הערכה ואפיון של אוניות היאלואיד בעכברים

Zhongxiao Wang; Chi-Hsiu Liu; Shuo Huang; Jing Chen

doi:10.3791/59222

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

פרוטוקול זה מתאר הן בשיטות הvivo vivo ו-ex כדי להמחיש במלואו ולאפיין את כלי הקיבול, מודל של רגרסיה בכלי הדם בעיני העכבר, באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית ופונדוס fluorescein אנגיוגרפיה עבור הדמיה חיה ולשעבר vivo בידוד ו הר שטוח בעקבות היאלואיד לניתוח כמותי.

Abstract

בעיניים, כלי החיקלואיד העובריים מזינים את העדשות המתפתחות ואת הרשתית ואת הסגת העין כאשר כלי הרשתית להתפתח. רגרסיה מתמשכת או כושלת של כלי היאלואיד ניתן לראות במחלות כגון מתמשך hyperplastic ראשוני אינדקטור (phpv), המוביל נתיב אור חסום ותפקוד חזותי לקוי. הבנת המנגנונים שבבסיס הרגרסיה בכלי ההילואיד עלולה להוביל לתובנות מולקולריות חדשות לתהליך הרגרסיה ולדרכים החדשות הפוטנציאליות לניהול מחלות עם כלי קיבול מתמשך. כאן אנו מתארים את ההליכים להדמיה הדמיה בעכברים חיים עם טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (OCT) ו הפונדוס fluorescein אנגיוגרפיה (FFA) ו פרוטוקול טכני מפורט של בידוד שטוח הvivo ex לשעבר לניתוח כמותי. בצפיפות נמוכה חלבון ליפופרוטאין קולטן הקשורים חלבונים 5 (LRP5) עכברים שימשו כמודל ניסיוני של כלי היאלואיד מתמשך, כדי להמחיש את הטכניקות. יחד, טכניקות אלה עשוי להקל על הערכה יסודית של כלי היאלואיד כמודל ניסיוני של רגרסיה ומחקרים בכלי הדם על המנגנון של כלי היאלואיד מתמשך.

Introduction

אספקת הדם בעין חיונית כדי להבטיח את ההתפתחות הנורמלית של הרשתית ואת רקמות העין סביב ולצייד פונקציה חזותית נכונה. ישנן שלוש מיטות כלי דם בעין: הרשת הרשתית, הדמית, ומחזור הדם העובריים הארעי של כלי ההילואיד. התפתחותה של העינית מחייבת תיאום מרחבי וזמני לאורך כל embryogenesis והתבגרות רקמות. בין שלוש מיטות כלי הדם, ואצלב היוקלואיד הוא מערכת אספקת הדם התפקודית הראשונה כדי לספק תזונה וחמצן לעדשה העוברית החדשה והרשתית המתפתחת. כלים היאלואיד לסגת באותו הזמן כי הרשתית ובקרה לפתח ובוגרת¹. הרגרסיה של היאלואיד ואסיקובלטורה היא מרכזית כדי לאפשר מסלול חזותי ברור לפיתוח של פונקציה חזותית; מכאן, תהליך זה רגרסיה כלי הדם חשוב כמו הצמיחה של ואצלב הרשתית. רגרסיה לקויה עלולה לגרום למחלות עיניים. יתרה מזאת, הרגרסיה של כלי היאלואיד מספקת מערכת מודל לחקירת המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים המעורבים בוויסות רגרסיה בכלי הדם, שעשויה להיות בעלת השלכות גם על הרגולציה האנגיוגנטית באיברים אחרים.

ההילואיד הווקולטורה, שנגזר מעורק היאלואיד (HA), מורכב מוואסה היאלומד (VHP), הטניקה ואסקולוסה (TVL), וממברנה הפפילארי (PM). הוא מספק מזון הרשתית המתפתח, העיקרי והעדשה, ואת העדשות במהלך התפתחות עובריים². הנובעים מ-HA, סניפים של VHP באים באופן מידי באמצעות הווידוס אל העדשה. ה-tvl כוסות את המשטח האחורי של קפסולת העדשה, ואנסטוסס עד ה-PM, המתחבר לעורקים האחוריים של העדשה, המכסים את המשטח הקדמי של עדשת²^,³, וכתוצאה מכך היווצרות רשת של כלי שיט בשעה pm מיכל שלוש ^, ^ד ^, ⁵. מעניין, אין ורידים ב היוקלואיד, והמערכת עושה שימוש בורידים choroidal כדי להשיג ניקוז ורידים.

בעובר האנושי, היוקלואיד ולטבלטורה כמעט מושלם במהלך השבוע התשיעי של ההיריון ומתחיל לסגת כאשר כלי הרשתית הראשונים מופיעים, בחודש הרביעי של ההיריון². החל מניוון של vhp, רגרסיה של רשתות קפילר של tvl, the PM, ולבסוף, HA מתרחשת לאחר מכן²^,³. בינתיים, המופרע הזה בו העיקרית והוויראוס המשני מתחיל להיווצר, המורכב מרכיבי מטריקס מתכלים, כולל סיבי קולגן. עד החודש השישי של ההיריון, הטיפול העיקרי הוא מופחת לתעלת שקוף קטנה המשתרעת מדיסק העצב האופטי אל העדשה, המכונה תעלת Cloquet או תעלת היאלואיד, ואת הוויריאוס המשני הופך את המרכיב העיקרי של הקטע האחורי מיכל השני ^, ³. מחזור ההיאלואיד נעלם בעיקר ב 35 כדי 36 שבועות של ההיריון, ממש לפני הלידה³.

בניגוד לבני האדם, אשר היאלואיד ואסיקולטורה הוא לגמרי בנסיגה בלידה, מערכת כלי הדם של העכבר מתחיל לסגת לאחר הלידה. כמו הרשתית העכבר נולד נמק העצם ואת כלי הרשתית לפתח postnatally, כלי היאלואיד נסיגה במקביל ביום האחרי לידה (P) 4 הם בעיקר לגמרי בנסיגה על ידי P21⁶ (איור 1). PM נעלמת הראשון בין P10 ו P12, ו-VHP נעלמת בין P12 ו P16, בעוד מספר קטן של תאים TVL ו HA להישאר אפילו ב P16, ועל ידי P21 הרגרסיה היאלואלואיד מערכת כלי הדם הוא כמעט השלמת⁶. בינתיים, הוזוקולטורה הרשתית מתחיל להתפתח לאחר הלידה. השכבה השטחית של מקלעת כלי הדם מרחיבה לחלוטין את הרשתית ההיקפית ב-P7 – P8, השכבה העמוקה (הממוקמת בשכבה הplexiform החיצונית) מתפתחת מP7 – P12, ולבסוף, מקלעת הביניים בשכבת הplexiform הפנימית מתפתחת בין P12 ל-P15⁷. כפי שמתפתח הרשתית, היא מחליפה בהדרגה את הפונקציה של כלי הקיבול ה, המספק תזונה וחמצן לעין המתפתחת. מופע הפוסט-לידה של רגרסיה ספינת היאלואיד בעכברים מספק מודל ניסיוני נגיש בקלות כדי להתבונן וללמוד את הוזוקובלטורה, כמו גם את הבסיס המולקולרי המסדירים תהליכים רגרסיה בכלי דם תחת שניהם פיסיולוגיים וגם תנאים פתולוגיים⁸.

כישלון רגרסיה hyaloid ניתן לראות מחלות כגון phpv, שהיא סטייה נדירה התפתחותית מולדים של העין וכתוצאה מרגרסיה כושלת או שאינה מלאה של embryological, הראשי אינדקטור ו היאלוקוד⁹. המנגנונים המסדירים את תהליך הרגרסיה של היאלואיד מסובכים ולמדו בהרחבה. אחד השביל המולקולרי העיקרי חיוני הרגרסיה הרגילה של כלי היאלואיד הוא מסלול ה-wnt איתות¹⁰, כמו מוטציות גנטיות במסלול זה להשפיע על wnt ליגנד קולטנים היו מקושרים עם phpv בבני אדם⁹. מחקרים ניסיוניים זיהו Wnt ligand, Wnt7b, אשר מופק על ידי מקרופאגים סביב כלי היאלואיד בעין המתפתחת כדי לתווך את תהליך הרגרסיה. Wnt7b מפעיל איתות Wnt על-ידי איגוד עם הקולטנים frizzled4 (FZD4)/LRP5 בתאי אנדותל סמוכים כדי ליזום אפופטוזיס תאים, המוביל לרגרסיה של כלי היאלוקוד¹⁰. כתוצאה מכך, עכברים לקויה Wnt7bלהראות התמדה של כלי היאלואיד¹⁰. באופן דומה, Wnt ליגנט לא קונבנציונאלי, Norrin (מקודד על ידי הגנים Ndp ), גם נקשר FZD4/LRP5 כדי לגרום הרגרסיה היפאלואיד ספינה במהלך הפיתוח. Ndp^y/-, Lrp5^-/-, ו -^Fzd4-/- עכברים כולם להציג את הרגרסיה היאלואלואיד בספינה, תמיכה בתפקיד רגולטורי קריטי של wnt איתות¹¹^,¹²^, ¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. יתר על כן, Wnt coreceptor LRP6 חופפים עם LRP5 בתפקוד שלהם על מודלדירוג מסלול האיתות Wnt בתוך כלי הדם שלהיאלוקוד וסקולתל. גורמים אחרים שעשויים גם לתרום לרגרסיה היאלואיד כוללים את היפוקסיה-inducible factor¹⁸^,¹⁹, גורם הגדילה של כלי הדם²⁰^,²¹, קולגן-18²²^, ²³, arf²⁴, אנגיופיאה-2²⁵, ו העצם מורמורגנטית חלבון-4²⁶. במאמר זה, אנו משתמשים Lrp5^-/- עכברים כמודל של כלי היאלואיד מתמשך כדי להדגים את הטכניקות של הערכה והאפיון והשיטה באמצעות שיטות vivo ולשעבר vivo.

ההדמיה של היאלוקוד ואסילטורה ב vivo ו ex vivo הוא חיוני ללמוד את המנגנונים של רגרסיה ספינת היאלואיד. שיטות נוכחיות להתבונן היאלוקוד ואסיקובלטורה בעיקר להתמקד על המחשה וניתוח של VHP ו HA, באמצעות התמונות OCT ו FFA, הצלב העין סעיפים, ו-hyaloid שטוח הר. OCT ו-FFA הם בעלי עוצמה בכלי הדמיה vivo, המאפשרים התבוננות מרבית בבעלי חיים חיים לאחר שפתחו את עיניהם. יתר על כן, מבודד hyaloid שטוח הר מספק ויזואליזציה של הואלואיד כולו ואמצעי להשגת כימות מדויקת של מספרי כלי. ובכל זאת, האופי העדין והשברירי של כלי הדם והקשיים הטכניים הנובעים מהבידוד שלו עשויים להגביל את השימוש במחקרי עיניים במידת מה¹⁰^,¹⁷^,²⁷. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של ויזואליזציה של כלי היאלואיד, שילוב הן ב vivo live הדמיה רשתית ו לשעבר vivo בודד hyaloid שטוח הר כדי לשפר את הכדאיות של טכניקות אלה. פרוטוקול זה הותאם עם שינוי והתרחבות מפרסומים קודמים על השיטה vivo של הפונדוס חי הדמיה OCT²⁸ ואת השיטה ex vivo של מבודד hyaloid שטוח הר¹¹.

Protocol

כל בעלי החיים טופלו על פי האגודה למחקר בחזון ועיניים (ARVO) לשימוש בעלי חיים במחקר אופטלמולוגי וחזון לניסויים בבעלי חיים, בעקבות ההנחיות של המכון הלאומי לבריאות ( NIH) בנוגע לטיפול ולשימוש בבעלי חיים להליכים ניסיוניים ולתקנות שנקבעו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש (IACUC) בבית החולים לילדים בבוסטון. Lrp5^-/- עכברים (מלאי 005823; ג'קסון מעבדה) ומסוג פראי שלה (WT) שליטה C57BL/6J (מדמין no. 000664; ג'קסון מעבדה) שימשו למחקר זה.

1. חלק I: הדמיה vivo של כלי היאלואיד באמצעות מערכת מכרסם הדמיה רשתית

הכנת הרדמה עכברים והתארכות האישון
1. בחר את העכברים.
  1. השתמש בעכברים שגילם עולה על P12 (לאחר שפתחו את עיניהם) לדימות ברשתית; שני המינים מתאימים.
  2. בהתאם לצורך, עכברים מוטנטים תמונה עם רגרסיה hyaloid מתעכב (ואת שולטת WT שלהם) במהלך הבגרות. עכברים WT שגילם עולה על 3 שבועות לא יכול להיות מוצג הרבה לגילוי כלי היאלואלואיד הנותרים, ומכאן P12 – P21 הוא אידיאלי עבור הדמיה שנותרו WT העין.
2. הכינו תערובת של קטמין/קסיטין להרדמה.
  1. לקחת 2.3 mL של פתרון מלאי קטמין (100 mg/mL) ו 0.7 mL של פתרון מניות xylazine (20 מ"ג/mL) ולהוסיף 20 מ ל של תמיסת מלח סטרילי (0.9% נתרן כלוריד) כדי להפוך פתרון עבודה של תערובת קטמין/xylazine (10 מ"ג/מ"ל קטמין ו 0.6 mg/mL xylazine).
3. לסמם את העכברים על ידי intraperitoneally הזרקת קטמין/xylazine תערובת בנפח של 8x משקל הגוף של העכבר (למשל, 20 גרם עכבר צריך 160 μL של הקטמין/xylazine פתרון העבודה כדי להשיג מינון עבודה של קטמין [80 מ"ג/ק"ג משקל גוף] ו xylazine [4.8 mg/ק"ג משקל גוף] תערובת).
4. החל טיפה אחת של פתרון התרופה לתלמיד-מרחיב (ראה טבלת חומרים) לכל עין כדי להתרחב על ידי העכבר מיד לאחר ההרדמה.
5. העריכו את רמת ההרדמה על ידי הדוושה רפלקס (צביטה הבוהן המשרד הגוף). המתן עד שהעכבר מורדם מספיק (אין רפלקס פדלים) והאישונים שלו מורחבים באופן נרחב.
טומוגרפיה אופטית קוהרנטית הדמיה של כלי היאלואיד
1. לחות הקרניות של העכבר עם דמעות מלאכותיות, ולאחר מכן, למקם את העכבר על הבמה מיצוב.
2. בעדינות ליצור קשר עם הקרנית של העכבר עם העדשה של הבדיקה OCT. להתאים את העכבר ולבדוק כך הראש עצב הראייה הוא במרכז השדה החזותי בתמונה פונדוס, כדי להנחות את הדמיה OCT.
  הערה: לפרטים נוספים על הכיוונון הכללי של מערכת הדמיה רשתית מכרסמים (ראה טבלת חומרים) וכוונון מיקום העכבר, עיין בגונג ואח '²⁸.
3. כוונן את המוקד כדי להשיג את התמונות האופטימליות של OCT.
4. כוונן את זווית השורה המצוינת בתוכנת הדימות של OCT (ראה טבלת חומרים) כדי לחשוף כלי היפרקוד מתמידים ולאחר מכן צלם תמונות.
ו' לונדוס ו' לוקאסעין מהווה ngiography הדמיה של מיכלי היאלואיד
1. הכינו פתרון fluorescein: להוסיף 9 מ ל של מלוחים סטרילי מואגר פוספט (PBS) ל 1 מ ל של הפתרון fluorescein (ריכוז מניות: 100 mg/mL). ריכוז פתרון העבודה הסופי הוא 10 מ"ג/mL.
2. Intraperitoneally להזריק את הפתרון העבודה fluorescein (5 μL/g משקל הגוף).
3. לחות הקרנית של העכבר עם דמעות מלאכותי, ולאחר מכן, למקם את העכבר על הבמה מיצוב.
4. מקמו את העדשה של המיקרוסקופ לדימות ברשתית מיקרון IV כדי ליצור מגע עדין עם הקרנית העכבר. כוונן את היישור במקצת כדי למקם את ראש העצב האופטי במרכז שדה התצוגה.
5. שינוי מסנן המיקרוסקופ לערוץ פלורסנט ירוק.
6. להתמקד בכלים היאלולואיד מתמשך לצלם תמונות.
7. לקחת תמונות מרובות לאחר 1 דקות, 3 דקות, 5 דקות, ו 10 דקות (לא יותר מ 10 דקות) לאחר ההזרקה כדי לקבוע את נקודת הזמן הטובה ביותר (יחס אות לרקע) להתבוננות בכלי ההילואיד. להשלים את ההליך FFA בתוך 10 דקות, לאחר מכן fluorescein יכול להיות מתפזרת מדי ולהפוך את כלי השיט בלתי נראה.
התאוששות של עכברים מפני הרדמה
1. לאחר ההליכים, לשמור את העכברים על כרית חימום חם.
2. המתן עד שהעכברים יחזרו להיות ניידים כדי להחזיר אותם לכלוב העכבר.

2. חלק ב': ויזואליזציה vivo לשעבר של כלי היאלואיד

הכנת עיני עכבר קבועות
1. לבחור עכברים של הגיל הנכון.
  הערה: עכברים בדרך כלל מוקרבים ב-P8 לניתוח היאלואיד. שני המינים מתאימים. עכברי מוטציה עם רגרסיה היאלואלואיד מושהית (ואת שולט WT שלהם בהתאמה) ניתן לגזור ולנתח במהלך הבגרות.
2. המתת חסד העכברים על ידי חשיפה ל-CO₂.
3. העיניים של העכבר. על ידי ניתוח קהה
4. פתח את העפעפיים רחב עם מלקחיים מיקרופלסטיים כדי לאפשר גישה לגלגל העין. הניחו מלקחיים עקומים מיקרו מתחת לגלובוס במסלול כדי לתפוס את העצב האופטי מבלי לסחוט את העין. משוך בעדינות והסר את גלגל העין עם הלקחיים.
5. לחילופין, לנתח את העין באמצעות מספריים מיקרו ניתוח לחתוך בזהירות במקביל לגלובוס מארבעת הצדדים לכיוון האחורי של המסלול והפרדת הגלובוס מרקמות החיבור המקיפים.
6. לטבול את העיניים 4% פאראמפורמלדהיד במאגר PBS עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר עבור קיבעון.
7. העבירו את העיניים הקבועות. למאגר הקרח הקר-PBS
  הערה: ניתן לאחסן את העיניים ב-PBS ב-4 ° צ' עד שבוע אחד.
הטבעת כלי היאלואיד עם הזרקת ג'לטין
1. הכינו 5% (w/v) פתרון ג'לטין.
  1. שוקלים 50 מ ג של ג'לטין.
  2. מפזר את הג'לטין ב 1 מ ל של מים מזוקקים.
  3. מודטה את הפתרון ג'לטין באמבט מים 37 ° c עד התפרקה לחלוטין. שמרו על הפתרון ב37 מעלות צלזיוס עד השימוש.
    הערה: הפתרון הגדול ביותר עשוי להיות מוכן ומאוחסן ב-4 ° צ' בתור מעלה. בכל פעם לפני השימוש, הפתרון צריך להיות מחומם ב 37 מעלות צלזיוס אמבט מים כדי להשיג עקביות ברורה.
2. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להזריק 50 μl של פתרון ג'לטין לתוך הגוף אינדקטור ב לימבוס; חזור על הזרקת 3x באתרים שונים כדי להפוך את הסכום של ארבע זריקות, במרווחים שווה סביב לימבוס (איור 2א).
3. דגירה העיניים במקרר 4 ° c או על הקרח במשך 30 דקות כדי לחזק את הג המוזרקים במרחב אינדקטור.
חיתוך ובידוד של כלי היאלואיד
הערה: ראה איור 2ב-E.
1. הניחו את העיניים בצלחת פטרי המכילה את ה-PBS כדי לשמור על הרקמה מייבוש. לעשות חתך עם מספריים מיקרו ניתוח בבית לימבוס ולהסיר את הקרנית.
2. . לגזור ולהסיר את עצב הראייה
3. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להשתמש בשני זוגות של מלקחיים כדי לקלף ולהשליך את sclera, choroid, ו אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) שכבות ולהסיר את הקשתית.
4. עם הצד האופטי העצבי של הרשתית פונה כלפי מעלה את העדשה בצד למטה, להזריק 50 μl של PBS רק מתחת לגביע הרשתית כדי לאפשר הצטברות של מאגר PBS בין הגוף gelatinized אינדקטור הרשתית.
5. בעדינות לקלף ולהסיר את הגביע הרשתית ואת הגוף סיליקלי מן הגוף אינדקטור עם מלקחיים מיקרו.
6. באמצעות פיפטה העברה, להעביר את גביע הג המכיל את רקמת hyaloid שקוע ב-PBS לשקופית מיקרוסקופ
7. להפוך את שאר הרקמה (עדשה/hyaloid) מעל, כך בצד העדשה פונה כלפי מעלה.
8. הרם את העדשה בעדינות לשחרר את החיבור בין העדשה/TVL ו-VHP, ולאחר מכן, לחתוך את HA עם מספריים מיקרוניתוח כדי להסיר את עדשת-TVL. לשמור את ה-VHP-חלק של גביע hyaloid עבור הר שטוח.
הרכבה שטוחה וכתמים של ספינות היאלואיד
1. לשטוף בעדינות את הגביע hyaloid עם PBS בשקופית כדי להסיר את כל הפסולת לנתיחה.
2. ודא שגביע היאלוקוד צף על השקופית בתמיסה מתאימה של PBS.
3. בעדינות לסדר ולהתאים את המיקום של גביע gelatinized hyaloid עם מלקחיים מיקרוכירורגית, עם שפת הספל הפונה למטה על השקופית, כדי להשיג מראה אופטימלי לאחר התכה.
4. מניחים את השקופית עם גביע hyaloid שקוע ב-PBS על מחמם שקופית ב 37 ° c, לחכות עד הג נמס ואת ההיקלואיד שטוחות, ולהסיר את השקופית כאשר הוא בקושי יבש (לא יותר מדי יבש).
5. אופציונלי חיסוני את כלי ההילואיד
  1. הפוך חסימה וחדירה מאגר (למשל, 5% בסרום פרה אלבומין [BSA] ו 0.1% טריטון X-100 ב PBS מאגר). הוסף 50 μL של חסימת מאגר על בידוד hyaloid שטוח רכוב ומארג אותו בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
  2. החל 50 μL של הנוגדן העיקרי (למשל, CD31) (1:100 דילול במאגר חסימת) על הר שטוח של בידוד hyaloid, ולאחר מכן, מארג אותו בתיבה רטובה ב 4 ° c לילה.
  3. לשטוף בעדינות 3x, עבור 5 דקות בכל פעם, עם PBS.
  4. החל 50 μL של נוגדן משני (למשל, עז אנטי ארנבת משנית נוגדן-אלקסה 488, 1:100 דילול) על הר hyaloid שטוח ו דגירה אותו בטמפרטורת החדר עבור 1 h.
  5. לשטוף בעדינות 3x, עבור 5 דקות בכל פעם, עם PBS.
6. הוסף טיפה של מדיום הרכבה נגד התפוגגות עם DAPI (4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול) כדי להכתים את הגרעינים בכלי היאלואלואיד.
7. בעדינות למקם שמיכות על ההיקלואיד כדי להשלים את הטעינה השטוח.
דימות וכימות של כלי היאלואיד שטוחים
1. תמונה הצביעת DAPI של כלי היאלואיד עם מיקרוסקופ פלורסנט ולוודא את המרכז HA גלוי (להוציא את הדגימות ללא HA).
2. זהה ענפי כלי קיבול הנגזרים ישירות מ-HA ומספור באופן ידני את מספר ענפי הקיבול לכימות.
ויזואליזציה של מיכלי היאלואיד בחתך העיניים
1. להטביע את העיניים קבוע לתוך מתחם טמפרטורת חיתוך אופטימלית בתבנית רקמה מתאימה, ולאחר מכן, להקפיא את העיניים מוטבע על קרח יבש או לאחסן אותם במקפיא של 20 ° c.
2. השתמש במיקרו-מיקרוסטטיסטיקה כדי ליצור חתך רוחב של העיניים המוטבעות במקטעים של 12 יקרומטר עובי ב-20 ° c.
3. לאסוף את מקטעי הצלב העין על הטמפרטורה בחדר שקופית מיקרוסקופ ידי נגיעה בעדינות סעיפים רקמות, אשר לדבוק השקופית.
4. האוויר יבש כדי לייבש את מקטעי הרקמה עבור ~ 30 דקות, אשר ניתן לאחסן לאחר מכן ב-20 ° c מקפיא עד מוכן לצביעת.
5. שטוף את השקופית 1x עם PBS כדי להסיר את מתחם טמפרטורת החיתוך האופטימלי שנותר בשקופית.
6. אופציונלי לטבול את השקופית לתוך מאגר קבע מתאים (למשל, 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS) עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר עבור קיבוע נוסף, במידת הצורך.
7. החדירות הרקמה עם 0.1% טריטון X-100 ב PBS עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
8. הכן isolectin-IB4 הצביעת מאגר עבור כתמים כלי דם.
9. התמוססות ומהווים מחדש את isolectin-IB4 (500 μg) אבקה עם 50 mL של PBS בשפופרת צנטריפוגה של 50 mL.
10. לאט להוסיף 50 μL של 1 M CaCl₂ פתרון, ירידה בירידה, לתוך 50 mL של התערובת PBS/isolectin-IB4. יש לבצע שלב זה באיטיות כדי למנוע משקעים. הריכוז הסופי של CaCl₂ הוא 1 μm. הנוכחות של Ca^{2 +} נדרש עבור כתמים isolectin-IB4.
11. החל 30 μL של isolectin-IB4 כתמים מאגר על מקטעים צלב העין על השקופית ומודלת אותו בתיבה רטובה ב 4 ° c לילה.
12. לשטוף 3x, עבור 5 דקות בכל פעם, עם PBS.
13. הוסף טיפה של מדיום הרכבה נגד עמעום עם DAPI כדי להכתים את הגרעינים במקטעים.
14. בעדינות למקם שמיכות על מקטעי הרקמה כדי להשלים את הטעינה השטוח.
15. בדוק את הרקמה תחת מיקרוסקופ כדי לדמיין את הנוכחות של כלי היאלואיד בתוך העין.

תוצאות

ב vivo הדמיה של כלי קיבול של היאלואיד בעכברים חיים
איור 3 חושף הצלב התצוגות של תמונות OCT עבור רקמות הרשתית והיאלואיד ב שלושה חודשים בן WT ו Lrp5^-/-עכברים, דגם בעל חיים עם hyaloid מתמשך. העין WT מראה את העדר רקמת היאלואיד, בעוד Lrp5^-/-עין מראה שני כל...

Discussion

טכניקות כדי להעריך ולאפיין את כלי הקיבול הם הליכים אינטואיטיבי והכרחי כדי לבחון את הרגרסיה ספינת היאלואיד בדגמי בעלי חיים, כדי לאפשר מחקרים על המנגנונים המשמשים את רגרסיה כלי הדם במהלך הפיתוח. בעוד הדמיה ברשתית vivo מאפשר תצפית האורך של רגרסיה hyaloid באותה חיה, גישה מערכת הדמיה פונדוס מכרסם ע?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקים (R01 EY024963 ו EY028100) כדי J.C. Z.W. נתמך על ידי אבירים הטמפלרים עין הקריירה הראשונית גרנט. הליך הבידוד של היאלואיד המתואר במחקר זה הותאם עם שינוי מתוך פרוטוקולים בנדיבות משותפת של ד ר. ריצ'רד לאנג, Toshihide קוריהארה, ולואיס סמית ', למי המחברים אסירי תודה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AK-Fluor (fluorescein injection, USP)	Akorn	17478-253-10
Anti-CD31 antibody	Abcam	ab28364
Antifade mounting medium	Thermo Fisher	S2828
Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Artificial tear eyedrop	Systane	N/A
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	Stock NO: 000664
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016
Cryostat	Leica	CM3050S
Cryostat	Leica	CM3050 S
Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop	Cyclomydril	N/A
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9382
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11008
Heating board	Lab-Line Instruments Inc.	N/A
Isolectin GS-IB4, 594 conjugate	ThermoFisher Scientific	I21413
Ketamine hydrochloride injection	KetaVed	NDC 50989-996-06
Lrp5-/- mice	The Jackson Laboratory	Stock NO. 005823	Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA
Micron IV and OCT	Phoenix Research Labs	N/A	Imaging software: InSight
Microscope	Zeiss	discovery v8
Microsurgery forceps	Scanlan International	4004-05
Microsurgery scissors	Scanlan International	6006-44
Optimal cutting temperature compound	Tissue-Tek	4583
Optimal cutting temperature compound	Agar Scientific	AGR1180
Paraformaldehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15710
Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds)	Fisher Scientific	12-20
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X)	Teknova	P0496
Slide cover glass	Premiere	94-2222-10
Superfrost microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Xylazine sterile solution	Akorn: AnaSed	NDC: 59399-110-20

References

Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. , (2011).
Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).
Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147 LRP5 Wnt

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: