JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает как in vivo, так и ex vivo методы полной визуализации и характеристики гиалоидных сосудов, модель сосудистой регрессии в глазах мышей, используя оптическую комппореную томографию и флоуресцейну для живой визуализации и ex vivo изоляции и последующего плоского крепления гиалоида для количественного анализа.

Аннотация

В глазу эмбриональные гиалоидные сосуды питают развивающуюся линзу и сетчатку и регресс, когда сосуды сетчатки развиваются. Стойкие или неудачные регрессии гиалоидных сосудов можно увидеть при таких заболеваниях, как стойкий гиперпластический первичный стекловид (PHPV), что приводит к затруднению светового пути и нарушению функции зрения. Понимание механизмов, лежащих в основе регрессии гиалоидных сосудов, может привести к новым молекулярным знаниям в процессе регрессии сосудов и потенциальным новым способам управления заболеваниями с помощью стойких гиалоидных сосудов. Здесь мы описываем процедуры визуализации гиалоида у живых мышей с оптической когеренционной томографией (OCT) и фундусийской ангиографией (FFA) и подробный технический протокол изоляции и плоскомонтажа гиалоид ex vivo для количественного анализа. Низкой плотности липопротеинов рецепторов, связанных с протеином 5 (LRP5) нокаут мышей были использованы в качестве экспериментальной модели стойких гиалоидных сосудов, чтобы проиллюстрировать методы. Вместе эти методы могут способствовать тщательной оценке гиалоидных сосудов в качестве экспериментальной модели сосудистой регрессии и исследований механизма стойких гиалоидных сосудов.

Введение

Кровоснабжение глаз имеет важное значение для обеспечения нормального развития сетчатки и окружающих глазных тканей и оснащения надлежащей зрительной функции. В глазу три сосудистые кровати: сосуды сетчатого глаза, сосуды и переходные эмбриональные кровообращения. Развитие глазной сосуды требует пространственной и временной координации на протяжении всего эмбриогенеза и созревания тканей. Среди трех сосудистых кроватей, гиалоидная сосудоза является первой функциональной системой кровоснабжения для обеспечения питания и кислорода для вновь сформированной эмбриональной линзы и развивающейся сетчатки. Гиалоидные сосуды регрессируют в то жевремя, что сосуды сетчатки развиваются и созревают 1. Регрессия гиалоидной сосуды имеет решающее значение для обеспечения четкого визуального пути для развития зрительной функции; следовательно, этот процесс сосудистой регрессии так же важен, как и рост сосудов в области сосуды. Нарушение гиалоидной регрессии может привести к заболеваниям глаз. Кроме того, регрессия гиалоидных сосудов обеспечивает модельсистемы для исследования клеточных и молекулярных механизмов, участвующих в регрессии сосудов, что может иметь последствия для ангиогенной регуляции и в других органах.

Гиалоидная сосуда, полученная из гиалоидной артерии (HA), состоит из ваза гиалоидеи проприии (VHP), туника васкулоза лентиса (TVL) и мембраны зрачков (PM). Он обеспечивает питание развивающейся сетчатки, первичного стекловидного тела, и хрусталика во время эмбрионального развития2. В результате HA, VHP ветви передняя через стекловидное тело к объективу. TVL чашки задней поверхности капсулы объектива, и анастомоза хм, который соединяется с передней цилиарных артерий, охватывающих переднюю поверхность объектива2,3, в результате формирования сети судов в PM 3 , 4 , 5. Интересно, что в сваске гиалоида нет вен, и система использует сосуды для выполнения венозного дренажа.

В человеческом эмбрионе, гиалоид сосуды почти завершена примерно на девятой неделе беременности и начинает регрессировать, когда первые сосуды женевки появляются, в течение четвертого месяца беременности2. Начиная с атрофии VHP, регрессии капиллярных сетей TVL, PM, и, наконец, HA происходит впоследствии2,3. Между тем, первичные стекловидного втягивания и вторичного стекловидного начинает формироваться, состоящий из внеклеточных компонентов матрицы, в том числе коллагеновых волокон. К шестому месяцу беременности первичный стекловид превращаета сводится к небольшому прозрачному каналу, простираясь от диска зрительного нерва до объектива, называемого каналом Cloquet или гиалоидным каналом, а вторичный стекловидный становится основным компонентом заднего сегмента 2 , 3. Циркуляция гиалоида исчезает в основном на 35 до 36 недель беременности, незадолго до рождения3.

В отличие от людей, у которых гиалоидная сосудистая полностью регрессирует при рождении, мышь гиалоидная сосудистая система начинает регрессировать после рождения. Как мышь сетчатки рождается сосудистой и сетчатки сосудов развиваться послеродовой, гиалоидные сосуды регресс одновременно с послеродового дня (P) 4 и в основном полностью регрессируется P216 (Рисунок 1). PM исчезает сначала между P10 и P12, и VHP исчезает между P12 и P16, в то время как небольшое количество ТВЗ и HA клеток остаются даже на P16, и P21 регрессии гиалоидной сосудистой системы почти завершена6. В то же время, сосуды для стыковки с ы ветвей на гриле начинают развиваться после рождения. Поверхностный слой сосудистого сплетения полностью распространяется на периферийную сетчатку при P7-P8, глубокий слой (расположенный во внешнем плексиформном слое) развивается из P7-P12, и, наконец, промежуточное сплетение во внутреннем плексиформном слое развивается между P12 и P157 . По мере развития сосудов сосудов сосудов сосудов соты, она постепенно заменяет функцию сопутствующего регрессирования гиалоидных сосудов, обеспечивая питание и кислород развивающемуся глазу. Послеродовое возникновение регрессии гиалоидных сосудов у мышей обеспечивает легко доступную экспериментальную модель для наблюдения и изучения гиалоидной сосуды, а также молекулярную основу, регулирующую процессы сосудистой регрессии в рамках как физиологических, так и физиологических и патологические состояния8.

Отказ гиалоидной регрессии можно увидеть при таких заболеваниях, как PHPV, который является редкой врожденной аномалией развития глаза в результате неудачной илинеполной регрессии эмбриональной, первичной стекловидной и гиалоидной сосуды 9. Механизмы, регулирующие регрессионный процесс гиалоидных сосуд, являются сложными и широко изучены. Один из основных молекулярный путь, необходимый для нормальной регрессии гиалоидных сосудов является Wnt сигнализации пути10, как генетические мутации в этом пути, затрагивающих как Wnt лиганда и рецепторы были связаны с PHPV у людей9. Экспериментальные исследования определили Wnt лиганд, Wnt7b, который производится макрофагами вокруг гиалоидных сосудов в развивающемся глазу, чтобы опосреднить этот процесс регрессии. Wnt7b активирует Wnt сигнализации путем связывания с рецепторами frizzled4 (F'D4)/LRP5 в соседних эндотелиальных клеток, чтобы инициировать апоптоз клетки, что приводит к регрессии гиалоидных сосудов10. В результате, Wnt7b-дефицитных мышей показать стойкость гиалоидных сосудов10. Аналогичным образом, нетрадиционный лиганд Wnt, Норрин (кодируется геном Ndp), также связывается с F'D4/LRP5, чтобы вызвать регрессию гиалоидных сосудов во время разработки. Ndpy/- , Lrp5-/-, и Fzd4-/- мышей все отображения отложено гиалоидной регрессии судна, поддерживая важную регулятивную роль Wnt сигнализации11,12, 13,14,15,16. Кроме того, другой Wnt coreceptor LRP6 перекрывает сярприг с LRP5 в своей функции по модуляции сигнального пути Wnt в гиалоидных сосудистых эндотелиальных клетках17. Другие факторы, которые также могут способствовать гиалоидной регрессии включают гипоксия-индуцируемый фактор18,19, сосудистый эндотелиальный фактор роста20,21, коллаген-1822, 23, Arf24, ангиопоэтин-225, и костной морфогенетический белок-426. В этой работе мы используем Lrp5-/- мышей в качестве модели стойких гиалоидных сосудов, чтобы продемонстрировать методы оценки и характеристики гиалоидных сосудов с помощью методов in vivo и ex vivo.

Визуализация гиалоидных сосудов in vivo и ex vivo необходима для изучения механизмов регрессии гиалоидных сосудов. Современные методы наблюдения гиалоидных сосудок в основном сосредоточены на визуализации и анализе VHP и HA, с помощью изображений OCT и FFA, секций поперечных сечений глаз и плоского крепления гиалоидов. OCT и FFA являются мощными инструментами визуализации in vivo, позволяющими проводить продольные наблюдения у живых животных после того, как они открыли глаза. Кроме того, изолированное гиалоидное плоское крепление обеспечивает визуализацию всей гиалоидной сосуды и средство для достижения точной количественной оценки числа сосудов. Тем не менее, тонкий и хрупкий характер гиалоидных сосудов и в результате технические трудности его изоляции, возможно, ограничили его использование в исследованиях глаз несколько10,17,27. В этой работе мы предоставляем подробный протокол визуализации гиалоидных сосудов, сочетая как in vivo живую визуализацию жевийной корыстной полости, так и ex vivo изолированные гиалоидные плоские крепления для повышения осуществимости этих методов. Этот протокол был адаптирован с модификацией и расширением от предыдущих публикаций на in vivo метод живой fundus и OCT изображений28 и ex vivo метод изолированных гиалоид плоский монтаж11.

протокол

Все животные были обработаны в соответствии с Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) Заявление об использовании животных в офтальмологических и видение исследований для экспериментов на животных, в соответствии с Руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения ( NIH) в отношении ухода и использования животных для экспериментальных процедур и правил, установленных Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в Бостонской детской больнице. Lrp5-/- мыши (запас No 005823; Лаборатория Джексона) и ее дикий тип (WT) управления C57BL/6J мышей (фонд No 000664; Лаборатория Джексона) были использованы для этого исследования.

1. Часть I: In vivo изображение гиалоидных сосудов с помощью системы визуализации ретины

  1. Препарат анестезии мышей и расширение зрачка
    1. Выберите мышей.
      1. Используйте мышей, которые старше P12 (после того, как они открыли глаза) для визуализации глаза глаза; оба пола подходят.
      2. По желанию, изображение мышей-мутантов с задержкой гиалоидной регрессии (и их контроля WT) на протяжении всей взрослой жизни. WT мышей старше 3 недель не может проявлять много обнаруживаемых оставшихся гиалоидных сосудов, следовательно, P12-P21 идеально подходит для визуализации оставшихся видимых WT гиалоид.
    2. Приготовьте смесь кетамина/ксилазина для анестезии.
      1. Возьмите 2,3 мл раствора кетаминового бульона (100 мг/мл) и 0,7 мл ксилазинового бульонного раствора (20 мг/мл) и добавьте 20 мл стерильной са линии (0,9% хлорида натрия) для изготовления рабочего раствора смеси кетамин/ксилазин (10 мг/мл кетамина и 0,6 мг/мл ксилазина).
    3. Анестезия мышей путем интраперитоно инъекционных кетамина / ксилазина смеси в объеме 8x веса тела мыши (например, 20 г мыши необходимо 160 л кетамина / ксилазина рабочего раствора смеси для достижения рабочей дозы кетамина (80 мг/кг тела) вес и ксилазин (смесь 4,8 мг/кг массы тела).
    4. Нанесите одну каплю раствора препарата для зрачков (см. Таблицуматериалов) к каждому глазу, чтобы раздвить зрачки мыши сразу же после анестезии.
    5. Оцените уровень анестезии с помощью педали рефлекса (твердый задний нос. Подождите, пока мышь достаточно анестезируется (без педалей рефлекс) и ее зрачки широко расширены.
  2. Оптическая когеренционная томография гиалоидных сосудов
    1. Увлажняй роговицы мыши искусственными слезами, а затем поместите мышь на сцену позиционирования.
    2. Аккуратно свяжитесь с роговицей мыши с помощью объектива зонда OCT. Отрегулируйте мышь и зонд так, чтобы головка зрительного нерва находилась в центре поля зрения в изображении fundus, чтобы направлять oct изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более подробной информации об общей установке системы визуализации сетчаточной сетки грызунов (см. Таблицаматериалов) и корректировки положения мыши, пожалуйста, обратитесь к Гонг и др.28.
    3. Отрегулируйте фокус для достижения оптимальных изображений OCT.
    4. Отрегулируйте угол указанной линии в программном обеспечении OCT imaging (см. ТаблицаМатериалов), чтобы выявить стойкие гиалоидные сосуды, а затем сделать снимки.
  3. F undus f luorescein a нгиография изображение гиалоидных сосудов
    1. Приготовьте раствор флуоресцеина: добавьте 9 мл стерильного фосфатно-буферного солей (PBS) к 1 мл раствора флуоресцеина (концентрация запасов: 100 мг/мл). Концентрация конечного рабочего раствора составляет 10 мг/мл.
    2. Интраперитонеально вводят флуоресцеин рабочий раствор (5 л/г массы тела).
    3. Увлажняй роговицу мыши искусственными слезами, а затем поместите мышь на сцену позиционирования.
    4. Расположите объектив микроскопа визуализации сычаткой для ретье реляной Micron IV, чтобы сделать прямой нежный контакт с роговицой мыши. Отрегулируйте выравнивание немного, чтобы положение головы зрительного нерва в центре поля зрения.
    5. Измените фильтр микроскопа на зеленый флуоресцентный канал.
    6. Сосредоточьтесь на стойких гиалоидных сосудах, чтобы делать снимки.
    7. Возьмите несколько изображений после 1 мин, 3 мин, 5 мин, и 10 мин (не более 10 мин) после инъекции, чтобы определить лучшую точку времени (сигнал к фону соотношение) для наблюдения гиалоидных сосудов. Завершите процедуру FFA в течение 10 минут, после чего флуоресцеин может стать слишком рассеянным и сделать сосуды невидимыми.
  4. Восстановление мышей от наркоза
    1. После процедур держите мышей на теплой грелке.
    2. Подождите, пока мыши мобильны снова, чтобы вернуть их в клетку мыши.

2. Часть II: Ex vivo визуализация гиалоидных сосудов

  1. Подготовка неподвижных мыжельных глаз
    1. Выберите мышей нужного возраста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неонатальные мыши, как правило, жертвуют в P8 для вскрытия гиалоидов. Оба пола подходят. Мутантмы с задержкой гиалоидной регрессии (и их соответствующих элементов управления ВТ) могут быть вскрыты и проанализированы на протяжении всей взрослой жизни.
    2. Эвтаназия мышей при воздействии CO2.
    3. Enucleate глаза мыши тупым вскрытием.
    4. Откройте веки широко с микрохирургии щипцы, чтобы обеспечить доступ к глазу. Поместите изогнутые щипцы микрохирургии под земной шар на орбиту, чтобы схватить зрительный нерв, не сжимая глазное яблоко. Аккуратно потяните и удалите глазное яблоко с помощью щипков.
    5. Кроме того, вскрыть глазное яблоко с помощью микрохирургии ножницы тщательно сократить параллельно земного шара с четырех сторон к задней части орбиты и отделяя земной шар от окружающих соединительных тканей.
    6. Погрузите глаза в 4% параформальдегида в буфере PBS в течение 30 минут при комнатной температуре для фиксации.
    7. Перенесите фиксированные глазные яблоки в ледяной буфер PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глазные яблоки могут храниться в PBS при 4 градусах По Цельсию в течение 1 недели.
  2. Встраивание гиалоидных сосудов с инъекцией желатина
    1. Подготовьте 5% (w/v) желатиновый раствор.
      1. Взвесить 50 мг желатина.
      2. Растворите желатин в 1 мл дистиллированной воды.
      3. Инкубировать раствор желатина на водяной бане 37 градусов до полного растворения. Храните раствор в воде 37 градусов до использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Большая партия раствора может быть подготовлена и храниться при 4 градусах По Цельсию в качестве aliquots. Каждый раз перед использованием раствор необходимо нагревать в водяной бане 37 градусов по Цельсию, чтобы достичь четкой консистенции.
    2. Под микроскопом вскрытия вводят 50 л желатина в стекловидное тело в лимбу; повторить инъекции 3x в разных местах, чтобы сделать в общей сложности четыре инъекции, равномерно расположенных вокруг лимба(Рисунок 2A).
    3. Инкубировать глазные яблоки в холодильнике 4 градусов или на льду в течение 30 минут, чтобы укрепить впрыскиваемый желатин в стекловидном пространстве.
  3. Рассечение и изоляция гиалоидных сосудов
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 2B-E.
    1. Поместите глазные яблоки в чашку Петри, содержащую PBS, чтобы сохранить ткани от высыхания. Сделайте разрез ножницами микрохирургии на лимбу и удалите роговицу.
    2. Вырезать и удалить зрительный нерв.
    3. Под микроскопом вскрытия, используйте две пары щипцы, чтобы снять и отказаться от склеры, сосудистой и пигментной эпителии реликты (RPE) слоев и удалить радужную оболочку.
    4. С оптически-нервной стороны сетчатки вверх и объектив стороны вниз, вводить 50 Зл ПБС чуть ниже чашки сетчатки, чтобы позволить накопление буфера PBS между желатинированной стекловидного тела и сетчатки.
    5. Аккуратно снимите и удалите чашку сетчатки и цилиарное тело из стекловидного тела с помощью щипц.
    6. Используя передачу пипетки, перенесите желатиновую чашку, содержащую гиалоидную ткань, погруженную в PBS, на слайд микроскопа
    7. Поверните остальную часть ткани (линзы / гиалоид) более, так что сторона объектива обращена вверх.
    8. Поднимите объектив и осторожно ослабить связь между объективом / TVL и VHP, а затем, вырезать HA с микрохирургии ножницами, чтобы удалить объектив-TVL. Держите VHP-часть чашки гиалоида для плоского крепления.
  4. Плоское монтаж и окрашивание гиалоидных сосудов
    1. Аккуратно промыть гиалоидную чашку с PBS на слайде, чтобы удалить все вскрытия мусора.
    2. Убедитесь, что гиалоидная чашка плавает на слайде в адекватном решении PBS.
    3. Аккуратно расположите и отрегулируйте положение желатинированной гиалоидной чашки с помощью щипкания микрохирургии, с ободком чашки, обращенной вниз на горку, для достижения оптимального внешнего вида после плавления.
    4. Поместите слайд с гиалоидной чашкой, погруженной в PBS, на слайд теплее при температуре 37 градусов по Цельсию, подождите, пока желатин растает и гиалоид сглаживается, и удалите слайд, когда он едва сухой (не слишком сухой).
    5. (Необязательно) Иммунопятно гиалоидных сосудов
      1. Сделать блокирующий и проникающий буфер (например, 5% бычьего сывороточки альбумина (BSA) и 0,1% Triton X-100 в буфере PBS). Добавьте 50 зл блокирующий буфер на плоский гиалоидизоляцию и инкубизируете его при комнатной температуре в течение 30 минут.
      2. Нанесите 50 зл первичных антител (например, CD31) (1:100 разбавления в блокирующем буфере) на плоское крепление изоляции гиалоидов, а затем инкубировать его во влажной коробке при 4 градусах Цельсия за одну ночь.
      3. Аккуратно промыть 3x, в течение 5 минут каждый раз, с PBS.
      4. Нанесите 50 кл вторичных антител (например, коза анти-кроличья вторичное антитело-Alexa 488, 1:100 разбавления) на гиалоидное плоское крепление и инкубировать его при комнатной температуре в течение 1 ч.
      5. Аккуратно промыть 3x, в течение 5 минут каждый раз, с PBS.
    6. Добавьте каплю анти-увядающей монтажной среды с DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиноле) для окрашивания ядер в гиалоидных сосудах.
    7. Аккуратно поместите крышку на гиалоид, чтобы завершить плоское крепление.
  5. Изображение и количественная оценка плоскоустановленных гиалоидных сосудов
    1. Изображение DAPI окрашивания гиалоидных сосудов с флуоресцентным микроскопом и убедитесь, что центральный HA виден (исключить образцы без HA).
    2. Определите ветви судов, непосредственно полученные из HA, и вручную подсчитайте количество ветвей судов для количественной оценки.
  6. Визуализация гиалоидных сосудов в поперечном сечении глаз
    1. Встраивайтесь в фиксированные глазные яблоки в оптимальное соединение температуры резки в подходящей ткани формы, а затем, заморозить встроенные глаза на сухой лед или хранить их в морозильной камере -20 градусов.
    2. Используйте микротом криостата, чтобы сделать поперечное сечение встроенных глаз в секции толщиной 12 мкм при -20 градусов по Цельсию.
    3. Соберите поперечные секции глаз на микроскоп слайд комнатной температуры, нежно касаясь тканей разделов, которые будут придерживаться слайда.
    4. Воздушно-сухой обезвоживать секции тканей в течение 30 минут, которые затем могут храниться в морозильной камере -20 градусов до готовности к окрашиванию.
    5. Промыть слайд 1x с PBS, чтобы удалить оставшиеся оптимальные соединения температуры резки на слайде.
    6. (Необязательно) Погрузите слайд в соответствующий фиксаторный буфер (например, 4% параформальдегида в PBS) в течение 15 минут при комнатной температуре для дополнительной фиксации, если это необходимо.
    7. Пермяки ткани с 0,1% Тритон X-100 в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
    8. Подготовка изолектин-IB4 окрашивающий буфер для окрашивания кровеносных сосудов.
    9. Растворите и восстановите изолектин-IB4 (500 мкг) порошок с 50 мл PBS в 50 мл центрифугной трубки.
    10. Медленно добавляйте 50 qL раствора 1 M CaCl2, капля за каплей, в 50 мл смеси PBS/isolectin-IB4. Этот шаг должен быть выполнен медленно, чтобы избежать осадков. Окончательная концентрация CaCl2 составляет 1 мкм. Наличие Ca2 "требуется для изолектин-IB4 окрашивания.
    11. Нанесите 30 зл изолектин-IB4 окрашивающий буфер на поперечные секции глаз на слайде и инкубировать его в мокром ящике при 4 градусах Цельсия за одну ночь.
    12. Промыть 3x, в течение 5 минут каждый раз, с PBS.
    13. Добавьте каплю анти-увядающей монтажной среды с DAPI, чтобы запятнать ядра в секциях.
    14. Аккуратно поместите покрывало на секции тканей, чтобы завершить плоское крепление.
    15. Проверьте ткани под микроскопом, чтобы визуализировать наличие гиалоидных сосудов в глазной чаше.

Результаты

In vivo изображение гиалоидных сосудов у живых мышей
Рисунок 3 A показывает поперечные виды OCT изображений для сетчатки и гиалоидных тканей в 3-месячного WT и Lrp5-/-мышей, животной модели с стойкими гиалоидными. Глаз WT показывает отсутствие гиалои...

Обсуждение

Методы оценки и характеристики гиалоидных сосудов являются интуитивными и необходимыми процедурами для наблюдения регрессии гиалоидных сосудов в моделях животных, чтобы позволить исследования механизмов, лежащих в основе сосудистой регрессии во время развития. В то время как in vivo ви...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) гранты (R01 EY024963 и EY028100) в JC З.В. была поддержана Рыцари тамплиеров Глаз Фонд Карьера Грант. Процедура изоляции гиалоидов, описанная в этом исследовании, была адаптирована с модификацией протоколов, щедро разделяемых докторами Ричардом Лэнгом, Тосихидэ Курихара и Лоис Смит, которым авторы благодарны.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AK-Fluor (fluorescein injection, USP)Akorn17478-253-10
Anti-CD31 antibodyAbcamab28364
Antifade mounting mediumThermo FisherS2828
Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Artificial tear eyedropSystaneN/A
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA2058
C57BL/6J miceThe Jackson LaboratoryStock NO: 000664
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC1016
CryostatLeicaCM3050S
CryostatLeicaCM3050 S
Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedropCyclomydrilN/A
Gelatin Sigma-AldrichG9382
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11008
Heating boardLab-Line Instruments Inc.N/A
Isolectin GS-IB4, 594 conjugateThermoFisher ScientificI21413
Ketamine hydrochloride injectionKetaVedNDC 50989-996-06
Lrp5-/- miceThe Jackson LaboratoryStock NO. 005823Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA
Micron IV and OCTPhoenix Research LabsN/AImaging software: InSight
MicroscopeZeissdiscovery v8
Microsurgery forcepsScanlan International4004-05
Microsurgery scissorsScanlan International6006-44
Optimal cutting temperature compoundTissue-Tek4583
Optimal cutting temperature compoundAgar ScientificAGR1180
Paraformaldehyde (16%)Electron Microscopy Sciences15710
Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds)Fisher Scientific12-20
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X)TeknovaP0496
Slide cover glassPremiere94-2222-10
Superfrost microscope slides Fisherbrand12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Xylazine sterile solutionAkorn: AnaSedNDC: 59399-110-20

Ссылки

  1. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
  2. Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. , (2011).
  3. Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).
  4. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
  5. Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
  6. Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
  7. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  8. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  9. Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
  10. Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
  11. Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
  12. Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
  13. Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
  14. Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
  15. Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
  16. Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
  17. Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
  18. Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
  19. Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
  20. Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
  21. Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
  22. Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
  23. Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
  24. McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
  25. Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
  26. Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
  27. Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
  28. Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
  29. Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
  30. Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
  31. Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

147LRP5Wnt

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены