משלוח אלקטרופסטי לγ-חומצה עמינח בוטירית (נגבה) לפוקוס אפילפטי מונע התקפים בעכברים

Summary

האתגר של מחקר אפילפסיה הוא לפתח טיפולים חדשניים עבור חולים שבהם הטיפול הקלאסי אינו מספיק. באמצעות פרוטוקול חדש-בעזרתו של מערכת העברת תרופות להשתלות-אנו מסוגלים לשלוט בהתקפים בעכברים מוחוקים על-ידי המסירה האלקטרופיניטית של נגבה לתוך המוקד האפילפטי.

Abstract

אפילפסיה היא קבוצה של הפרעות נוירולוגיות אשר משפיע על מיליוני אנשים ברחבי העולם. למרות שהטיפול בתרופות מועיל ב-70% מהמקרים, תופעות לוואי חמורות משפיעות על איכות החיים של המטופלים. יתר על כן, אחוז גבוה של חולים אפילפטי עמידים בפני סמים; במקרה שלהם, נוירוכירורגיה או גירוי נוירולוגי נחוצים. לכן, המטרה העיקרית של מחקר אפילפסיה היא לגלות טיפולים חדשים אשר מסוגלים לרפא אפילפסיה ללא תופעות לוואי או מניעת התקפים חוזרים בחולים עמידים בפני סמים. נוירוהנדסאים מספקת גישות חדשות באמצעות אסטרטגיות וטכנולוגיות הרומן כדי למצוא פתרונות טובים יותר לריפוי חולים אפילפטי בסיכון.

כהדגמה של פרוטוקול ניסיוני הרומן במודל העכבר החריף של אפילפסיה, מערכת ישירה של סמים באתרו האספקה החשמלית משמש. כלומר, בדיקה עצבית שילוב משאבת יון מיקרופלואידיסי (Μd) עבור מסירת סמים על פי דרישה והקלטה בו של פעילות עצבית מקומית מושתל והפגינו להיות מסוגל לשלוט 4-פמפרידין המושרה (4AP המושרה) תפיסה כמו פעילות אירוע. הריכוז הγ-עמינח של החומצה הבוטירית מוחזק בטווח הפיזיולוגי על ידי השליטה המדויקת של משלוח הנגבה כדי להגיע לאפקט אנטי-אפילפטי במוקד התפיסה, אך לא לגרום להתפרצויות של התפרצויות ריבאונד. השיטה מאפשרת הן זיהוי של פעילות פתולוגית והתערבות להפסיק התקפים על ידי אספקת נוירוטרנסמיטורים מעכבות ישירות המוקד אפילפטי עם שליטה מדויקת זמן.

כתוצאה מההתפתחויות לשיטה הניסיונית, ניתן להביא SLEs באופן מקומי מאוד המאפשר השתלטות על ידי משלוח בדיוק מכוון באמצעות מסירת התפיסה בתחילת ההתקף.

Introduction

אפילפסיה היא ההפרעה הנוירולוגית הרביעית הנפוצה ביותר: כ 1% מהאוכלוסייה סובלת מאפילפסיה, וכשליש מהמושפעות יש התקפים חוזרים. ברוב המקרים, התקפים יכולים להיות נשלט עם תרופות. עם זאת, טיפול בסמים צריך להיות מוגדר עבור כל מטופל בנפרד, שבו המינון הנכון יכול לקחת שנים כדי למצוא^1,2. בנוסף, לרוב התרופות יש תופעות לוואי חמורות המקטינה את איכות החיים^3,4,5,6,7. לבסוף, ב 30% מהחולים במקרים עמידים בפני תרופות, ובמקרה של מקור קבוע מחולל תפיסה אחת, רק כירורגי resective יכול להחליש את המופע של התקפים⁸. לכן, היוזמה העיקרית במחקר אפילפסיה המודרנית היא לגלות אסטרטגיות חדשות אשר יכולים למנוע התקפים חוזרים לחולים בסיכון, תוך הפחתת הצורך של טיפולים חזקים בתרופות וניתוחים פולשנית מחדש.

ויהיו אפילפסיה להתרחש כאשר יש חוסר איזון בתוך מעגלים המעכבות ושאיפה בכל רחבי המוח (אפילפסיה כללית) או בחלק מקומי של המוח (אפילפסיה מוקד), כך הנוירונים הפרשות בצורה נורמלית^{9 ,} מיכל ^{עשור , 11}. תרופות נוגדות אפילפסיה יכולות לפעול בשתי דרכים שונות במניעת תפיסה: הפחתת עירור או שיפור עיכוב¹². באופן ספציפי, הם יכולים לשנות את פעילות החשמל של תאים עצביים על ידי השפעה על ערוצי יונים בתא קרום¹³ או לפעול על שידור כימי בין הנוירונים על ידי השפעה על הנוירוטרנסמיטר מעכבות נגבה או ההתרגשות גלוטמט ב הסינפסות^14,15. עבור תרופות מסוימות, מצב הפעולה אינו ידוע¹⁸. כמו כן, טיפולים בתרופות יש השפעה רציפה על חולים ולא יכול להסתגל הדינמיקה השכיחות של התקפים. באופן אידיאלי, תרופות עם מנגנונים ספציפיים של פעולה יפעלו על התהליכים הבסיסיים אפילפסיה. טיפול אופטימלי לא ייגע באינטרפיקציה של המוח אך יפעל מיד כאשר התקף מתחיל להתפתח. בניגוד לכך, בכל המקרים של אפילפסיה, תרופות כיום משמעותה טיפול שיטתי, המשפיעים על המוח כולו ועל כל הגוף של החולה⁹.

התקפים אפילפטי יכולים להופיע שנים רבות לאחר העלבון הראשוני כגון טראומה מוחית. התקופה שבין העלבון הראשוני לבין התרחשות ההתקפים הספונטניים הראשונים מתאפיינת בארגונים מולקולריים וסלולאריים ניכרים, כולל מוות עצבי עם היעלמות חיבורי הרשת העצביים והאקאליות לבלוב/neosynaptogenesis עם הופעת קשרים חדשים^19,20,21. פעם התקפים הופכים חוזרים, התדר שלהם ואת חומרת נוטים להגדיל, מעורבים באזורים המוח יותר. חשוב להבדיל בין האתרים של התפרצות התפיסה (אזורים epileptogenic) מרשתות הפצה, מאחר שכללי התפיסה הראשית וההפצה עשויים להיות שונים. מחקרים שבוצעו על רקמות האדם ומודלים ניסיוניים של אפילפסיה סיפקו נתונים חשובים לגבי התארגנות משנה של מעגלים ויכולתם לייצר התקפים^{20,21,22, 23}. עם זאת, קשה לקבוע אם הארגונים האלה הם תגובות אדפטיבית או אם הם causally הקשורים epileptogenesis או להתקף בראשית והפצת¹².

לכן, לוקליזציה של המוקד האפילפטי והחלת תרופות נוגדות אפילפסיה באופן מקומי הם אחד האתגרים העיקריים במחקר אפילפסיה עכשווית. מספר ניסויים באמצעות מודלים של בעלי חיים של אפילפסיה וכמה מחקרים קליניים שמטרתם למצוא את התחלתה של האירועים תפיסה ולהגדיר את המנגנונים הבסיסיים במוח^24,25,26,27. למטרה זו, פיתחנו פרוטוקול ניסיוני חדש באמצעות המודל המושרה 4ap אפילפסיה^28,29,30,31 ב הכנה לעכבר חריפה, אשר מאפשר הוספה מדויקת של שלושה התקנים לאזור נתון של ההיפוקמפוס, שבו פעילות הרשת ב vivo מניפולציות באופן מאוד מקומי. הזרקת 4AP מקומי על ידי מיקרופיפטה זכוכית מסייעת לגרום למחלת אפילפסיה במקום המותאם לשפות אחרות בהיפוקמפוס, בעוד בעזרת הרומן המבוסס על פולימר מבוססי לבדוק את השליטה בפעילות התפיסה מושגת בו על ידי הקלטת את האדם העצבי פעילות חשמלית עם אתרי ההקלטה של המכשיר. היפוקמאל פעילות השדה המקומי הוא גם מפוקח עם בדיקה סיליקון רב ערוצית באופן ספציפי לשכבה בקליפת ובהיפוקמפוס בו.

הבדיקות האחרונות Μi Fip פועלות באמצעות שדה חשמלי שהוחל על מנת לדחוף תרופות מוחסות המאוחסנות בערוץ microflu, לאורך קרום חילופי יונים (IEM) והחוצה אל הרקמה שמסביב (איור 1). ה-IEM מסיע סוג אחד בלבד של יון (קטיון או אניאון), ולכן פועל להגביל את הדיפוזיה הן במצב "off" והן בהובלה של מינים הטעונים באופן מקיף מהרקמה הסובבת לתוך המכשיר. השדה החשמלי נוצר על פי דרישה על ידי החלת מתח קטן (< 1 V) בין האלקטרודה המקור שהוא פנימי לערוץ microflu, האלקטרודה היעד שהוא חיצוני למכשיר (במקרה זה, בורג הראש על המודל של בעל חיים). קצב מסירת הסמים פרופורציונלי למתח המוחל ולזרם הנמדד בין אלקטרודות המקור והיעד. היכולת המדויקת של מסירת הסמים היא אחד היתרונות העיקריים של ה-μFIP. יתרון קריטי נוסף, לעומת פלואידיג או מערכות לאספקת סמים מבוססי לחץ, הוא כי ב-Μi יש רק להגדיל את הלחץ הזניח בשקע משלוח הסמים כמו סמים מועברים ברחבי IEM ללא פתרון הספק שלהם.

יש כמות קטנה של דליפה פסיבית של נגבה כאשר ה-Μpave הוא "off", אבל זה נמצא לא להשפיע SLEs. ה-Μi הם מותאמים אישית בעקבות שיטות מיקרו-ייצור קונבנציונליות שדווחו קודם לכן ב^-31.

מאז אחת הדרכים של מניעת התקפים חוזרים הוא המצור של הרשת פולט בתחילת מאוד או אפילו לפני אירוע התפיסה הראשונה, השיטה המוצגת לאספקת נוירוטרנסמיטר מעכבות נגבה לתוך המוקד אפילפטי יש הרבה פוטנציאל תרפויטי לשליטה בחולים עם אפילפסיה מוקד. מכיוון שנגבה היא מצע אנדודוגני, הוא מותיר תכונות נוירואליות פנימיות ללא שינוי בריכוזים פיזיולוגיים. היישום המקומי של רמות נמוכות של נגבה רק ישפיע על התאים הקשובים באופן טבעי לעיכוב, ויהיה רק לגרום לתופעות דומות לעיכוב פיזיולוגי, בניגוד לגירוי מוחי עמוק (DBS), שיש לו פעולות בלתי מדויקות על ידי עירור כל התאים של הרשת העצבית בסביבתו, וגרמה לתגובה מעורבת הכרוכה בעירור ובעיכוב. לסיכום, השיטה המוצעת מספקת גישה ספציפית יותר לתפיסת שליטה מאשר DBS.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים נערכו על פי ההנחיות האתיות של מכון הנוירומדעי הSystèmes ואושרו על-ידי ועדות האתיקה המקומית ומשרדי וטרינרי.

הערה: 17 OF1 עכברים זכרים בוגרים שימשו לניסויים. עכברים היו מוהים ל 12 שעות מחזור אור/כהה עם מזון ומים זמין מודעה libitum.

1. הרדמה

1. הכנס intraperitoneally תערובת של קטמין ו xylazine (100 מ"ג/ק"ג משקל הגוף 10 מ"ג/ק"ג משקל הגוף, בהתאמה) כדי ללגרד את החיה.
2. בדוק את רמת ההרדמה על ידי התבוננות בקצב הנשימה והקצפה, על ידי בדיקת תגובת העכבר לכאב.
   הערה: כאשר נשימתו של העכבר הופכת לרגילה, לא ניתן להבחין בשום הקצפה, והחיה אינה מגיבה לפינובי הזנב, ההרדמה עמוקה מספיק כדי להמשיך.
   1. מניחים את החיה על כרית חימום חשמלית לתכנות. מכסים את הטמפרטורה פי הטבעת עם מוצר המבוסס על ג'לי הנפט (ראה טבלת חומרים) ומניחים אותו בעדינות לתוך הרקטום (1 – 2 ס מ עמוק) של העכבר כדי לפקח על טמפרטורת הגוף שלו. שמרו על טמפרטורת גוף בין 36.5 ל-37.5 ° c במהלך הליכי הניתוח וההקלטות הנסיוניות.
   2. נטר את רמת ההרדמה על ידי בדיקת הרפלקסים של העכבר, תנועות הקצעות ותדירות הנשימה שלו. לקיחת בחשבון את רמת ההרדמה שנרשמה לפחות כל 30 דקות, לתת מנה קטנה של קוקטייל קטמין-xylazine (20 – 50 μL, אותו הריכוז בשימוש כמו קודם) הפנימי.

2. ניתוח/פתיחת גולגולת

1. תקן את ראש העכבר במסגרת סטריאוטקלית. באמצעות מחט של 30 גרם, להזריק ropi, כאבים המקומי מקומי (5 μL, 7.5 mg/mL, ראה טבלת חומרים) תת-עורי באתר החתך המתוכנן. אפשר 5 דקות כדי שהוא ייכנסו לתוקף.
2. הפוך את קו האמצע לחתוך ישר בעור מעל הגולגולת עם אזמל. בעדינות למשוך את העור לעבר הצדדים עם מלקחיים עדינים להדק אותו הצידה עם בולדוג הצבת מלחציים כדי להשאיר את הגולגולת חשוף לעבודה נוספת.
3. נקה את הגולגולת של fascia עם אזמל או כל כלי דומה. במקרה של דימום שטחי, להסיר את הדם עם מטלית כותנה או חתיכות קטנות של מגבת נייר.
4. לקחת פולי (3, 4-ethylenediophene) פוליסטירן סולופאט (PEDOT: PSS)-מצופה בורג הקרקע (גודל:00, קוטר: 0.047 ב, אורך: 1/8 ב, ראה את הטבלה של חומרים) עם חוט מולחם ולחבר אותו עם מחבר אל מגבר headstage.
5. מויסטן את הגולגולת באתר החור הרצוי לקדוח חור במהירות גבוהה באמצעות בסדר, מקדחה עגול סיבית (עם קוטר 0.4 מ"מ) על הגולגולת מעל המוח הקטן עד דורא הוא גלוי. שים את בורג הקרקע לתוך החור ולהרוס אותו עם מברג דיוק עד שהוא מגיע לראש המוח העליון.
   הערה: בורג הראש היה מצופה מטבל עם הפתרון PEDOT: PSS המכיל 1% 3-גליצילולוקסיל) טרימתאוקסיסילאנה (GOPS) לפי משקל ולאחר מכן אפייה ב 140 ° c עבור 90 min. PEDOT: PSS הוא פולימר מצומת עם קיבוליות נפחי כי ידוע להיות ביולוגי. GOPS הוא חוצה מקשר מעורבב עם PEDOT: PSS כדי להגביר את היציבות בתקשורת מימית (איור 2).
6. בעזרת מסגרת סטריאוטקאית, יש למדוד את נקודות הציון הסטריאוטקאיות לאזור המוח הרצוי. לדוגמה, אזור העניין הוא ההיפוקמפוס, anteroposterior (AP)-1.8 מ"מ ו-mediolateral (ML) 1.8 mm מנקודת ברז מבוסס על אטלס המוח עבור עכברים³².
   הערה: אלה נקודות ציון לאונה הימנית (איור 2).
7. דק a בערך 1 עד 2 מילימטר באזור של הגולגולת מעל אזור היעד באמצעות מקדחה שיניים אמין (ראה טבלה של חומרים) להגדיר במהירות מהירה עד רזה, היטב מלוטש, קרום עצם שקוף נשאר.
8. אז, אם עובי של קרום העצם הוא דק מספיק (< 200 μm), לעשות חור קטן עם מלקחיים דקים בעדינות להסיר את השכבה הדק של העצם³³. השתמשו במחט מותאמת אישית העשויה מהקרס כדי להסיר את השכבה הדורה. מזער את הגודל של פתיחת הגולגולת וכריתת המוח כדי למנוע את התפתחותם של האדמות וכלה למזער את הלב ו/או הנשימה של מוחו.
   הערה: הפתיחת הגולגולת חייבת להיות מלאה ב-droplet של תמיסה מלוחים כדי למנוע ייבוש ולאחר מכן למלא בקביעות במהלך הניסוי (איור 2).

3. החדרת בדיקה סיליקון רב-ערוצי

1. השתמש בזרועות סטריאוטקאית בזווית AP קלה (20 °) עבור בדיקה סיליקון להשאיר מקום מספיק למיקום של שני שתלים אחרים ולקבל את ההקלטה ואת אתרי ההזרקה של האלקטרודה, משאבת היונים, ו מיקרופיפטה קרוב ככל האפשר.
   הערה: אלקטרודות, מזרקים, ומשאבות יונים היו מכוסות בטיפה של תמיסת דיאני כתם (1, 1 '-dioctadecyl-3, 3, 3 ', 3 '-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט [dii]), עבור הדמיית פוסט הוק של עקבות השרשה (0.5 mg/ml dii ב diמתיל סולפוקסיד).
2. מניחים את לווין הסיליקון על הזרוע הסטריאוטקאית המצורפת למחזיק מגנטי ומניחים אותה ליד המסגרת הסטריאוטקאית. הגדר את זווית AP (20 °) ולאחר מכן חבר את הגשוש לשלב הקדמי ולבורג הקרקע.
3. הורידו באיטיות את בדיקת הסיליקון לתוך ההיפוקמפוס בעזרת הזרוע הסטריאוטקמית מיקרון-מדויקת או מיקרומניפולציה ממונעת כדי להימנע מתנועות לרוחב (איור 2 ואיור 3).
   1. הפעל את תוכנת ההקלטה והרשומה-עם השלב הראשי, המגבר המחובר, ומחשב-אותות עצביים חשמליים תוך הזזת בדיקת הסיליקון הרב-ערוצית מראש הקליפת המוח עד למיקומה הייעודי (- 1,800 יקרומטר ממשטח קליפת האדמה). הקלט והצג את האות המקומי בשדה הפוטנציאלי (LFP) במהלך החדירה על מסך המחשב.
      הערה: לשלוט על הירידה של החללית כך שהוא נע לאט וברציפות בזמן ההקלטה, כדי לקבל שליטה חזותית טובה יותר עבור חדירה ולהגיע לאזור היעד.
   2. השתמש בפעילות הריפל בשכבת הפירמידה של היווצרות ההיפוקמאל במסגרת ה-LFP המוקלטת כסמן לאזור היעד.
      הערה: הפעילות ריפל גלוי על אחד או שניים ערוצים שכנים של סיליקון רב ערוצי (Si) בדיקה שיש מרחק 100 יקרומטר בין אתרי הקלטה (איור 4).
   3. רשומות LFP להקליט משכבות של קליפת המוח ואת ההיפוקמפוס במקביל דרך התוכנה של מגבר רב-ערוצי (ראה טבלת חומרים) בעזרת הבדיקות הרב רב-ערוצי (איור 4).

4. החדרת הסמל Μi

1. לחבר את הצינורות (לראות את הטבלה של חומרים) אל השקע של μi ו למלא את החללית עם 0.05 M הפתרון של נגבה. להסיר את הצינורות ולסגור את האוויר עם עטיפת הסרט פרפין. חבר הפניות חשמליות ליחידת המדידה של המקור.
2. הכנס את ה-μFIP בעזרת הזרוע הסטריאוטקאית בזווית מדיה שצלעות (20 °). הבדיקה של סי. נותרה בכל התהליך
   הערה: μi fip הוא גמיש מאוד והוא עשוי ליהנות מתמיכת מכחול קטן ונקי כדי לשמור על הסדר עד שהוא מגיע למשטח המוח. לאחר שלב זה, אתה יכול להוריד את Μi בעדינות עם תנועות צירית.
3. הנמך את ה-μfip באיטיות עם תנועות צירית ולעולם אל תיתן לו להתכופף במהלך המסלול עד שהוא מגיע לקואורדינטת הדורזובנגאני (-1,200 יקרומטר ממשטח קליפת המעיים).
   הערה: נסה לשים את שני המכשירים (μfip ו הסיליקון בדיקה) קרוב זה לזה ככל האפשר, בהתחשב במרחק של 300 יקרומטר של השקע מקצה μfip.
   התראה: הימנע מבעיות מכניות בין המכשירים והמחברים שלהם במהלך הכניסה (איור 2b ואיור 3b).

5. הכנת התקנים לצורך תפיסת האינדוקציה

1. לשנות את מחט המתכת של המזרק (10 μL) (ראה טבלת חומרים). הסר את המחט מחזיק את החלק מתכת, למקם ולתקן את המיקרופיפטה (הקוטר החיצוני [OD]: 1.2 מ"מ, קוטר פנימי [ID]: 0.75 מ"מ, בקוטר העצה: 20 – 50 יקרומטר עם ± 0.5 ס מ של הסכין מתחדד של shank, ולאחר מכן להחליף את אלמנט מחזיק המחט
2. מקמו את המזרק ואת הבורוסיליקט הצמוד בזווית של 20 ° (LM) להזרקה של 4AP (50 מ"מ בנוזל שדרתי מלאכותי [ACSF]).
   זהירות: אין להשתמש במחט המתכת של המזרק או במיקרופיפטה עם טיפ גדול יותר מ-50 μm.
3. צייר 500 nL – 1 μL של 50 mM 4AP בעזרת משאבת מיקרוזרקת אוטומטית.

6. החדרת פיפטה זכוכית מוצמד למזרק 4AP הזרקת AP

1. הנמך את מיקרופיפטה הזכוכית המצורפת למזרק למיקום ה-DV המיועד (-1,500 μm) ולאחר מכן הכנס 250 nL של פתרון 4AP (איור 2 ואיור 3). התחל להקליט עם תוכנת ההקלטה. צפה במסך ולחכות ספייק interictal הראשון להופיע.
2. התחילו את משלוח הנגבה מאת Μi באופן מיידי עם הופעתו של ספייק interictal הראשון. לספק את הנגבה על ידי החלת 1 V בין המקור והיעד עבור 100 s ואחריו 1 off, עבור 30 מחזורים. בעזרתו של תוכנת ההקלטה, שיא למינימום של 2 h.
   הערה: המסה הכוללת של הנגבה המועבר היא סביב 1 למול (איור 5).
3. בסוף הניסוי, להסיר בעדינות את הבדיקות שנוספו ואת בורג הקרקע, ולהסיר את החיה מהציוד הסטריאוטקאית. בעלי חיים הורדמים באמצעות מנת יתר של תרופה (i. p. 100mg/ק"ג פנטוברביטל). . המוות אושר ע י הפסקת נשימה ומחזור

7. הערכת מיקום השתלים

1. לאחר המתת החסד של בעל החיים, הדבר הראשון עם 50 mL של תמיסת מלח ולאחר מכן עם 150 ml של פתרון קבע קר הקרח המכיל 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב 0.1 M פוספט מאגר (PB)³⁴.
   זהירות: . וחייבים לטפל בו בזהירות
2. ולאחר מכן להסיר את העור ואת השריר מלמעלה ומהצדדים של הגולגולת. החל מגנום foramen, לעשות חתכים לרוחב בגולגולת לכיוון האוזניים החתך משונן קו, לקחת טיפול גדול לא לפגוע במוח. להסיר בעדינות את הגולגולת עם קוצץ העצם. הסר את המוח, ולאחר מכן גזור בלוק רקמות מאזור העניין (מנקודת ברז, -1 עד 3 מילימטר AP) בעזרת מטריצת מוח (ראה טבלת חומרים).
3. הדבק את בלוק הרקמה על מחזיק הדגימה של מערכת הרטט, לשים את העמדה לתוך זה, ולהגדיר את הרטט כדי 40 יקרומטר עובי באמבט PB להפוך 40 יקרומטר סעיפים ילתית.
4. רוחצים בהרחבה עם 0.1 M PB. בצע את הפרוטוקול היסטולוגית עבור חלבון חומצי glibrillary (GFAP) צביעת³¹.
5. מקטעי הר על שקופיות ולכסות אותם עם מדיום הרכבה המכיל 2-(4-amidinophenyl)-1H-אינדול-6-קרבוקמין (DAPI) (ראה טבלת חומרים).

8. מיקרוסקופיה קונפוקלית

1. מניחים את השקופיות עם סעיפים ילתית מוכתם תחת מטרה 20x של מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. בחר את אזור היעד.
2. לבחור את העירור האופטימלי והפליטה (exc/ems) מסנן סטים עבור צבעים כדלקמן: DAPI = 358/461 nm, DiI = 551/569 nm, ו fluorescein (ראה טבלת חומרים) = 490/525 nm.
   הערה: מאחר שהצביעת משתנה לפי מקטע, יש צורך לקבוע טווח מתאים של עירור מינימלי ומקסימלי של כל מקטע, שהאזורים הצפופים ביותר והצפופים ביותר מראים פליטה.
3. בחר את האזור הפחות צפוף והגדר את עוצמת הלייזר ואת הזיהוי לערכים גבוהים, ולאחר מכן אמת באזורים הצפופים יותר אם ערכים אלה גורמים לרוויית יתר של הפליטה שזוהתה. אם כן, הנמך את הערכים ובדוק אותם מתחת לאזור הפחות צפוף. חזר השלבים הבאים עד להגיע לזיהוי האפשרי הגבוה ביותר ברמות הכתמים הנמוכים וברמות המתאימות והלא רוויות באזורים מוכתמים במיוחד. חזור על תהליך זה עבור כל הצבעים.
4. השתמש בפונקציה לסרוק אריח של המיקרוסקופ עם 512 x 512 פיקסלים לכל אריח כדי לקבל סקירה גדולה של אתרי ההכנסה בדיקה עם רזולוציה נאותה עבור עיבוד הודעה.

תוצאות

באמצעות ההליך המוצג כאן עם מודל האפילפסיה 4AP בעכברים מושערים, השליטה של התקפים אפילפטי ניתן להשיג במוקד האפילפטי. הלוקליזציה המדויק של השתלים (איור 2) עזר להקליט היפוקמאל השדה פוטנציאל מקומי (lfps, איור 4), כדי לגרום להתקפים היפוקמאל קטן ולספק...

Discussion

על ידי פיתוח פרוטוקול ניסיוני חדש במודל העכבר חריפה של אפילפסיה, SLEs יכול להיות נשלט בהצלחה בעזרת הצפק Μi מושתל במוקד האפילפטי. הודות ליכולתה לספק את העבודה עם הדיוק הזמני והמרחב, המושרה 4AP SLEs שלטו בתחילתה של ההתקפים. טיפול במחלת האפילפסיה אפשרי תיאורטית אם השליטה על הפרשות הרשת העצבית מושג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4AP	Sigma	275875
Alexa Fluor 488	Abcam	ab15007
Amplifier	Neuralynx, Montana, USA	Digital Lynx 4SX
Amplifier	Ampliplex	KJE-1001
Atlas Stereotaxique	Allen Atlas	978-0470054086
Borosilica glass pipette	Sutter	BF120-69-15
Brain Matrix	WPI	RBMA-200C
Bone trimmer	FST	16109-14
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Connector	INSTECH	SC20/15
Coton tige	Monoprix	EMD 6107OD
Cover slip	Menzel-Glass	15747592
DiI Stain	Thermo Fisher	D282
DMSO	Sigma	11412-11
Drill	FOREDOM	K1070
Forceps	F.S.T.	11412-11
GABA	Sigma	A2129
GFAP Monoclonal Antibody	Thermofisher	53-9892-80
GOPS	Sigma	440167-100M
Hamilton seringe	Hamilton	80330
Headscrew	Component Supply	TX00-2FH
Heating pad	Harvard apparatus	341446
Injection Pump	WPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
Ketamine	Renaudin	5787419
Magnetic holder	Narishige	GJ-1
Mice	Charles River	612
Motoric manipulator	Scientifica, UK	IVM
Na2HPO4	Sigma	255793
NaH2PO4	Sigma	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
Paper towel	KIMBERLY CLARK	7552000
PB	Sigma	P4417
PEDOT:PSS	CLEVIOS	81076212
PFA	Acros Organic	30525-89-4
Rectal temperature probe	Harvard apparatus	521591
Ropivacaine	KABI	1260216
Saline	Sigma	7982
Scalpel	F.S.T	AUST R195806
Seringue	BD Medical	324826
Serrefine clamp	F.S.T	18050-28	4 is recommended
Silicon probe	NeuroNexus, Michigan, USA	A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703
Stereotoxic frame	Stoelting	51733U
Superfrost Slide	ThermoScientific	J38000AMNZ
Tubing	INSTECH	LS20
Vaseline	Laboratoire Gilbert	3518646126611
Vectashield DAPI	Vector Laboratories, California, USA	H-1200-10
Vibratome, Leica VT1200S	Leica Microsystems	1491200S001
Xylazine	Bayer	4007221032311