JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول في كل من طرق الجسم الحي والجسم الحي السابق لتصور وتوصيف الأوعية الهيالويدة بشكل كامل، وهو نموذج لانحدار الأوعية الدموية في عيون الماوس، وذلك باستخدام التصوير المقطعي للتماسك البصري وتصوير الأوعية الفلورية فوندو للتصوير الحي والجسم الحي السابق العزلة وجبل شقة لاحقة من hyaloid للتحليل الكمي.

Abstract

في العين ، تغذي الأوعية الهيلويدالجنينية العدسة النامية وشبكية العين وتتراجع عندما تتطور الأوعية الشبكية. يمكن رؤية الانحدار المستمر أو الفاشل للأوعية الهيالويدة في أمراض مثل ارتفاع ضغط الدم المستمر الزجاجي الأولي (PHPV)، مما يؤدي إلى إعاقة مسار الضوء وضعف الوظيفة البصرية. قد يؤدي فهم الآليات الكامنة وراء انحدار الأوعية الهيالويدية إلى رؤى جزيئية جديدة في عملية الانحدار الوعائي وطرق جديدة محتملة لإدارة الأمراض مع الأوعية الهيالويدة المستمرة. هنا نقوم بوصف إجراءات تصوير الهيالويد في الفئران الحية مع التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) وتصوير الأوعية الفلورية فوندو (FFA) وبروتوكول تقني مفصل لعزل ومسطحة تصاعد الهيالويد من الجسم الحي للتحليل الكمي. تم استخدام البروتين المتصل بمستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة 5 (LRP5) كنموذج تجريبي للأوعية الهيالويدة المستمرة، لتوضيح التقنيات. وقد تيسر هذه التقنيات معاً إجراء تقييم شامل للأوعية الهيالويدية كنموذج تجريبي لانحدار الأوعية الدموية ودراسات عن آلية الأوعية الهيالويدية المستمرة.

Introduction

إمدادات الدم في العين أمر ضروري لضمان التطور الطبيعي للشبكية والأنسجة العينية المحيطة بها وتجهيز وظيفة بصرية مناسبة. هناك ثلاثة أسرة الأوعية الدموية في العين: الأوعية الدموية الشبكية، والمشيمي، وشبكة الدورة الدموية الجنينية عابرة من الأوعية الهيالويد. يتطلب تطور الأوعية الدموية العينية التنسيق المكاني والزمني في جميع أنحاء تكوين الأجنة ونضج الأنسجة. ومن بين الأسرّة الثلاثة للأوعية الدموية، فإن الأوعية الدموية هي أول نظام وظيفي لإمداد الدم يوفر التغذية والأكسجين للعدسة الجنينية المشكلة حديثاً والشبكية النامية. الأوعية الهيالويد تتراجع في نفس الوقت الذي تتطور فيه الأوعية الدموية الشبكية وتنضج1. تراجع الأوعية الدموية هيالويد أمر محوري للسماح بمسار بصري واضح لتطوير وظيفة بصرية. وبالتالي، فإن عملية الانحدار الوعائي هذه لا تقل أهمية عن نمو الأوعية الدموية الشبكية. قد يؤدي ضعف انحدار الهيالويد إلى أمراض العين. وعلاوة على ذلك، فإن تراجع الأوعية الهيالويديوفر نظاما نموذجيا للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي ينطوي عليها تنظيم انحدار الأوعية الدموية، والتي قد تكون لها آثار على تنظيم الأوعية الدموية في الأجهزة الأخرى أيضا.

يتكون الأوعية الدموية الهيالويدية، المشتقة من الشريان الهيالويد (HA)، من بروبريا الهيالوبيدة (VHP)، وستراتا فاسكولوسا لينتيس (TVL)، والغشاء الشعيراتي (PM). ويوفر التغذية للشبكية النامية، والجسم الزجاجي الأولية، والعدسة أثناء النمو الجنيني2. الناشئة عن HA، فروع VHP الأمامية من خلال زجاجي إلى العدسة. وTVL أكواب السطح الخلفي لكبسولة العدسة، وanastomoses إلى رئيس الوزراء، الذي يربط إلى الشرايين الهدبية الأمامية، وتغطي السطح الأمامي للعدسة2،3، مما أدى إلى تشكيل شبكة من الأوعية في PM 3 , 4 , 5.ومن المثير للاهتمام، لا توجد أوردة في الأوعية الدموية hyaloid، والنظام يستخدم الأوردة المشيمية لإنجاز الصرف الوريدي.

في الجنين البشري ، فإن الأوعية الدموية الهيالويدية تكاد تكتمل في الأسبوع التاسع تقريبا من الحمل وتبدأ في التراجع عندما تظهر أوعية الشبكية الأولى ، خلال الشهر الرابع من الحمل2. بدءا من ضمور VHP، الانحدار من الشبكات الشعرية من TVL، PM، وأخيرا، وHA يحدث في وقت لاحق2،3. وفي الوقت نفسه، يتراجع الجسم الزجاجي الأولي ويبدأ الجسم الزجاجي الثانوي في تشكيل، وتتألف من مكونات المصفوفة خارج الخلية، بما في ذلك ألياف الكولاجين. بحلول الشهر السادس من الحمل، يتم تقليل الجسم الزجاجي الأولي إلى قناة شفافة صغيرة تمتد من قرص العصب البصري إلى العدسة، وتسمى قناة كلوكيه أو قناة الهيالويد، ويصبح الجسم الزجاجي الثانوي المكون الرئيسي للجزء الخلفي 2 , 3.الدورة الدموية الهيالويد يختفي في الغالب في 35 إلى 36 أسابيع من الحمل، قبل الولادةمباشرة 3.

على عكس البشر، الذين يتم التراجع تماما الأوعية الدموية hyaloid عند الولادة، يبدأ نظام الأوعية الدموية هيالويد الماوس إلى التراجع بعد الولادة. كما يولد الشبكية الماوس الأوعية الدموية والشبكية تتطور بعد الولادة، والأوعية الهيالويد تتراجع في وقت واحد من يوم ما بعد الولادة (P) 4 ويتم التراجع تماما في الغالب من قبل P216 (الشكل1). يختفي PM أولا بين P10 و P12، ويختفي VHP بين P12 و P16، في حين أن عددا صغيرا من خلايا TVL وHA لا تزال حتى في P16، وP21 تراجع نظام الأوعية الدموية هيالويد هو كامل تقريبا6. في هذه الأثناء، تبدأ الأوعية الدموية الشبكية في التطور بعد الولادة. تمتد الطبقة السطحية من الضفيرة الوعائية بشكل كامل إلى الشبكية المحيطية في P7-P8، وتتطور الطبقة العميقة (الموجودة في طبقة plexiform الخارجية) من P7-P12، وأخيراً، تتطور الضفيرة المتوسطة في طبقة plexiform الداخلية بين P12 وP157 . كما يتطور الأوعية الدموية الشبكية، فإنه يحل تدريجيا محل وظيفة الأوعية الهيالويد تراجع في الوقت الذي ما يكون، وتوفير التغذية والأكسجين للعين النامية. يوفر حدوث تراجع الأوعية الهيالويدية بعد الولادة في الفئران نموذجاً تجريبياً يسهل الوصول إليه لمراقبة ودراسة الأوعية الدموية الهيالويدية، فضلاً عن الأساس الجزيئي الذي يحكم عمليات الانحدار الوعائي في إطار كل من الفسيولوجية و الظروف المرضية8.

يمكن رؤية فشل الانحدار الهيالويد في أمراض مثل PHPV ، وهو شذوذ نمو خلقي نادر للعين ناتج عن تراجع فاشل أو غير كامل في الأوعية الدموية الجنينية والزجاجية الأولية والهيالويد9. الآليات التي تنظم عملية الانحدار من الأوعية الدموية الهيالويد معقدة ومدروسة على نطاق واسع. أحد المسارات الجزيئية الرئيسية الضرورية للتراجع الطبيعي للأوعية الهيالويد هو مسار إشارة Wnt10، حيث تم ربط الطفرات الوراثية في هذا المسار التي تؤثر على كل من الليغانت والمستقبلات مع PHPV في البشر9. حددت الدراسات التجريبية الليغاد Wnt، Wnt7b، التي تنتجها الضامة حول الأوعية الهيالويد في العين النامية للتوسط في هذه العملية الانحدار. Wnt7b ينشط Wnt الإشارات عن طريق الربط مع مستقبلات frizzled4 (FZD4)/LRP5 في الخلايا البطانية المجاورة لبدء المبرمج الخلية، مما يؤدي إلى تراجع الأوعية الهيالويد10. ونتيجة لذلك، تظهر الفئران التي تعاني من نقص Wnt7bاستمرارا ً للأوعية الهيالويدية10. وبالمثل، فإن الرباط غير التقليدي Wnt، Norrin (المشفرة من قبل جين Ndp)، يربط أيضا إلى FZD4/LRP5 للحث على تراجع السفينة هيالويد أثناء التنمية. Ndpy/-, Lrp5-/-, و Fzd4-/- الفئران جميع عرض تأجيل تراجع السفينة hyaloid, دعم دور تنظيمي حاسم من Wnt إشارة11,12, 13،14،15،16. وعلاوة على ذلك، آخر Wnt coreceptor LRP6 يتداخل مع LRP5 في وظيفتها على تحوير مسار إشارة Wnt في الخلايا البطانية الوعائية هيالويد17. وتشمل العوامل الأخرى التي قد تسهم أيضا في الانحدار الهيالويد عامل نقص الأكسجة اللاتزاز18،19، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية20،21، الكولاجين-1822، 23، ARF24، أنجيوبويتين 225، والعظام البروتين المورفوجيجيني -426. في هذه الورقة، نستخدم Lrp5-/- الفئران كنموذج للأوعية الهيالويدة المستمرة لإثبات تقنيات تقييم وتوصيف الأوعية الدموية الهيالويدمنة من خلال كل من في الجسم الحي والأساليب الجسم الحي ة.

التصور من الأوعية الدموية الهيالويد في الجسم الحي والجسم الحي السابق أمر ضروري لدراسة آليات انحدار السفينة هيالويد. الأساليب الحالية لمراقبة الأوعية الدموية الهيالويد تركز أساسا على تصور وتحليل VHP وHA، من خلال صور OCT وFFA، والمقاطع العرضية للعين، وجبل مسطح هيالويد. OCT وFFA قوية في أدوات التصوير الحي، مما يسمح بالمراقبة الطولية في الحيوانات الحية بعد أن فتحت عيونهم. وعلاوة على ذلك، يوفر جبل مسطح معزول الهيالويد تصورا ً للأوعية الدموية الهيالويدية بأكملها ووسيلة لتحقيق تحديد دقيق لأرقام السفن. ومع ذلك فإن الطبيعة الحساسة والهشة للأوعية الهيالويدية والصعوبات التقنية الناتجة عن عزلتها قد حدت من استخدامها في أبحاث العيون إلى حد ما10و17و27. في هذه الورقة، نقدم بروتوكول مفصل من التصور من الأوعية الهيالويد، والجمع بين كل من في الجسم الحي التصوير الشبكية الحية والجسم الحي السابق معزولة هيالويد جبل مسطح لتعزيز جدوى هذه التقنيات. وقد تم تكييف هذا البروتوكول مع التعديل والتوسع من المنشورات السابقة على طريقة في الجسم الحي من fundus الحية وOCT التصوير28 وطريقة الجسم الحي من معزولة هيالويد شقة جبل11.

Protocol

تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا لبيان جمعية البحوث في الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية للتجارب الحيوانية، وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة ( NIH) فيما يتعلق برعاية الحيوانات واستخدامها للإجراءات التجريبية واللوائح التي وضعتها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في مستشفى بوسطن للأطفال. Lrp5-/- الفئران (المخزون رقم 005823; جاكسون مختبر) وله البرية من نوع (WT) السيطرة C57BL/6J الفئران (المخزون رقم 000664; جاكسون مختبر) استخدمت لهذه الدراسة.

1. الجزء الأول: في التصوير الحي للأوعية الهيالويد باستخدام نظام تصوير الشبكية القوارض

  1. إعداد تخدير الفئران وتوسع التلميذ
    1. حدد الفئران.
      1. استخدام الفئران التي هي أقدم من P12 (بعد أن فتحت عيونهم) لتصوير الشبكية; كلا الجنسين هي مناسبة.
      2. كما هو مطلوب، صورة متحولة الفئران مع الانحدار الهيالويد تأخر (والضوابط WT الخاصة بهم) طوال مرحلة البلوغ. قد لا تظهر فئران WT التي يزيد عمرها عن 3 أسابيع الكثير من الأوعية الهيالويدالمتبقية القابلة للكشف، وبالتالي فإن P12-P21 مثالية لتصوير الهيالويد WT المرئي المتبقي.
    2. إعداد خليط الكيتامين / إكسلازين للتخدير.
      1. تناول 2.3 مل من محلول مخزون الكيتامين (100 مغ/مل) و0.7 مل من محلول الأرصدة إكسيلازين (20 ملغم/مل) وأضف 20 مل من محلول ملحي معقم (0.9% كلوريد الصوديوم) لصنع حل عملي لخليط الكيتامين/إكسيليزين (10 ملغم/مل كيتامين و0.6 ملغم/مل إكسيليزين).
    3. التخدير الفئران عن طريق حقن الكيتامين /إكسيليزين داخل الصفاق في حجم 8X وزن جسم الماوس (على سبيل المثال، يحتاج 20 غرام من الماوس 160 ميكرولتر من الكيتامين / إكسلازين خليط حل العمل لتحقيق جرعة عمل من الكيتامين [80 ملغ / كغ وزن الجسم] و إكسيليرازين [4.8 مغ/كغ وزن الجسم] خليط).
    4. تطبيق قطرة واحدة من محلول المخدرات المتوسعة التلميذ (انظر جدولالمواد) على كل عين لتوسعة تلاميذ الماوس مباشرة بعد التخدير.
    5. تقييم مستوى التخدير عن طريق دواسة رد الفعل (قرصة اصبع القدم الخلفية شركة). الانتظار حتى يتم التخدير الماوس بما فيه الكفاية (لا رد فعل دواسة) وتلاميذها هي على نطاق واسع المتوسعة.
  2. التصوير المقطعي للتماسك البصري للأوعية الهيالويدية
    1. ترطيب القرنية الماوس مع الدموع الاصطناعية، ومن ثم، ضع الماوس على مرحلة تحديد المواقع.
    2. اتصل بلطف القرنية الماوس مع عدسة التحقيق OCT. ضبط الماوس والتحقيق بحيث يكون رأس العصب البصري في وسط المجال البصري في صورة fundus، لتوجيه التصوير OCT.
      ملاحظة: لمزيد من التفاصيل حول الإعداد العام لنظام تصوير الشبكية القوارض (انظر جدولالمواد) وضبط موقف الماوس، يرجى الرجوع إلى Gong وآخرون28.
    3. ضبط التركيز لتحقيق الصور المثلى من OCT.
    4. ضبط زاوية الخط المشار إليه في برنامج التصوير OCT (انظر جدولالمواد) للكشف عن السفن الهيالويد المستمرة، ومن ثم، التقاط الصور.
  3. واو محمد العلى ال (و) محمد محمد (أ) تصوير الموجات فوق الصوتية تصوير الأوعية الهيالويد
    1. إعداد محلول الفلورسين: إضافة 9 مل من المحلول المالي المعقم بالفوسفات المخزنة (PBS) إلى 1 مل من محلول الفلورسين (تركيز المخزون: 100 ملغ/مل). تركيز حل العمل النهائي هو 10 ملغ /مل.
    2. حقن داخل الصفاق محلول العمل الفلوري (5 ميكرولتر / ز وزن الجسم).
    3. ترطيب القرنية الماوس مع الدموع الاصطناعية، ومن ثم، وضع الماوس على مرحلة تحديد المواقع.
    4. ضع عدسة مجهر التصوير الشبكي ميكرون الرابع لإجراء اتصال لطيف مباشر مع القرنية الماوس. ضبط المحاذاة قليلا لوضع رأس العصب البصري في وسط حقل العرض.
    5. تغيير مرشح المجهر إلى قناة الفلورسنت الخضراء.
    6. التركيز على الأوعية الهيالويد المستمرة لالتقاط الصور.
    7. التقاط صور متعددة بعد 1 دقيقة، 3 دقائق، 5 دقيقة، و 10 دقيقة (لا يزيد عن 10 دقيقة) بعد الحقن لتحديد أفضل نقطة زمنية (نسبة الإشارة إلى الخلفية) لمراقبة الأوعية hyaloid. إكمال إجراء FFA في غضون 10 دقيقة، وبعد ذلك قد تصبح الفلورسين منتشرة جدا وجعل السفن غير مرئية.
  4. شفاء الفئران من التخدير
    1. بعد الإجراءات، والحفاظ على الفئران على وسادة التدفئة الدافئة.
    2. انتظر حتى الفئران هي متنقلة مرة أخرى لإعادتها إلى قفص الماوس.

2. الجزء الثاني: تصور الجسم الحي السابق للأوعية الهيالويد

  1. إعداد عيون الماوس الثابتة
    1. حدد الفئران من العمر المناسب.
      ملاحظة: عادة ما يتم التضحية الفئران حديثي الولادة في P8 لتشريح الهيالويد. كلا الجنسين هي مناسبة. الفئران المتحولة مع الانحدار الهيالويد تأخر (وضوابط WT كل منها) يمكن تشريحها وتحليلها طوال مرحلة البلوغ.
    2. قتل الفئران عن طريق التعرض لثاني أكسيد الكربون2.
    3. اينوليت عيون الماوس عن طريق تشريح حادة.
    4. فتح الجفون واسعة مع ملقط الجراحة الدقيقة للسماح بالوصول إلى مقلة العين. ضع ملقط الجراحة المجهرية المنحنية تحت الكرة الأرضية في المدار لفهم العصب البصري دون الضغط على مقلة العين. سحب بلطف وإزالة مقلة العين مع ملقط.
    5. بدلا من ذلك، تشريح مقلة العين باستخدام مقص الجراحة الدقيقة لقطع بعناية موازية للكرة الأرضية من الجوانب الأربعة نحو الجزء الخلفي من المدار وفصل الكرة الأرضية من الأنسجة الضامة المحيطة بها.
    6. تزج العينين في 4٪ paraformaldehyde في العازلة PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتثبيت.
    7. نقل مقلة العين الثابتة إلى الجليد الباردة PBS العازلة.
      ملاحظة: قد يتم تخزين مقلة العين في PBS عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  2. تضمين أوعية الهيالويد مع حقن الجيلاتين
    1. إعداد 5٪ (ث / الخامس) حل الجيلاتين.
      1. وزن 50 ملغ من الجيلاتين.
      2. إذابة الجيلاتين في 1 مل من الماء المقطر.
      3. احتضان محلول الجيلاتين في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يذوب بالكامل. احتفظ بالحل في ماء 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
        ملاحظة: قد يتم إعداد دفعة أكبر من الحل وتخزينها في 4 درجة مئوية كما aliquots. في كل مرة قبل الاستخدام، يحتاج الحل إلى الاحماء في حمام مائي 37 درجة مئوية لتحقيق اتساق واضح.
    2. تحت مجهر تشريح، حقن 50 ميكرولتر من محلول الجيلاتين في الجسم الزجاجي في الأطراف. كرر حقن 3X في مواقع مختلفة لجعل ما مجموعه أربع حقن، متباعدة بالتساوي حول الأطراف (الشكل2A).
    3. احتضان مقلة العين في ثلاجة 4 درجة مئوية أو على الجليد لمدة 30 دقيقة لتقوية الجيلاتين عن طريق الحقن في الفضاء الزجاجي.
  3. تشريح وعزل الأوعية الهيالويدية
    ملاحظة: انظر الشكل 2باء- هاء.
    1. ضع مقلة العين في طبق بيتري يحتوي على PBS للحفاظ على الأنسجة من التجفيف. قم بعمل شق مع مقص الجراحة المجهرية في الأطراف وإزالة القرنية.
    2. قص وإزالة العصب البصري.
    3. تحت مجهر تشريح، استخدم زوجين من الملقط لقشر وتجاهل طبقات التصلب، المشيمية، وظهارة صبغة الشبكية (RPE) وإزالة القزحية.
    4. مع الجانب البصري العصبي من شبكية العين التي تواجه صعودا والجانب العدسة إلى أسفل، حقن 50 درجة مئوية من PBS فقط تحت كأس شبكية العين للسماح بتراكم العازلة PBS بين الجسم الزجاجي الجيلاتيني وشبكية العين.
    5. قشر بلطف وإزالة كأس شبكية العين والجسم الهدبي من الجسم الزجاجي مع ملقط الجراحة الدقيقة.
    6. باستخدام ماصة نقل، نقل كوب الجيلاتين التي تحتوي على الأنسجة الهيالويد مغمورة في PBS إلى شريحة المجهر
    7. بدوره بقية الأنسجة (عدسة / hyaloid) أكثر، وبالتالي فإن الجانب العدسة تواجه.
    8. رفع العدسة وتخفيف بلطف الاتصال بين العدسة / TVL وVHP، ومن ثم، وقطع HA مع مقص الجراحة الدقيقة لإزالة عدسة TVL. الحفاظ على VHP-جزء من كوب hyaloid لتركيب شقة.
  4. تركيب شقة وتلطيخ الأوعية الهيالويد
    1. شطف بلطف كوب الهيالويد مع PBS على الشريحة لإزالة جميع الحطام تشريح.
    2. تأكد من أن كأس hyaloid يطفو على الشريحة في حل PBS كافية.
    3. ترتيب بلطف وضبط موقف كوب الهيالويد الجيلاتيني مع ملقط الجراحة الدقيقة، مع حافة الكأس التي تواجه أسفل على الشريحة، لتحقيق المظهر الأمثل بعد ذوبان.
    4. ضع الشريحة مع كوب الهيالويد مغمورة في PBS على تدفئة الشريحة في 37 درجة مئوية، والانتظار حتى يذوب الجيلاتين وتسطيح hyaloid، وإزالة الشريحة عندما تكون جافة بالكاد (لا الإفراط في الجافة).
    5. (اختياري) مناعة الأوعية الهيالويد
      1. جعل حجب واختراق العازلة (على سبيل المثال، 5٪ الزلال المصل البقري [BSA] و 0.1٪ تريتون X-100 في PBS العازلة). أضف 50 ميكرو لتر من المخزن المؤقت للحجب إلى عزل الهيالويد المسطح واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      2. تطبيق 50 درجة مئوية من الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال، CD31) (1:100 تخفيف في حظر العازلة) على جبل مسطح من عزل الهيالويد، ومن ثم، حضانة في مربع الرطب في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      3. شطف بلطف 3X، لمدة 5 دقائق في كل مرة، مع PBS.
      4. تطبيق 50 درجة مئوية من الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال، الماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية اليكسا 488، 1:100 تخفيف) على جبل مسطح هيالويد وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
      5. شطف بلطف 3X، لمدة 5 دقائق في كل مرة، مع PBS.
    6. إضافة قطرة من المضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة مع DAPI (4'، 6-دياميدينو-2-فينيليندول) لوصمة عار النوى في الأوعية الهيالويد.
    7. وضع بلطف غطاء على hyaloid لإكمال جبل شقة.
  5. التصوير والقياس الكمي للأوعية الهيالويدة المسطحة
    1. صورة DAPI تلطيخ السفن hyaloid مع المجهر الفلورسنت وتأكد من HA المركزية مرئية (استبعاد العينات دون HA).
    2. تحديد فروع السفن المشتقة مباشرة من HA وحساب عدد فروع السفن يدويا ً للقياس الكمي.
  6. تصور الأوعية الهيالويدية في المقطع العرضي من العينين
    1. قم بتضمين مقلة العين الثابتة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل في قالب نسيج مناسب، ثم قم بتجميد العيون المدمجة على الثلج الجاف أو تخزينها في فريزر -20 درجة مئوية.
    2. استخدام ميكروتومي cryostat لجعل مقطع عرضي من العينين جزءا لا يتجزأ من أقسام من سمك 12 درجة مئوية في -20 درجة مئوية.
    3. جمع المقاطع العرضية للعين على درجة حرارة غرفة الشريحة المجهر عن طريق لمس بلطف أقسام الأنسجة، والتي سوف تلتزم الشريحة.
    4. الهواء الجاف لتجفيف أقسام الأنسجة لمدة 30 دقيقة~ ، والتي يمكن تخزينها بعد ذلك في فريزر -20 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للتلطيخ.
    5. شطف الشريحة 1X مع PBS لإزالة ما تبقى من مجمع درجة الحرارة القطع الأمثل على الشريحة.
    6. (اختياري) تزج الشريحة في المخزن المؤقت المثبت المناسب (على سبيل المثال، 4٪ بارافورمالدهايد في PBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتثبيت إضافي، إذا لزم الأمر.
    7. Permeabilize الأنسجة مع 0.1٪ تريتون X-100 في PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    8. إعداد isolectin-IB4 تلطيخ العازلة لتلطيخ الأوعية الدموية.
    9. حل وإعادة تشكيل مسحوق isolectin-IB4 (500 ميكروغرام) مع 50 مل من PBS في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    10. إضافة ببطء 50 درجة مئوية من 1 M CaCl2 الحل، قطرة قطرة، في 50 مل من PBS / isolectin-IB4 خليط. هذه الخطوة تحتاج إلى تنفيذ ببطء لتجنب هطول الأمطار. التركيز النهائي من CaCl2 هو 1 μM. وجود Ca2+ مطلوب لتلطيخ isolectin-IB4.
    11. ضع 30 ميكرو لتر من عازلة تلطيخ isolectin-IB4 على المقاطع العرضية للعين على الشريحة واحتضنها في صندوق رطب عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    12. شطف 3X، لمدة 5 دقائق في كل مرة، مع PBS.
    13. إضافة قطرة من المضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة مع DAPI لوصمة عار النوى في الأقسام.
    14. وضع بلطف غطاء على أقسام الأنسجة لإكمال جبل مسطح.
    15. تحقق من الأنسجة تحت المجهر لتصور وجود الأوعية الهيالويد داخل العين.

النتائج

في التصوير الحي للأوعية الهيالويدفية في الفئران الحية
الشكل 3 ويكشف عن وجهات نظر مقطعية من الصور OCT لشبكية العين والأنسجة الهيلويد في 3 أشهر من العمر WT وLrp5-/-الفئران، وهو نموذج حيواني مع الهيالويد المستمر. تُظهر عين WT عدم وجود أنسجة الهيالويد، ...

Discussion

تقنيات تقييم وتوصيف الأوعية الهيالويدهية هي إجراءات بديهية وضرورية لمراقبة تراجع الأوعية الهيالويد في النماذج الحيوانية، للسماح بإجراء دراسات على الآليات الكامنة وراء تراجع الأوعية الدموية أثناء التنمية. في حين أن التصوير الشبكي في الجسم الحي يسمح بالمراقبة الطولية للانحدار الهيالوي?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (R01 EY024963 و EY028100) إلى J.C. Z.W. بدعم من منحة المبتدئين المهنية لمؤسسة فرسان تمبلر للعيون. تم تكييف إجراء عزل الهيالويد الموصوف في هذه الدراسة مع تعديل من البروتوكولات التي تقاسمها بسخاء الدكتور ريتشارد لانغ، توشيهيد كوريهارا، ولويس سميث، الذين يشكرون المؤلفين.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AK-Fluor (fluorescein injection, USP)Akorn17478-253-10
Anti-CD31 antibodyAbcamab28364
Antifade mounting mediumThermo FisherS2828
Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Artificial tear eyedropSystaneN/A
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA2058
C57BL/6J miceThe Jackson LaboratoryStock NO: 000664
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC1016
CryostatLeicaCM3050S
CryostatLeicaCM3050 S
Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedropCyclomydrilN/A
Gelatin Sigma-AldrichG9382
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11008
Heating boardLab-Line Instruments Inc.N/A
Isolectin GS-IB4, 594 conjugateThermoFisher ScientificI21413
Ketamine hydrochloride injectionKetaVedNDC 50989-996-06
Lrp5-/- miceThe Jackson LaboratoryStock NO. 005823Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA
Micron IV and OCTPhoenix Research LabsN/AImaging software: InSight
MicroscopeZeissdiscovery v8
Microsurgery forcepsScanlan International4004-05
Microsurgery scissorsScanlan International6006-44
Optimal cutting temperature compoundTissue-Tek4583
Optimal cutting temperature compoundAgar ScientificAGR1180
Paraformaldehyde (16%)Electron Microscopy Sciences15710
Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds)Fisher Scientific12-20
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X)TeknovaP0496
Slide cover glassPremiere94-2222-10
Superfrost microscope slides Fisherbrand12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Xylazine sterile solutionAkorn: AnaSedNDC: 59399-110-20

References

  1. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
  2. Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. , (2011).
  3. Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).
  4. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
  5. Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
  6. Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
  7. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  8. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  9. Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
  10. Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
  11. Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
  12. Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
  13. Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
  14. Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
  15. Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
  16. Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
  17. Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
  18. Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
  19. Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
  20. Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
  21. Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
  22. Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
  23. Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
  24. McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
  25. Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
  26. Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
  27. Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
  28. Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
  29. Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
  30. Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
  31. Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147LRP5Wnt

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved