Elektrophoretische Lieferung von, in der Aminobutyrische Säure (GABA) in den Epileptischen Focus verhindert die Beschlagnahmungen in Mäusen

Zusammenfassung

Die Herausforderung der Epilepsie-Forschung besteht darin, neuartige Therapien für Patienten zu entwickeln, bei denen die klassische Therapie unzureichend ist. Mit Hilfe eines neuen Protokolls — mit Hilfe eines implantierbaren Arzneimittelliefersystems — sind wir in der Lage, Anfälle bei anästhesierten Mäusen durch die elektrophoretische Lieferung von GABA in den epileptischen Fokus zu steuern.

Zusammenfassung

Epilepsie ist eine Gruppe von neurologischen Störungen, von denen Millionen von Menschen weltweit betroffen sind. Obwohl die Behandlung mit Medikamenten in 70% der Fälle hilfreich ist, beeinträchtigen schwere Nebenwirkungen die Lebensqualität der Patienten. Darüber hinaus ist ein hoher Anteil von epileptischen Patienten medikamentenresistent; In ihrem Fall sind Neurochirurgie oder Neurostimulation notwendig. Das Hauptziel der Epilepsieforschung ist es daher, neue Therapien zu finden, die entweder in der Lage sind, Epilepsie ohne Nebenwirkungen zu heilen oder wiederkehrende Anfälle bei medikamentenresistenten Patienten zu verhindern. Neuroengineering bietet neue Ansätze, indem es neue Strategien und Technologien einsetzt, um bessere Lösungen zu finden, um gefährdete epileptische Patienten zu heilen.

Als Demonstration eines neuartigen Versuchsprotokolls in einem akuten Mausmodell der Epilepsie wird ein direktes in situ elektrophoretisches Arzneimittelliefersystem verwendet. Eine neuronale Sonde, die eine mikrofluidische Ionenpumpe (μFIP) für die On-Demand-Medikamentenlieferung und die gleichzeitige Erfassung der lokalen neuronalen Aktivität enthält, wird implantiert und nachweislich in der Lage sein, die 4-Aminopyridine-induzierte (4AP-induzierte) Anfallsaktivität zu steuern. Event (SLE) Aktivität. Die Konzentration der Aminobutyrsäure (GABA) wird durch die genaue Kontrolle der GABA-Lieferung im physiologischen Bereich gehalten, um eine antiepileptische Wirkung im Anfallsfokus zu erzielen, aber keine überhemmten Rebound-Ausbrüche zu verursachen. Die Methode ermöglicht es sowohl die Erkennung von pathologischer Aktivität als auch von Interventionen, die Beschlagnahmung zu stoppen, indem sie hemmende Neurotransmitter direkt an den epileptischen Fokus mit präziser räumlicher Kontrolle liefert.

Durch die Entwicklung der experimentellen Methode können SLEs in einer sehr lokalisierten Weise induziert werden, die eine Anfallskontrolle durch die präzise abgestimmte GABA-Lieferung beim Anfall ermöglicht.

Einleitung

Epilepsie ist die vierthäufigste neurologische Erkrankung: Etwa ein Prozent der Bevölkerung leidet an Epilepsie, und etwa ein Drittel der Betroffenen hat immer wiederkehrende Anfälle. In den meisten Fällen können Anfälle mit Medikamenten gesteuert werden. Allerdings muss die medikamentöse Behandlung für jeden Patienten individuell festgelegt werden, wo die richtige Dosierung Jahre dauernkann, bis 1^,2gefunden werden. Darüber hinaus hat das meiste Medikament ernste Nebenwirkungen, die die Lebensqualität^{3,4, 5, 6,7reduzieren}. Schließlich sind die Patienten in 30% der Fälle resistent gegen Medikamente, und im Falle eines konstanten Einfallserzeugerlokus kann nur eine widerspenstige Neurochirurgie das Auftreten von Anfällen8 dämpfen. Eine wichtige Initiative in der modernen Epilepsieforschung ist es daher, neue Strategien zu finden, die wiederkehrende Anfälle bei gefährdeten Patienten verhindern können, während gleichzeitig die Notwendigkeit starker Arzneimitteltherapien und invasiver Resistenzoperationen verringert wird.

Epileptische Anfälle treten auf, wenn es ein Ungleichgewicht innerhalb von Erregung und Hemmungskreisen gibt, entweder im gesamten Gehirn (generalisierte Epilepsie) oder in einem lokalisierten Teil des Gehirns (fokale Epilepsie), so dass Neuronen in einer abnormalen Weise entladen 9 ^{, 10 , 11}. Antiepileptische Medikamente können auf zwei verschiedene Arten bei der Anfallsprävention wirken: Entweder die Verringerung der Erregung oder die Verbesserung der Hemmung¹². Konkret können sie entweder die elektrische Aktivität von neuronalen Zellen verändern, indem sie die Ionenkanäle in der Zellmembran 13 beeinflussen, oder sie können auf die chemische Übertragung zwischen Neuronen wirken, indem sie den hemmenden Neurotransmitter GABA oder den Erregungsrichter beeinflussen. Glutamat in den Synapsen^14,15. Bei einigen Medikamenten ist die Wirkungsweise¹⁸unbekannt. Auch haben medikamentöse Behandlungen eine kontinuierliche Wirkung auf die Patienten und können sich nicht an die Prävalenzdynamik von Anfällen anpassen. Im Idealfall würden Medikamente mit spezifischen Wirkmechanismen auf die zugrunde liegenden epileptischen Prozesse wirken. Eine optimale Behandlung würde das Gehirn nicht interictally berühren, sondern sofort handeln, wenn sich ein Anfall entwickelt. Im Gegensatz dazu bedeutet die Medikation in allen Fällen von Epilepsie nun eine systematische Behandlung, die das gesamte Gehirn und den ganzen Körper des Patienten^betrifft.

Epileptische Anfälle können viele Jahre nach der anfänglichen Beleidigung wie Hirntrauma auftreten. Die Zeit zwischen der anfänglichen Beleidigung und dem Auftreten der ersten spontanen Anfälle ist durch erhebliche molekulare und zelluläre Reorganisationen gekennzeichnet, einschließlich neuronaler Todesfälle mit dem Verschwinden neuronaler Netzverbindungen und axonaler Die Neosynaptogenese mit dem Erscheinen neuer Verbindungen^19,20,21. Sobald sich Anfälle wiederholen, neigen ihre Häufigkeit und Schwere dazu, dass sie mehr Hirnregionen mit sich bringen. Es ist wichtig, die Orte des Anfalls (epileptogene Regionen) von den Verbreitungsnetzen zu unterscheiden, da die Regeln der Anfallsgenese und-vermehrung unterschiedlich sein können. Untersuchungen an menschlichem Gewebe und experimentellen Modellen der Epilepsie haben wichtige Daten über die Reorganisation von Schaltkreisen und ihre Fähigkeit, Anfälle zu erzeugen20^{,21, 22, 23}. Es ist jedoch schwierig festzustellen, ob diese Umstrukturierungen adaptive Reaktionen sind oder ob sie kausal mit der Epileptogenese oder der Anfallsgenese und-vermehrung 12 zusammenhängen.

Daher ist die Lokalisierung des epileptischen Schwerpunkts und die Anwendung von antiepileptischen Medikamenten vor Ort eine der größten Herausforderungen in der zeitgenössischen Epilepsie-Forschung. Mehrere Experimente mit Tiermodellen der Epilepsie und einige klinische Studien zielten darauf ab, den Beginn der Anfallsereignisse zu finden und die zugrunde liegendenMechanismen im Gehirn 24^,25,26^{, 27 zu}definieren. Zu diesem Zweck haben wir ein neues Versuchsprotokoll mit dem von der 4P induzierten Epilepsie-Modell^{28,29, 30,31 in}einer akuten Mausvorbereitung entwickelt, das das präzise Einfügen von drei ermöglicht. Geräte in den vorgegebenen Bereich des Hippocampus, wo die Netzwerkaktivität in vivo in einer stark lokalisierten Weise manipuliert wird. Lokalisierte 4AP-Injektion durch eine Glasmikropipette hilft, epileptische SLEs an einem lokalisierten Ort im Hippocampus zu induzieren, während mit Hilfe der neuartigen, auf Polymer basierenden μFIP-Sonde die Kontrolle der Anfallsaktivität gleichzeitig durch die Aufnahme der neuronalen Elektrische Aktivität mit den Aufnahmesorten des Geräts. Die hippocampale Lokalfeldaktivität wird auch mit einer Multichannel-Siliziumsonde auf schichtspezifische Weise im Kortex und im Hippocampus gleichzeitig überwacht.

Die kürzlich erfundenen μFIP-Sonden arbeiten, indem sie ein angewandtes elektrisches Feld nutzen, um geladene Medikamente, die in einem mikrofluidischen Kanal gespeichert sind, über eine Ionenaustauschmembran (IEM) und in das umgebende Gewebe zu schieben (Abbildung 1). Das IEM transportiert selektiv nur eine Art von Ion (Kation oder Anion) und arbeitet so daran, sowohl die passive Diffusion im "Off"-Zustand als auch den Transport von gegensätzlich geladenen Arten aus dem umgebenden Gewebe in das Gerät zu begrenzen. Das elektrische Feld wird bei Bedarf durch die Anwendung einer kleinen Spannung (& lt;1 V) zwischen der Quellelektrode, die innen zum mikrofluidischen Kanal ist, und einer Zielelektrode, die außerhalb des Gerätes ist (in diesem Fall die Kopfschraube am Tiermodell) erzeugt. Die Rate der Arzneimittelzufuhr ist proportional zur angewandten Spannung und dem gemessenen Strom zwischen der Quell-und Zielelektroden. Die genaue Tuningbarkeit der Arzneimittelzustellung ist einer der Hauptvorteile der μFIP. Ein weiterer entscheidender Vorteil im Vergleich zu fluidischen oder druckbasierten Arzneimittelliefersystemen ist, dass es in der μFIP nur einen vernachlässigbaren Druckanstieg am Arzneimittellieferausgang gibt, da Medikamente ohne Trägerlösung über das IEM geliefert werden.

Es gibt eine kleine Menge passiver Epacht von GABA, wenn das μFIP "ausgeschaltet" ist, aber dies wurde gefunden, um SLEs nicht zu bewirken. Die μFIP sind maßgeschneidert nach herkömmlichen Mikrofabrikationsmethoden, die wir zuvorgemeldet haben 31.

Da eine Möglichkeit zur Verhinderung wiederkehrender Anfälle die Blockade von Netzentladungen zu Beginn oder sogar noch vor dem ersten Anfallsereignis ist, hat die vorgestellte Methode zur Lieferung des hemmenden Neurotransmitters GABA in den epileptischen Fokus großen großen Charakter. Heiltisches Potenzial zur Anfallskontrolle bei Patienten mit fokaler Epilepsie. Da GABA ein endogenes Substrat ist, lässt es intrinsische neuronale Eigenschaften in physiologischen Konzentrationen unverändert. Die lokale Anwendung der niedrigen GABA-Konzentrationen wird nur Zellen betreffen, die natürlich auf die Hemmung reagieren, und wird nur ähnliche Effekte wie die physiologische Hemmung verursachen, im Gegensatz zu einer tiefen Hirnstimulation (DBS), die unspezifische Aktionen hat, indem sie alle Zellen stimuliert. Das neuronale Netz in seiner Umgebung, was eine gemischte Reaktion mit Anregung und Hemmung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgeschlagene Methode einen spezifischeren Ansatz zur Beschlagnahmungskontrolle bietet als DBS.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden nach den ethischen Richtlinien des Instituts de Neurosciences des Systèmes durchgeführt und von den örtlichen Ethikkomitees und Veterinärämtern genehmigt.

NOTE: Für die Experimente wurden siebzehn erwachsene männliche OF1-Mäuse eingesetzt . Die Mäuse wurden in einen 12 Stunden hellen/dunklen Zyklus mit Nahrung und Wasser, die ad libitum zur Verfügung stand, verwickelt.

1. Anästhesie

1. Eine Mischung aus Ketamin und Xylazine (100 mg/kg Körpergewicht bzw. 10 mg/kg Körpergewicht), um das Tier zu betäuben, intraperitoneal.
2. Überprüfen Sie den Grad der Anästhesie, indem Sie die Atemfrequenz beobachten und flüstern und indem Sie die Reaktion der Maus auf Schmerzen überprüfen.
   Hinweis: Wenn die Atmung der Maus regelmäßig wird, kein Flüstern beobachtet werden kann und das Tier nicht auf Schwanzstiche reagiert, ist die Anästhesie tief genug, um weiterzumachen.
   1. Legen Sie das Tier auf ein elektrisch programmierbares Heizungspolster. Die rektale Temperatursonde mit einem auf Erdöl basierenden Produkt bedecken (siehe Materialtabelle) und sanft in das Rektum (1 – 2 cm tief) der Maus legen, um die Körpertemperatur zu überwachen. Während der chirurgischen Eingriffe und experimentellen Aufzeichnungen eine Körpertemperatur zwischen 36.5 und 37,5 ° C halten.
   2. Überwachen Sie die Anästhesie-Ebene, indem Sie die Reflexe, die Flüsterbewegungen und die Häufigkeit der Atmung der Maus überprüfen. Unter Berücksichtigung des mindestens alle 30 Minuten aufgezeichneten Anästhesiespiegels eine kleine Dosis eines ketamine-xylazinen Cocktails (20 – 50 μL, die gleiche Konzentration wie bisher) intramuskulär.

2. Surgery/Craniotomie

1. Fixieren Sie den Kopf der Maus in einem stereotaxischen Rahmen. Mit einer 30 G-Nadel wird die lokale Schmerzropivacaine (5 μL, 7,5 mg/mL, siehe Materialtabelle) am geplanten Einschnittort subkutan injiziert. Lassen Sie 5 Minuten für sie wirksam werden.
2. Mit einem Skalpell eine gerade geschnittene Mittellinie in der Haut über dem Schädel herstellen. Ziehen Sie die Haut sanft mit feinen Zangen an den Seiten und klemmen Sie sie mit Bulldog-Serrefine Klemmen beiseite, um den Schädel für die weitere Arbeit freigelegt zu lassen.
3. Reinigen Sie den Schädel der Faszien mit einem Skalpell oder einem ähnlichen Werkzeug. Bei oberflächlichen Blutungen das Blut mit Wattestäbchen oder kleinen Papierhandtüchern entfernen.
4. Nehmen Sie ein Polypoly-3,4-Ethylenedioxythiophen) Polystyrol-Sulfonat (PEDOT: PSS)-beschichtete Bodenschraube (Größe :#00, Durchmesser: 0,47 in, Länge: hält-8 in, siehe Materialtabelle) mit einem gelöteten Draht und verbinden es mit einem Stecker
5. Befeuchten Sie den Schädel an der gewünschten Lochstelle und bohren Sie ein Loch mit hoher Geschwindigkeit mit einem feinen, runden Bohrer (mit einem Durchmesser von 0,4 mm) auf den Schädel über dem Kleinhirn, bis die Dura sichtbar ist. Legen Sie die Bodenschraube in das Loch und schrauben Sie sie mit einem Präzisionsschrauber ein, bis sie die Oberseite des Kleinhirnserreicht.
   NOTE: Die Kopfschraube wurde mit einem PEDOT dippbeschichtet: PSS-Lösung mit 1% 3-Glycidyloxypropyl) Trimethoxysilane (GOPS) mit anschließendem Backen bei 140 ° C für 90 min. PEDOT: PSS ist ein konjugiertes Polymer mit einer Volumenkapazität, das als biokompatibel bekannt ist. GOPS ist ein Cross-Linker, der mit PEDOT: PSS gemischt wird, um die Stabilität in wässrigen Medien zu erhöhen (Abbildung2).
6. Messen Sie mit Hilfe des stereotaxischen Rahmens die stereotaxischen Koordinaten für die gewünschte Hirnregion. Interessant sind zum Beispiel der Hippocampus, Anteroposterior (AP)-1,8 mm und mediolateral (ML) 1,8 mm vom Bregma-Punkt auf Basis des Hirnatlas für Mäuse 32.
   NOTE: Es handelt sich um Koordinaten für die rechte Hemisphäre (Abbildung 2).
7. Dünne ca. 1 bis 2 mm Durchmesser des Schädels über der Zielregion mit einem zuverlässigen Zahnbohrer (siehe Materialtafel), der mit einer schnellen Geschwindigkeit eingestellt ist, bis eine dünne, gut polierte, transparente Knochenmembran erhalten bleibt.
8. Dann, wenn die Dicke der Knochenmembran dünn genug ist (& lt;200 μm), machen Sie ein kleines Loch mit dünnen Zangen und entfernen Sie sanft die dünne Schichtdes Knochens 33. Verwenden Sie eine maßgeschneiderte Hakennadel, um die Dura zu entfernen. Minimieren Sie die Größe der Craniotomie und der Durotomie, um die Entwicklung von Ödemen zu verhindern und um Herz-und Atem-oder Atempulsationen des Gehirns zu minimieren.
   NOTE: Die Kraniotomie muss mit einem Tropfen Salzlösung gefüllt werden, um das Trocknen zu verhindern und dann während des Experiments regelmäßig wieder aufgefüllt werden (Abbildung2).

3. Einleitung der Multichannel-Silizium-Probe

1. Verwenden Sie stereotaxische Arme in einem leichten AP-Winkel (20 °) für die Siliziumsonde, um ausreichend Platz für die Positionierung der beiden anderen Implantate zu lassen und die Aufzeichnungs-und Injektionsstellen der Elektrode, der Ionenpumpe und der Mikropipette so nah wie möglich zu haben.
   NOTE: Elektroden, Spritzen und Ionenpumpen wurden mit einem Tropfen DiI-Fleckenlösung (1, 1 '-Diöztadecyl-3, 3, 3 ', 3 '-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat [DiI]), für die posthoc-Visualisierung der Implantationsspuren (0,5 mg/ml DiI in Dimethylsulfoxid).
2. Legen Sie die Siliziumsonde auf den stereotaxischen Arm, der an einem Magnetträger befestigt ist, und legen Sie sie neben den stereotaxischen Rahmen. Stellen Sie den AP-Winkel (20 °) ein und verbinden Sie die Sonde dann mit der Kopfbühne und der Bodenschraube.
3. Die Siliziumsonde mit Hilfe des mikronengenauen stereotaxischen Arms oder eines motorisierten Mikromanipulators zur Vermeidung seitlicher Bewegungen langsam in den Hippocampus langsam tiefer sinken (Abbildung 2 und Abbildung 3).
   1. Starten Sie die Aufzeichnungssoftware und erfassen Sie — mit der Kopfbühne, dem angeschlossenen Verstärker und einem Computer — elektrische neuronale Signale, während Sie die Multichannel-Siliziumsonde von der Oberseite des Kortex bewegen, bis die gezielte dorsoventrale (DV)-Position erreicht ist (- 1.800 μm von der kortikalen Oberfläche). Nehmen Sie das lokale Feldpotenzial (LFP) während des Eindringens auf dem Computerbildschirm auf und beobachten Sie es.
      NOTE: Kontrollieren Sie den Abstieg der Sonde, so dass sie sich während der Aufnahme langsam und kontinuierlich bewegt, um eine bessere visuelle Kontrolle für die Durchdringung und für das Erreichen der Zielzone zu haben.
   2. Verwenden Sie die Rippelaktivität in der pyramidenförmigen Schicht der Hippocampalbildung im aufgezeichneten LFP als Marker der Zielzone.
      NOTE: Die Rippelaktivität ist auf einem oder zwei benachbarten Kanälen der Multichannel-Siliziumsonde (Si) sichtbar, die einen Abstand von 100 μm zwischen den Aufnahmesorten hat (Abbildung4).
   3. Aufzeichnung von LFP-Signalen aus den Schichten des Cortex und des Hippocampus gleichzeitig über die Software des Multichannel-Verstärkers (siehe Materialtabelle) mit Hilfe der Multichannel-Si-Sonden (Abbildung4).

4. Einfügung von μFIP

1. Schläuche (siehe Materialtabelle) an den Eingang des μFIP anschließen und die Sonde mit 0,05 M GABA-Lösung füllen. Die Rohre entfernen und den Einlass mit Paraffin-Folienverpackung schließen. Die elektrische Leitungen an die Quellmesseinheit anschließen.
2. Legen Sie die μFIP mit Hilfe des stereotaxischen Arms in einem mediolateralen (MP) Winkel (20 °) ein. Die Si-Sonde bleibt während des gesamten Prozesses eingesetzt.
   Hinweis: μFIP ist sehr flexibel und kann von der Unterstützung eines kleinen und sauberen Pinsels profitieren, um ihn gerade zu halten, bis er die Gehirnoberfläche erreicht. Danach kann μFIP mit axialen Bewegungen sanft abgesenkt werden.
3. Senken Sie die μFIP langsam mit axialen Bewegungen und lassen Sie sie während der Flugbahn nie biegen, bis sie die dorsoventrale (DV)-Koordinate (-1.200 μm von der kortikalen Oberfläche) erreicht.
   NOTE: Versuchen Sie, die beiden Geräte (μFIP und Siliziumsonde) so nah wie möglich zu stellen, wenn man den Abstand von 300 μm des Auslaufs von der μFIP-Spitze bedenkt.
   CAUTION: Vermeiden Sie mechanische Probleme zwischen den Geräten und ihren Anschlüssen beim Einlegen (Abbildung 2B und Abbildung 3B).

5. Vorbereitung von Geräten zur Beschlagnahme

1. Ändern Sie die Metallnadel der Spritze (10 μL) (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie das Nadelhalte-Metallteil, platzieren und fixieren Sie die Mikropipette (Außendurchmesser [OD]: 1,2 mm, Innendurchmesser [ID]: 0,75 mm, Spitzdurchmesser: 20 – 50 μm mit ± 0,5 cm Verjüngung des Schaftes), und ersetzen Sie dann das Nadelhalteelement.
2. Positionieren Sie die Spritze und die angehängte Borosilikat-Mikropipette auf einem 20 ° Lateromedial (LM)-Winkel für die Injektion von 4AP (50 mM in künstliche Hirnspinalflüssigkeit [ACSF]).
   CAUTION: Verwenden Sie nicht die Metallnadel der Spritze oder eine Mikropipette mit einer Spitze größer als 50 μm.
3. Mit Hilfe einer automatisierten Mikroinjektionspumpe werden 500 nL–1 μL von 50 mM 4AP gezogen.

6. Einleitung der Glaspfeife, die an eine Syringe für die 4AP-Injektion angeschlossen ist

1. Senken Sie die Glasmikropipette, die an der Spritze befestigt ist, auf die angestrebte DV-Position (-1.500 μm) und spritzen Sie dann 250 nL der 4AP-Lösung (Abbildung 2 und Abbildung 3). Beginnen Sie mit der Aufzeichnung mit der Aufnahmesoftware. Schauen Sie sich den Bildschirm an und warten Sie, bis die erste interictalale Spitze erscheint.
2. Starten Sie die GABA-Lieferung durch μFIP sofort mit dem Erscheinen der ersten Interictalspitze. Liefern Sie GABA, indem Sie 1 V zwischen Quelle und Ziel für 100 s auftragen, gefolgt von 1 s aus, für 30 Zyklen. Mit Hilfe der Aufnahmesoftware für mindestens 2 Stunden aufnehmen.
   NOTE: Die Gesamtmasse des angelieferten GABA beträgt etwa 1 nmol (Abbildung 5).
3. Am Ende des Experiments die eingelegten Sonden und die Bodenschraube sanft entfernen und das Tier aus der stereotaxischen Ausrüstung entfernen. Die Tiere wurden mit einer Überdosis Drogen (i.p.100mg/kg Pentobarbital) euthaniert. Der Tod wurde durch die Einstellung von Atem und Durchblutung bestätigt.

7. Bewertung der Platzierung der Implantate

1. Nach der Euthanisierung des Tieres, partieren Sie es transkaral^,zunächst mit 50 ml Salz und dann mit 150 ml einer eiskalten Fixlösung, die 4% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) 34 enthält.
   CAUTION: PFA ist gefährlich und muss mit Vorsicht behandelt werden.
2. Das Tier verdampfen und dann die Haut und den Muskel von oben und an den Seiten des Schädels entfernen. Ausgehend vom Foramen magnum, machen seitliche Einschnitte im Schädel in Richtung der Ohren und einen sagittalen Mittellinie Schnitt, wobei große Sorgfalt, um nicht das Gehirn zu beschädigen. Den Schädel mit einem Knochenschneider vorsichtig entfernen. Entfernen Sie das Gehirn und schneiden Sie dann mit Hilfe einer Gehirnmatrix einen Gewebeblock aus der Region des Interesses (vom Bregma-Punkt,-1 bis-3 mm AP) ab (siehe Materialtabelle).
3. Kleben Sie den Gewebeblock auf den Probenhalter eines Vibratoms, legen Sie den Ständer hinein, und setzen Sie das Vibratome auf 40 μm Dicke in einem PB-Bad machen 40 μm Koronalabschnitte.
4. Mit 0.1 M PB ausgiebig waschen. Befolgen Sie das histologische Protokoll für das gliolische fibrilläres saure Protein(GFAP), das 31 färbt.
5. Monteile auf Dias und bedecken sie mit einem Montagemder mit2-(4-Amidinophenyl) -1H-indole-6-Carboxamid (DAPI) (siehe Materialtabelle).

8. Konfokale Mikroskopie

1. Legen Sie die Dias mit den gebeizten Koronalen Abschnitten unter ein 20x Ziel eines konfokalen Mikroskops. Wählen Sie die Zielregion aus.
2. Wählen Sie die optimale Anregung und Emission (exc/ems) Filtersets für die Farbstoffe wie folgt: DAPI = 358/461 nm, DiI = 55ein69 nm, und Fluorescein (siehe Materialtabelle) = 490/525 nm.
   NOTE: Da die Färbung je nach Abschnitt variiert, muss für jeden Abschnitt ein angemessenes Spektrum an minimalen und maximalen Erregungs-und Erkennungsmerkungen ermittelt werden, in dem die am wenigsten dichten und dichtesten Regionen Emissionen aufweisen.
3. Wählen Sie die am wenigsten dichte Region aus und setzen Sie die Laserintensität und-erkennung auf hohe Werte, und überprüfen Sie dann in den dichtesten Regionen, ob diese Werte eine Übersättigung der erkannten Emission verursachen. Wenn ja, senken Sie die Werte und überprüfen Sie sie mit der am wenigsten dichten Region. Iterate diese Schritte, bis sie zu einer höchstmöglichen Erkennung bei niedrigen Flecken und richtigen, nicht übersättigten Ebenen in stark befleckten Gebieten kommen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Farbstoffe.
4. Nutzen Sie die Fliesenscan-Funktion des Mikroskops mit 512 x 512 Pixeln pro Fliese, um einen großen Überblick über die Sondeneinbaustellen mit einer angemessenen Auflösung für die Post-hoc-Verarbeitung zu erhalten.

Ergebnisse

Mit dem hier vorgestellten Verfahren mit einem 4AP-Epilepsie-Modell bei anästhesierten Mäusen kann die Kontrolle von epileptischen Anfällen im epileptischen Fokus erreicht werden. Die genaue Lokalisierung der Implantate (Abbildung 2) half, hippocampale lokale Feldpotenziale (LFPs, Abbildung 4) zu erfassen, kleine Hippocampal-Anfälle zu induzieren und GABA bei der Anfallszeit zu liefern. Die Lokalisierung der Implantate wurde ...

Diskussion

Durch die Entwicklung eines neuen Versuchsprotokolls in einem akuten Mausmodell der Epilepsie konnten SLEs mit Hilfe eines in den epileptischen Fokus implantierten μFIP erfolgreich gesteuert werden. Dank seiner Fähigkeit, GABA zeitnah und räumlich präzise zu liefern, wurden 4P-induzierte SLEs zu Beginn der Beschlagnahmungen gesteuert. Die Behandlung von Epilepsie ist theoretisch möglich, wenn die Kontrolle der neuronalen Netzentladungen am Ort des Anfallstarts erreicht wird. Das vorgestellte Protokoll erwies sich al...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4AP	Sigma	275875
Alexa Fluor 488	Abcam	ab15007
Amplifier	Neuralynx, Montana, USA	Digital Lynx 4SX
Amplifier	Ampliplex	KJE-1001
Atlas Stereotaxique	Allen Atlas	978-0470054086
Borosilica glass pipette	Sutter	BF120-69-15
Brain Matrix	WPI	RBMA-200C
Bone trimmer	FST	16109-14
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Connector	INSTECH	SC20/15
Coton tige	Monoprix	EMD 6107OD
Cover slip	Menzel-Glass	15747592
DiI Stain	Thermo Fisher	D282
DMSO	Sigma	11412-11
Drill	FOREDOM	K1070
Forceps	F.S.T.	11412-11
GABA	Sigma	A2129
GFAP Monoclonal Antibody	Thermofisher	53-9892-80
GOPS	Sigma	440167-100M
Hamilton seringe	Hamilton	80330
Headscrew	Component Supply	TX00-2FH
Heating pad	Harvard apparatus	341446
Injection Pump	WPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
Ketamine	Renaudin	5787419
Magnetic holder	Narishige	GJ-1
Mice	Charles River	612
Motoric manipulator	Scientifica, UK	IVM
Na2HPO4	Sigma	255793
NaH2PO4	Sigma	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
Paper towel	KIMBERLY CLARK	7552000
PB	Sigma	P4417
PEDOT:PSS	CLEVIOS	81076212
PFA	Acros Organic	30525-89-4
Rectal temperature probe	Harvard apparatus	521591
Ropivacaine	KABI	1260216
Saline	Sigma	7982
Scalpel	F.S.T	AUST R195806
Seringue	BD Medical	324826
Serrefine clamp	F.S.T	18050-28	4 is recommended
Silicon probe	NeuroNexus, Michigan, USA	A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703
Stereotoxic frame	Stoelting	51733U
Superfrost Slide	ThermoScientific	J38000AMNZ
Tubing	INSTECH	LS20
Vaseline	Laboratoire Gilbert	3518646126611
Vectashield DAPI	Vector Laboratories, California, USA	H-1200-10
Vibratome, Leica VT1200S	Leica Microsystems	1491200S001
Xylazine	Bayer	4007221032311