות שרירותיות. pCapsid, המשמש לייצור וקטור AAV, מכיל את הגן נציג של serotype 2 הוא ג'ין קאפ מ serotype PHP. B או AAV9, בהתאם. דמות זו שונתה מ רינקון et al.³². אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

הייצור של וקטורים AAV רקומביננטי המתוארים כאן שימושים חומרים וציוד השכיחים ביותר בביולוגיה מולקולרית מעבדות ומתקני תרבות תא. זה מאפשר למשתמש לקבל וקטורים AAV כיתה טהור, פרה, יכול לשמש למטרה מספר סוגי תאים ורקמות על פני מגוון של יישומים במבחנה , ויוו . אחד היתרונות הגדולים של פרוטוקול זה, בהשוואה לאחרים (קרי, המבוסס על CsCl טיהור), הוא זמן העבודה קצר יותר הדרושים. מוכן לשימוש AAV וקטורים הם להשיג מקסימום של 6 ימי עבודה לאחר תרביות תאים הראשונית של תאים HEK293T.

מספר גורמים יכולים להשפיע באופן שלילי על התשואה הסופית או האיכות של הווקטור AAV. תרביות תאים עניים יעילות היא אחת הסיבות העיקריות התשואה נגיפי נמוך³³. המלצה העיקרי הוא השימוש של תאים HEK293T, כי יש לא היה passaged יותר מ-20 פעמים וגם אין זרימה תא גדול מ- 90% בזמנו של תרביות תאים²¹. בנוסף, שיטת תרביות תאים שנבחרה יש השפעה גדולה על התוצאות. פרוטוקול זה מבוסס על השימוש של פיי. פיי הוא פולימר cationic עם היכולת להעביר אקסוגני DNA גרעין התא באמצעות הדור של קומפלקסים של פולימר ו חומצות גרעין, הידועה בשם polyplexes, אשר נלקחים על ידי תא הנסחרות ויה endosomes³⁴. תרביות תאים מבוססת-פיי הוא קל ומהיר לביצוע, לעומת שיטות אחרות בשימוש נרחב, כגון המשקעים שיתוף של ה-DNA עם סידן פוספט³⁵. גם, תרביות תאים מבוססת-פיי הוא הרבה יותר זול בהשוואה הציג לאחרונה בשיטות אחרות, כגון השימוש של ליפידים cationic ותקנים בתיווך מגנט³⁶.

האסטרטגיה טיהור ממלא תפקיד מפתח בפרוטוקול. לעומת שיטות אחרות, purifications iodixanol מבוססי נוטים מכילות אחוז גבוה יותר של חלקיקים נגיפיים ריקה (20%)²⁰. זה קוזז, במידה, על ידי העובדה טיהור מבוסס-iodixanol תוצאות באופן שגרתי AAV וקטור ההכנות עם יחס של חלקיקים-אל-infectivity של פחות מ 100. זה מייצג שיפור משמעותי לעומת נהלים קונבנציונאלי המבוסס על CsCl, אשר הינו אובדן משמעותי של חלקיקים infectivity דיווחו³⁷. עוד שיטה חלופית נפוצות לטהר AAV וקטורים הוא טיהור מבוססי וואקום. עם זאת, שיטה זו יש את החיסרון העיקרי אשר נדרשת עמודה ספציפית לכל capsid וקטור בשימוש: לדוגמה, בעוד AAV2 הוא מבודד בסגנון קלאסי באמצעות עמודות הפארין, מתודולוגיה זו אינה פועלת עם AAV4 ו- AAV5, אשר לא ניחנת הפארין מחייב אתרים על שלהם capsids³⁸. בהתחשב בעובדה לטיהור גזים היא גם יקר, טיהור מבוסס-iodixanol היא בדרך כלל מתאימה יותר עבור מעבדות שרוצים לייצר באיכות גבוהה קבוצות של וקטורים AAV על בקנה מידה קטן^{33,39, 40}. עם זאת, על מנת למקסם את התשואה הסופית וטוהר של וקטור, קיצוני טיפול נחוץ בעת ביצוע מעברי הצבע iodixanol. שברים iodixanol שונים יש להעביר את הצינור ultracentrifugation באמצעות פיפטה פסטר סטרילי עצה אשר נוגעת בקיר של הצינור: iodixanol צריך להיות מגורש מן פיפטה לאט ובאופן רצוף. כל החלקיקים וקטור להצטבר בשכבת iodixanol 40%, טיפול צריך לנקוט כדי להבטיח כי הממשקים ההדרגתי אל תערבב בין²⁰. לבסוף, השבר המכיל את הווקטור צריך להיות התאושש על ידי החדרת מחט בוטה-נירוסטה עם לאמוד לא יותר מאשר 20 G... כדי ששחזור וקטור, השבר ברור צריכים להיות מאוחזרים בשלמותו. במהלך שלב זה, תזמון הוא קריטי. כדי להימנע להתפשר על הטוהר של ההכנה, זה חיוני כדי לעצור את האוסף לפני בשלבים אחרים (מזהמים) של מעבר הצבע נאספים.

הבדלים כייל וקטור שהושג ניתן גם לייחס את היכולת הפנימית של וקטור לייצר חלקיקים הארוזה. השוואה בין שונים AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם הראה כי וקטורים AAV מסוימים הם יותר קשה לייצר בבית כייל נוגדנים גבוה יותר מהאחרים (למשל, AAV2)⁴¹. משקעים של וקטור, במהלך השלב desalting, יכול להיות סיבה אפשרית כייל נמוך יותר, למנוע בקלות על ידי הימנעות overconcentration³³. יתר על כן, זה גם אפשרי כי היעילות של iodixanol מבוססי הדרגתי טיהור מעט שונה בין אשר נגרמו מהזנים אליהם, לכן, סתירות כייל שהושג עם אשר נגרמו מהזנים אליהם שונה יכול להיות שנצפו⁴¹.

בסופו של דבר, זה צריך להיות הצביע כי למרות qPCR היא שיטה מאוד מדויק על ה-DNA כימות כמה השתנות הגלום בטכניקה יכול להיות שנצפו. דיוק ב טיטור תלוי בעיקר pipetting מדויקת ואת vortexing נאות של כל הפתרונות. כדי להבטיח כייל המדויקת ביותר את הקריאה, qPCR יכול להיות באופן עצמאי חוזרות ונשנות, חישוב הממוצע הערכים שהושג. הבחירה של תחל הוצג פרוטוקול זה מבוסס על הרצף של האמרגן כקבוצת ממוקם על פלסמיד pTransgene השתמשו במעבדה שלנו. האמרגן כקבוצת הוא יזם סינתטי חזק נעשה שימוש נרחב בתחום וקטור לביטוי נסיעה על פני סוגי תאים מרובים. הוא כולל מספר אלמנטים, כולל cytomegalovirus (CMV) מוקדם משפר רכיב; יזם את אקסון הראשון, את אינטרון הראשון של הגן כקבוצת; את מקבל אחוי של הגן β-גלובין ארנב. עם זאת, ניתן לעצב תחל עבור כמעט כל רכיב ממוקם בתוך בקלטת ביטוי (כולל את המקדם, transgene ורכיבים תקינה). ההשוואה של כייל נוגדנים על פני אצוות הוא אפשרי, גם מתן תחל משמשים נגד באזורים משותפים הווקטורים המדובר.

לסיכום, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לייצר AAV וקטורים עם מגוון רחב של capsids, תצורות הגנום, יזם סוגי transgene וחקלאיים. פעולה זו תאפשר למשתמשים להתאים בקלות את מאפייני הסופי של וקטורים שלהם בצורה הטובה ביותר לצרכים ניסיוני. בדוגמה שהוצגו בתוצאות נציג, השימוש PHP. B capsid, אשר ביעילות חוצה BBB, נתן ביטוי גנים יעילה במיוחד מערכת העצבים, הזרקת וריד הזנב הבאים³². המינהל מערכתית של וקטורים penetrant CNS יתרונות ניכר מבחינת תופעות הלוואי האפשריות-^2,17,32. אלטרנטיבה אפשרית הזרקת היקפיים, תוך הימנעות את האזהרות של טכניקות פולשנית, היא משלוח במחלה, אשר מורכב של משלוח של וקטור AAV לתוך הנוזל מוחי שדרתי. המסלול משלוח הוכח להיות יעיל, מציג ביטוי נרחב של transgene על פני מערכת העצבים, פחות תופעות מחוץ-יעד איברים היקפיים, רמות נמוכות של התגובה החיסונית⁴². עם זאת, זריקות במחלה הם הרבה יותר מאתגר, כפי שהם דורשים כישורים טכניים גבוהים יותר מאשר הזרקה וריד הזנב.

פיתוח נוסף capsid כדי לחדד את הטכנולוגיה הזאת תהיה מונעת על ידי ההזדמנויות לשימוש וקטור AAV ביישומי טיפול גנטי. גישות כאלה מציעים אפשרויות אטרקטיבי לטיפול כיום חשוכת מרפא הפרעות מערכת העצבים המרכזית, כגון נוירודגנרטיביות, מחלת שארקו-מארי-שן, פרקינסון, אלצהיימר¹⁸.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid production
pTransgene plasmid	De novo design or obtained from a plasmid repository	N/A	See step 1 of main protocol for further details
pCapsid	De novo design or obtained from a plasmid repository	N/A	See step 1 of main protocol for further details
pHelper	Agilent	240071
Plasmid Plus maxi kit	Qiagen	12963
QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104
AAV Helper-Free System	Agilent	240071
Cell culture and transfection
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Life technologies	11960-044	Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 µm filter
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10500-064
GlutaMAX supplement	GIBCO	35050038
(200 mM)
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma-Aldrich	CLS430769
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium	GIBCO	14190094
HEK293T cells	American Tissue Culture Collection	CRL3216	Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots
Cell culture dishes	Greiner Cellstar	639160	15 cm diameter culture dishes
Cell scrapers	VWR	10062-904
Polyethylenimine (PEI)	Polyscience	23966-2	PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can be freeze/thawed multiple times.
Virkon solution	Fisher Scientific	NC9821357	Disinfect any material that has been in contact with assembled vector particles with Virkon solution
Mutexi long-sleeve aprons	Fisher Scientific	11735423	Wear an apron over the top of a regular lab coat
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes	Fisher Scientific	15401952
AAV Purification and desalting
Optiprep density gradient medium	Sigma-Aldrich	D1556	Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290	CAUTION. Use under a laminar flow hood
Pasteur pipette	Sigma-Aldrich	Z627992	Sterilize before use
OptiSeal Polypropylene tubes	Beckman	361625
Benzonase (250 U/µL)	Sigma-Aldrich	E1014	Supplied as a ready-to-use solution
Acrodisc syringe filter	Pall corporation	4614
Omnifix syringe (5 mL)	Braun	4617053V
Blunt syringe needle	Sigma Aldrich	Z261378	Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle
Aqua Ecotainer	B. Braun	0082479E	Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water'
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit	Millipore	UFC910024	These filters concentrate the final product by collecting the vector particles in consecutive centrifugation steps
Pluronic F68 (100x)	Thermo Fisher	24040032	Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0.01% (v/v)
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-374	Use skirted tubes for easy handling
AAV Titration
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL)	Promega	R6421
DNAse I (1 U/µL)	Fisher Scientific	EN0521
Proteinase K	Sigma-Aldrich	3115852001	Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/mL. Solution can be stored at -20 °C
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)	Fisher Scientific	AB2000
Eppendorf microtube 3810x	Sigma-Aldrich	Z606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells	Roche	4729692001	White polypropylene plate (with unique identifying barcode)
Microseal 'A' PCR plate and PCR Plate Sealing Film	Bio-Rad	msa5001
AAV Purity control
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678	Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base ULTROL Grade	Merck	648311	CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
UltraPure Agarose	Thermo Fisher	16500-500
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1)	Carl Roth	3029.3	Aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Serva Blue G	Sigma-Aldrich	6104-58-1
Precision Plus prestained marker	Bio-Rad	1610374edu
1-Butanol	Sigma-Aldrich	B7906	CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Immunohistochemistry
Rabbit anti-GFP	Synaptic Systems	132002	1:300 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:1,000 dilution
Equipment	Company	Catalog number	Comments
Vector production lab
Rotina 380 bench-top centrifuge *	Hettich	1701
Optima XPN 80 ultracentrifuge *	Beckmann Coulter	A95765
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *	Beckmann Coulter	337901
Entris digital scale *	Sartorius	2202-1S
Warm water bath *			Set at 37 °C
Ice bucket *	VWR	10146-290	Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas
Pipetboy pro *	Integra	156,400
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	606180	Capacity of 5 mL
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	607180	Capacity of 10 mL
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	760180	Capacity of 25 mL
CO2 incubator CB150 *	Binder	9040-0038	Set at 37 °C, 5% CO2 and 95% humidity
Nuaire safety cabinet NU 437-400E *	Labexchange	31324	Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use
Conventional lab
T100 thermal cycler *	Bio-Rad	1861096
LightCycler 480 Instrument II *	Roche	5015278001
ThermoMixer *	Eppendorf	C 5382000015
Nanodrop *	ThermoFisher Scientific	ND 2000
Mini-Protean Tetra Cell*	Bio-Rad	1658001FC	For use with handmade or precast gels
ProteoSilver silver stain kit	Sigma-Aldrich	PROTSIL1	High sensitivity protein detection with low background
Centrifuge 5804 R *	Eppendorf	B1_022628045	High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 mL)
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	606180	5 mL
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	607180	25 mL
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	760180	25 mL
Filter tips *	Greiner bio-one	750257	1250 µL
Filter tips *	Greiner bio-one	738257	300 µL
Filter tips *	Greiner bio-one	771257	10 µL
Ice bucket with lid *	VWR	10146-290
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *	VWR	181-0065
Pipetman P2	Gilson	F144801
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P100	Gilson	F123615
Pipetman P200	Gilson	F123601
Pipetman P1000	Gilson	F123602
* Materials marked with an asterisk are expensive pieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.