A entrega electrophoretic do ácido γ-aminobutyric (GABA) no foco epileptic impede apreensões nos ratos

Resumo

O desafio da pesquisa da epilepsia é desenvolver tratamentos novos para os pacientes onde a terapia clássica é inadequada. Usando um protocolo novo — com a ajuda de um sistema implantáveis da entrega da droga — nós podemos controlar apreensões em ratos anestesiados pela entrega electrophoretic de GABA no foco epileptic.

Resumo

A epilepsia é um grupo de distúrbios neurológicos que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Embora o tratamento com medicação seja útil em 70% dos casos, efeitos colaterais graves afetam a qualidade de vida dos pacientes. Além disso, uma porcentagem elevada de pacientes epileptic é droga-resistente; em seu caso, a neurocirurgia ou a neuroestimulação são necessárias. Conseqüentemente, o objetivo principal da pesquisa da epilepsia é descobrir as terapias novas que são ou capazes de curar a epilepsia sem efeitos secundários ou de impedir apreensões periódicas em pacientes droga-resistentes. A Neuroengenharia fornece novas abordagens usando estratégias e tecnologias inovadoras para encontrar melhores soluções para curar pacientes epilépticos em risco.

Como uma demonstração de um protocolo experimental novo em um modelo agudo do rato da epilepsia, um sistema electrophoretic direto in situ da entrega da droga é usado. A saber, uma sonda neural incorporando uma bomba de íon microfluídico (μFIP) para a entrega de medicamentos demanda e gravação simultânea de atividade neural local é implantada e demonstrou ser capaz de controlar a convulsão induzida por 4-aminopyridina (induzida por 4AP) como atividade de evento (SLE). A concentração do ácido γ-aminobutírico (GABA) é mantida na escala physiological pelo controle preciso da entrega de GABA para alcangar um efeito antiepiléptico no foco da apreensão mas para não causar explosões overinibição-induzidas da repercussão. O método permite a deteção da atividade patológica e da intervenção parar apreensões entregando neurotransmissores inibitórios diretamente ao foco epileptic com controle armazenamento preciso.

Em conseqüência dos desenvolvimentos ao método experimental, os SLEs podem ser induzidos em uma maneira altamente localizada que permita o controle da apreensão pela entrega precisamente ajustada de GABA no início da apreensão.

Introdução

A epilepsia é a quarta desordem neurológica mais comum: cerca de 1% da população sofre de epilepsia, e cerca de um terço dos afetados têm convulsões recorrentes. Na maioria dos casos, as convulsões podem ser controladas com medicação. No entanto, o tratamento medicamentoso precisa ser ajustado para cada paciente individualmente, onde a dosagem adequada pode levar anos para encontrar^1,2. Adicionalmente, a maior parte da medicação tem efeitos colaterais graves que reduzem a qualidade de vida^3,4,5,6,7. Finalmente, em 30% dos casos os pacientes são resistentes à medicação, e no caso de um locus gerador de convulsão único constante, apenas a neurocirurgia resectiva pode atenuar a ocorrência de convulsões⁸. Conseqüentemente, uma iniciativa principal na pesquisa moderna da epilepsia é descobrir as estratégias novas que podem impedir apreensões periódicas nos pacientes em risco, ao reduzir a necessidade de terapias fortes da droga e de cirurgias resective invasoras.

As apreensões epilépticas ocorrem quando há um desequilíbrio dentro dos circuitos excitatórios e inibitórios durante todo o cérebro (epilepsia generalizada) ou em uma parte localizada do cérebro (epilepsia focal), tais que os neurônios corriam em uma forma anormal^{9 , 10} de ^{, 11}. as Drogas antiepilépticas podem atuar de duas maneiras diferentes na prevenção da apreensão: diminuindo a excitação ou aumentando a inibição¹². Especificamente, eles podem modificar a atividade elétrica das células neuronais, afetando os canais iônicos na membrana celular¹³ ou agir sobre a transmissão química entre os neurônios, afetando o NEUROTRANSMISSOR inibidor GABA ou o excitatório glutamato nas sinapses^14,15. Para alguns medicamentos, o modo de ação é desconhecido¹⁸. Além disso, os tratamentos medicamentoso têm um efeito contínuo sobre os pacientes e não podem se adaptar à dinâmica de prevalência de crises convulsivas. Idealmente, drogas com mecanismos específicos de ação atuariam nos processos epilépticos subjacentes. Um tratamento óptimo não tocaria o interictalmente do cérebro mas actuaria imediatamente quando uma apreensão começa se tornar. Em contraste com isso, em todos os casos de epilepsia, a medicação agora significa um tratamento sistemático, afetando todo o cérebro e todo o corpo do paciente⁹.

As apreensões epilépticas podem aparecer muitos anos após o insulto inicial tal como o traumatismo de cérebro. O período entre o insulto inicial e a ocorrência das primeiras apreensões espontâneas é caracterizado por reorganizações moleculars e celulares consideráveis, incluindo a morte neuronal com o desaparecimento de conexões de rede neuronal e axonal sprouting/neosynaptogenesis com a aparência de conexões novas^19,20,21. Uma vez que as apreensões se tornam recorrentes, sua frequência e gravidade tendem a aumentar, envolvendo mais regiões cerebrais. É importante distinguir os locais do início da apreensão (regiões epileptogenic) das redes da propagação, porque as réguas da gênese e da propagação da apreensão podem diferir. Pesquisas realizadas em tecidos humanos e modelos experimentais de epilepsia forneceram dados importantes sobre a reorganização dos circuitos e sua capacidade de gerar convulsões^{20,21,22, 23}. no entanto, é difícil determinar se essas reorganizações são respostas adaptativas ou se elas são causalmente relacionadas à epileptogênese ou à gênese da convulsão e à propagação¹².

Portanto, localizando o foco epiléptico e aplicando drogas antiepilépticas localmente são um dos principais desafios na pesquisa contemporânea de epilepsia. Vários experimentos utilizando modelos animais de epilepsia e alguns estudos clínicos objetivam encontrar o início dos eventos convulsivos e definir os mecanismos subjacentes no cérebro^24,25,26,27. Para tanto, desenvolvemos um novo protocolo experimental utilizando o modelo de epilepsia induzido pelo 4ap²⁸,^29,30,31 em uma preparação aguda de camundongo, o que permite a inserção precisa de três dispositivos na área dada do hipocampo, onde a atividade de rede in vivo é manipulada de forma altamente localizada. A injeção 4AP localizada por uma micropipeta de vidro ajuda a induzir SLEs epileptic em um ponto localizado no hipocampo, quando com a ajuda da ponta de prova polímero-baseada nova do μFIP o controle da atividade da apreensão é conseguido simultaneamente gravando o neuronal atividade elétrica com os locais de gravação do dispositivo. A atividade de campo local de hippocampal é monitorada igualmente com uma ponta de prova multicanal do silicone em uma maneira camada-específica no córtice e no hipocampo simultaneamente.

As pontas de prova recentemente inventadas do μfip trabalham usando um campo elétrico aplicado para empurrar as drogas carregadas armazenadas em um canal microfluídicos através de uma membrana da troca iónica (IEM) e para fora ao tecido circunvizinho (Figura 1). O IEM transporta seletivamente somente um tipo de íon (cátion ou Anion) e, assim, trabalha para limitar a difusão passiva no estado "off" e o transporte de espécies oposta carregadas do tecido circunvizinho no dispositivo. O campo elétrico é criado demanda aplicando uma pequena voltagem (< 1 V) entre o eletrodo de origem que é interno ao canal microfluídico e um eletrodo alvo que é externo ao dispositivo (neste caso, o parafuso de cabeça no modelo animal). A taxa de entrega de fármacos é proporcional à tensão aplicada e à corrente medida entre os eletrodos de origem e alvo. A tunabilidade precisa da entrega de fármacos é uma das principais vantagens do μFIP. Outra vantagem crítica, em comparação com os sistemas de entrega de drogas fluídico ou à base de pressão, é que no μFIP há apenas um aumento de pressão insignificante na tomada de entrega de medicamentos, pois as drogas são entregues em todo o IEM sem sua solução transportadora.

Há uma pequena quantidade de vazamento passivo de GABA quando o μFIP é "desligado", mas isso foi encontrado para não efeito SLEs. O μFIP é feito medida seguindo métodos convencionais da microfabricação que nós relatamos previamente³¹.

Desde que uma maneira de impedir apreensões periódicas é o bloqueio de descargas da rede no início ou mesmo antes do primeiro evento da apreensão, o método apresentado para entregar o neurotransmissor inibidor GABA no foco epileptic tem grande potencial terapêutico para o controle da apreensão nos pacientes com epilepsia focal. Como o GABA é um substrato endógeno, ele deixa Propriedades neuronais intrínsecas inalteradas em concentrações fisiológicas. A aplicação local de baixos níveis de GABA só afetará as células naturalmente sensíveis à inibição, e só vai causar efeitos semelhantes à inibição fisiológica, ao contrário da estimulação cerebral profunda (DBS), que tem ações inespecíficas, estimulando todas as células da rede neuronal em seu ambiente, causando uma resposta misturada que envolve a excitação e a inibição. Em conclusão, o método proposto fornece uma abordagem mais específica para o controle de crises do que o DBS.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes éticas do Institut de NEUROSCIENCES des Systèmes e aprovados pelos comitês de ética e escritórios veterinários locais.

Nota: Dezessete machos adultos OF1 camundongos foram utilizados para os experimentos. Camundongos foram arrastada para um ciclo de luz/escuro 12 h com alimentos e água disponível ad libitum.

1. anestesia

1. Injete intraperitonealmente uma mistura de cetamina e xilazina (100 mg/kg de peso corporal e 10 mg/kg de peso corporal, respetivamente) para anestesiizar o animal.
2. Verifique o nível de anestesia observando a frequência respiratória e mexendo e verificando a resposta do mouse à dor.
   Nota: quando a respiração do rato se torna regular, nenhum mexendo pode ser observado, e o animal não reage aos pinches da cauda, a anestesia é profundamente bastante para continuar.
   1. Coloque o animal numa almofada de aquecimento programável eletricamente. Cubra a sonda de temperatura retal com um produto à base de geléia de petróleo (ver tabela de materiais) e coloque-o suavemente no reto (1 – 2 cm de profundidade) do mouse para monitorar sua temperatura corporal. Manter uma temperatura corporal entre 36,5 e 37,5 ° c durante os procedimentos cirúrgicos e gravações experimentais.
   2. Monitore o nível de anestesia, verificando os reflexos do mouse, movimentos Whisker, e sua frequência de respiração. Tendo em conta o nível de anestesia registrada pelo menos a cada 30 min, dar uma pequena dose de um coquetel de cetamina-xilazina (20 – 50 μL, a mesma concentração usada como antes) por via intramuscular.

2. cirurgia/craniotomia

1. Fixe a cabeça do rato num quadro estereotódico. Usando uma agulha de 30 G, injete a ropivacaína analgésica local (5 μL, 7,5 mg/mL, ver tabela de materiais) por via subcutânea no local da incisão planejada. Aguarde 5 minutos para que ele tenha efeito.
2. Faça uma linha média de corte reto na pele acima do crânio com um bisturi. Puxe delicadamente a pele para os lados com fórceps fino e prenda-a de lado com os grampos do Hermostaticas do buldogue para deixar o crânio expor para um trabalho mais adicional.
3. Limpe o crânio da fáscia com um bisturi ou qualquer ferramenta similar. Em caso de sangramento superficial, retire o sangue com cotonetes de algodão ou pequenos pedaços de papel toalha.
4. Tome um poli (3,4-ethylenedioxythiophene) o poliestireno sulfonato (pedot: PSS)-parafuso à terra revestido (tamanho: #00, diâmetro: 0, 47 dentro, comprimento: 1/8 dentro, veja a tabela de materiais) com um fio soldado e conecte-o com um conector ao headstage do amplificador.
5. Umedecer o crânio no local de furo desejado e perfurar um furo em alta velocidade usando uma broca fina, redonda (com um diâmetro de 0,4 milímetros) no crânio acima do cerebelo até que a dura seja visível. Põr o parafuso à terra no furo e parafuse-o dentro com uma chave de fenda da precisão até que alcangue a parte superior do cerebelo.
   Nota: O parafuso de cabeça foi revestido com uma solução de PEDOT: PSS contendo 1% 3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GOPS) por peso seguido de cozimento a 140 ° c para 90 min. PEDOT: PSS é um polímero conjugado com uma capacitância volumétrica que é conhecido por ser biocompatível. GOPS é um cross-linker misturado com PEDOT: PSS para aumentar a estabilidade em meios aquosos (Figura 2).
6. Com a ajuda do frame Stereotaxic, Meça as coordenadas Stereotaxic para a região desejada do cérebro. Por exemplo, a região de interesse é o hipocampo, anteroposterior (AP)-1,8 mm e mediolateral (ML) 1,8 mm do ponto de Bregma baseado no Atlas cerebral para camundongos³².
   Nota: Estas são coordenadas para o hemisfério direito (Figura 2).
7. Diluir uma área de aproximadamente 1 a 2 mm de diâmetro do crânio acima da região alvo usando uma broca odontológica confiável (ver tabela de materiais) ajustada a uma velocidade rápida até que uma membrana óssea fina, bem polida e transparente permaneça.
8. Então, se a espessura da membrana óssea for suficientemente fina (< 200 μm), faça um pequeno furo com pinça fina e remova suavemente a camada fina do osso³³. Use agulha gancho-derrubado feito-à-medida para remover o dura. Minimize o tamanho da craniotomia e da durotomia para evitar o desenvolvimento de edemas e para minimizar pulsações cardíacas e/ou respiratórias do cérebro.
   Nota: A craniotomia deve ser preenchida com uma gota de solução salina para evitar a secagem e, em seguida, reabastada regularmente durante o experimento (Figura 2).

3. inserção da sonda multicanais de silício

1. Use os braços Stereotaxic em um ângulo ligeiro do AP (20 °) para que a ponta de prova do silicone deixe o espaço amplo para o posicionamento dos outros dois implantes e para ter a gravação e os locais da injeção do elétrodo, da bomba de íon, e da micropipeta tão perto como possível.
   Nota: Eletrodos, seringas e bombas de íons foram cobertos com uma gota de solução de mancha DiI (1, 1 '-Dioctadecyl-3,3,3 ',3 '-perclorato de tetramedilindocarbocyanina [DiI]), para a visualização post hoc dos traços de implante (0,5 mg/ml DiI em dimetil sulfóxido).
2. Coloc a ponta de prova do silicone no braço Stereotaxic Unido a um suporte magnético e coloc o ao lado do frame Stereotaxic. Ajuste o ângulo AP (20 °), e conecte então a ponta de prova ao headstage e ao parafuso à terra.
3. Abaixe lentamente a sonda de silício no hipocampo com a ajuda do braço estereotódico mícron-preciso ou de um micromanipulador motorizado para evitar movimentos laterais (Figura 2 e Figura 3).
   1. Inicie o software de gravação e registre — com o headstage, o amplificador conectado e um computador — sinais neuronais elétricos enquanto move a sonda de silício multicanal do topo do córtex até que a posição dorsoventral (DV) direcionada seja atingida (- 1.800 μm da superfície cortical). Grave e assista ao sinal de potencial de campo local (LFP) durante a penetração na tela do computador.
      Nota: Controlar a descida da sonda de modo que ele está se movendo lentamente e continuamente durante a gravação, para ter um melhor controle visual para a penetração e para atingir a zona-alvo.
   2. Use a atividade de ondulação na camada piramidal da formação do hipocampal no LFP gravado como um marcador da zona alvo.
      Nota: A atividade de ondulação é visível em um ou dois canais vizinhos da sonda multicanais de silício (si) com uma distância de 100 μm entre os locais de gravação (Figura 4).
   3. Grave sinais de LFP das camadas do córtex e do hipocampo simultaneamente através do software do amplificador multicanal (ver tabela de materiais) com a ajuda das sondas de si multicanal (Figura 4).

4. inserção de μFIP

1. Conecte os tubos (veja a tabela de materiais) à entrada do μFIP e encha a ponta de prova com a solução de 0, 5 M GABA. Retire os tubos e feche a entrada com a embalagem de película de parafina. Ligue os cabos eléctricos à unidade de medição de origem.
2. Insira o μFIP com a ajuda do braço estereotaxico em um ângulo mediolateral (MP) (20 °). A sonda si permanece inserida durante todo o processo.
   Nota: μfip é muito flexível e pode beneficiar da sustentação de um pincel pequeno e limpo para mantê-lo reto até que alcangue a superfície do cérebro. Após essa etapa, μFIP pode ser abaixado suavemente com movimentos axiais.
3. Abaixe o μFIP lentamente com movimentos axiais e nunca deixe dobrar durante a trajetória até atingir a coordenada dorsoventral (DV) (-1.200 μm da superfície cortical).
   Nota: Tente colocar os dois dispositivos (μFIP e sonda de silício) o mais próximo possível, considerando a distância de 300 μm da saída da ponta μFIP.
   Cuidado: Evite quaisquer problemas mecânicos entre os dispositivos e seus conectores durante a inserção (Figura 2b e Figura 3B).

5. preparação de dispositivos para indução de apreensão

1. Mude a agulha metálica da seringa (10 μL) (ver tabela de materiais). Retire a parte metálica da agulha, coloque e fixe a micropipeta (diâmetro exterior [OD]: 1,2 mm, diâmetro interno [ID]: 0,75 mm, diâmetro da ponta: 20 – 50 μm com ± 0,5 cm de afilamento da haste) e, em seguida, substitua o elemento de fixação da agulha.
2. Posicione a seringa e a micropipeta de borosilicato anexada em um ângulo de 20 ° deslocamentos (LM) para a injeção de 4ap (50 mm em líquido cefalorraquidiano artificial [ACSF]).
   Atenção: Não utilize a agulha metálica da seringa ou uma micropipeta com uma ponta maior que 50 μm.
3. Desenhe 500 nL – 1 μL de 50 mM 4AP com a ajuda de uma bomba de microinjecção automatizada.

6. inserção da pipeta de vidro unida a uma seringa para a injeção 4AP

1. Abaixe a micropipeta de vidro anexada à seringa para a posição DV direcionada (-1.500 μm) e, em seguida, injete 250 nL da solução 4AP (Figura 2 e Figura 3). Inicie a gravação com o software de gravação. Assista à tela e aguarde até que o primeiro pico Interictal apareça.
2. Inicie a entrega de GABA por μFIP imediatamente com a aparência do primeiro ponto Interictal. Forneça o GABA aplicando 1 V entre a fonte e o alvo para 100 s seguidos por 1 s fora, por 30 ciclos. Com a ajuda do software de gravação, recorde de um mínimo de 2 h.
   Nota: A massa total do GABA entregue é de cerca de 1 nmol (Figura 5).
3. No final do experimento, retire suavemente as sondas inseridas e o parafuso de aterramento, e retire o animal do equipamento estereotódico. Os animais foram eutanasiados usando uma overdose de drogas (i. p. 100mg/kg pentobarbital). A morte foi confirmada pela cessação da respiração e da circulação.

7. avaliação da colocação dos implantes

1. Após a eutanização do animal, perfuse-o transcardialmente, primeiro com 50 mL de soro fisiológico e, em seguida, com 150 mL de uma solução fixativa gelada contendo 4% de paraformaldeído (PFA) em tampão fosfato de 0,1 M (PB)³⁴.
   Atenção: O PFA é perigoso e deve ser manuseado com cuidado.
2. Decapitar o animal, e depois remover a pele e o músculo do topo e dos lados do crânio. Partindo do forame Magnum, faça incisões laterais no crânio em direção às orelhas e uma incisão sagital da linha média, tomando muito cuidado para não danificar o cérebro. Retire suavemente o crânio com um aparador de ossos. Retire o cérebro e, em seguida, corte um bloco de tecido da região de interesse (a partir do ponto Bregma,-1 a-3 mm AP) com a ajuda de uma matriz cerebral (ver tabela de materiais).
3. Cole o bloco do tecido ao suporte do espécime de um do, põr o carrinho nele, e ajuste o do à espessura de 40 μm em um banho do PB faz seções do coronal de 40 μm.
4. Lave extensivamente com 0,1 M PB. Siga o protocolo histológico para a coloração ácida de glial fibrilary (GFAP) que mancha³¹.
5. Monte seções em lâminas e cubra-as com um meio de montagem contendo 2-(4-amidinofenil)-1H-indole-6-carboxamidina (DAPI) (ver tabela de materiais).

8. microscopia confocal

1. Coloc as corrediças com as seções coronais manchadas um objetivo 20x de um microscópio confocal. Selecione a região de destino.
2. Escolha os conjuntos de filtros de excitação e emissão (exc/EMS) ideais para os corantes da seguinte forma: DAPI = 358/461 nm, DiI = 551/569 nm e fluoresceina (ver tabela de materiais) = 490/525 nm.
   Nota: Desde que a mancha varia por a seção, uma escala apropriada da excitação e da deteção mínimas e máximas precisa de ser determinada para cada seção, onde as regiões menos densas e as mais densas ambos mostram a emissão.
3. Escolha a região menos densa e ajuste a intensidade do laser e a deteção aos valores elevados, e verifique então nas regiões as mais mais densas se estes valores causam o supersaturação da emissão detectada. Em caso afirmativo, diminua os valores e verifique-os novamente com a região menos densa. Iterar essas etapas até chegar à detecção mais alta possível em níveis de coloração baixos e níveis adequados, não saturados em áreas altamente manchadas. Repita este processo para todos os corantes.
4. Use a função da varredura da telha do microscópio com 512 x 512 pixéis por a telha para obter uma grande vista geral dos locais da inserção da ponta de prova com uma definição adequada para o processamento post hoc.

Resultados

Usando o procedimento apresentado aqui com um modelo da epilepsia 4AP em ratos anestesiados, o controle de apreensões epileptic pode ser conseguido no foco epileptic. A localização precisa dos implantes (Figura 2) ajudou a registrar potenciais de campo hipocampal local (lfps, Figura 4), para induzir pequenas convulsões hipocampais e para entregar GABA no início da apreensão. A localização dos implantes foi verificada apó...

Discussão

Desenvolvendo um protocolo experimental novo em um modelo agudo do rato da epilepsia, SLEs poderia com sucesso ser controlado com a ajuda de um μFIP implantado no foco epileptic. Os agradecimentos a sua capacidade para entregar GABA com precisão temporal e espacial, SLEs 4AP-induzidos foram controlados no início das apreensões. O tratamento da epilepsia é teoricamente possível se o controle das descargas da rede neural é conseguido no lugar do começo da apreensão. O protocolo apresentado provou isso possível se...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4AP	Sigma	275875
Alexa Fluor 488	Abcam	ab15007
Amplifier	Neuralynx, Montana, USA	Digital Lynx 4SX
Amplifier	Ampliplex	KJE-1001
Atlas Stereotaxique	Allen Atlas	978-0470054086
Borosilica glass pipette	Sutter	BF120-69-15
Brain Matrix	WPI	RBMA-200C
Bone trimmer	FST	16109-14
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Connector	INSTECH	SC20/15
Coton tige	Monoprix	EMD 6107OD
Cover slip	Menzel-Glass	15747592
DiI Stain	Thermo Fisher	D282
DMSO	Sigma	11412-11
Drill	FOREDOM	K1070
Forceps	F.S.T.	11412-11
GABA	Sigma	A2129
GFAP Monoclonal Antibody	Thermofisher	53-9892-80
GOPS	Sigma	440167-100M
Hamilton seringe	Hamilton	80330
Headscrew	Component Supply	TX00-2FH
Heating pad	Harvard apparatus	341446
Injection Pump	WPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
Ketamine	Renaudin	5787419
Magnetic holder	Narishige	GJ-1
Mice	Charles River	612
Motoric manipulator	Scientifica, UK	IVM
Na2HPO4	Sigma	255793
NaH2PO4	Sigma	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
Paper towel	KIMBERLY CLARK	7552000
PB	Sigma	P4417
PEDOT:PSS	CLEVIOS	81076212
PFA	Acros Organic	30525-89-4
Rectal temperature probe	Harvard apparatus	521591
Ropivacaine	KABI	1260216
Saline	Sigma	7982
Scalpel	F.S.T	AUST R195806
Seringue	BD Medical	324826
Serrefine clamp	F.S.T	18050-28	4 is recommended
Silicon probe	NeuroNexus, Michigan, USA	A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703
Stereotoxic frame	Stoelting	51733U
Superfrost Slide	ThermoScientific	J38000AMNZ
Tubing	INSTECH	LS20
Vaseline	Laboratoire Gilbert	3518646126611
Vectashield DAPI	Vector Laboratories, California, USA	H-1200-10
Vibratome, Leica VT1200S	Leica Microsystems	1491200S001
Xylazine	Bayer	4007221032311