עיבוד פרוטוקול עבור הניתוח של פעפוע וגודל האשכול של קולטני ממברנה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונה

Summary

כאן, אנו מציגים עבור חלקיק יחיד מעקב וניתוח תמונות המאפשר הערכה כמותית של דיפוזיה מקדמים, סוגי תנועה וגדלי אשכול של חלקיקים אחד שזוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ פרוטוקול.

Abstract

חלקיק מעקב על רצף וידאו וניתוח האחורי של מסלולים שלהם היא כיום פעולה נפוצה במחקרים ביולוגיים רבים. באמצעות הניתוח של קרום התא קולטן אשכולות כמודל, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור משימה זו ניתוח התמונה באמצעות פיג'י (ImageJ) ו- Matlab שגרות: 1) מגדירים אזורים מעניינים ומעצבים את מסכות המותאמים לאזורים אלה; 2) לאתר את חלקיקי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ וידאו; 3) לנתח את מאפייני דיפוזיה והעוצמה של הרצועות. ניתוח כמותי של מקדמי דיפוזיה, סוגי תנועה וגודל האשכול מתקבל על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, עיבוד תמונה מספק כלי חשוב כדי לקבוע באופן אובייקטיבי dynamics החלקיקים ואת ההשלכות של שינוי תנאים סביבתיים. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים מפורט לניתוח של תכונות אלה. השיטה המתוארת כאן לא רק מאפשר זיהוי מעקב מולקולה בודדת, אבל גם ממכן הערכת פרמטרים דיפוזיה לרוחב-קרום התא, מסווג את סוג המסלול, מאפשר ניתוח מלא ובכך להתגבר קשיים לכימות בגודל נקודה לאורך המסלול כולו שלו-קרום התא.

Introduction

חלבוני ממברנה שמוטבע על שכבה ליפידית הן בתנועה מתמדת עקב פיזור תרמי. הדינמיקה שלהם חיוניים כדי לווסת את התגובות התא, כפי האינטראקציות הבין-מולקולרי לאפשר היווצרות מתחמים להשתנות בגודלו מונומרים כדי oligomers ולהשפיע על יציבותו של איתות תסביכים. שחקרתי את מנגנוני שליטה חלבון דינמיקה היא לפיכך אתגר חדש ב ביולוגיה של התא, הדרושים כדי להבין את האות התמרה חושית מסלולים וכדי לזהות פונקציות תא בלתי צפויות.

פותחו מספר שיטות אופטי ללמוד אינטראקציות אלה החיים תאים¹. בין אלה, מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) גמורה, שפותחה בשנות ה-80 המוקדמות, מאפשר חקר אינטראקציות מולקולרית ליד או מאוד את קרום התא². ללמוד פרמטרים דינמיים של מסלולים חלבון ממברנה המתקבל TIRF נתונים בתאים חיים, חלקיק בודד שיטת (SPT) מעקב נדרש. למרות מספר אלגוריתמים זמינים עבור זה, אנו כעת להשתמש לאלה שפורסמו על ידי Jaqaman et al.³ המטפלות הטרוגניות תנועה של חלקיקים בשדה החלקיקים צפופים על-ידי קישור חלקיקים בין מסגרות רצופים כדי להתחבר למסלול וכתוצאה מכך מקטעי לתוך מסלולים מלאה (היעלמות זמנית החלקיקים). התוכנה לוכדת את החלקיקים מיזוג ופיצול הנגרמות כתוצאה צבירת ו דיסוציאציה אירועים³. אחד נתוני הפלט של תוכנה זו היא זיהוי של החלקיקים לאורך המסלול כולו על-ידי הגדרת את עמדותיהם X ו- Y בכל מסגרת.

ברגע זוהו חלקיקים, אנו מיישמים אלגוריתמים שונים כדי לקבוע את timelag קצר דיפוזיה מקדם (ד_1-4)^4,5. על-ידי החלת הניתוח⁸ רגע דרוג ספקטרום (MSS)^7,6,, או על-ידי התאמת הערך 'alpha' על-ידי התאמה של ממוצע הריבועים הזחה (MSD) עקומת⁹, אנחנו גם לסווג את החלקיקים על פי סוג מסלול.

ניתוח בעוצמה ספוט בתמונות פלורסצנטיות הוא מטרה משותפת עבור מדענים שדה^10,11. האלגוריתם הנפוץ ביותר בשימוש הוא מספר כביכול בהירות. שיטה זו בכל זאת אינו מאפשר זיהוי נכון מסגרת עוצמת ב חלקיקי השבר ניידים. לנו יש, לכן, שנוצר אלגוריתם חדש כדי להעריך אלו חלקיקים בעוצמות-המסגרת וכדי לקבוע את מצב צבירת שלהם. ברגע נקודות הציון של כל חלקיק מזוהים באמצעות תוכנת U-Track2³, אנו מגדירים בעוצמתה בכל מסגרת מעל המסלול המלא, גם אם ניקח בחשבון את הרקע לתא בכל מסגרת. תוכנה זו מציעה אפשרויות שונות כדי לקבוע את עוצמת המקום והרקע תא לקניה, באמצעות חלבונים monomeric ו- dimeric ידוע גם הפניות, מחשבת את המספר המשוער של חלבונים בהחלקיק זוהה (גודל האשכול).

במאמר זה, אנו מתארים מדריך זהיר כדי לבצע את השלבים 3: 1) זיהוי ומעקב אחר חלקיקים בודדים לאורך וידאו של מיקרוסקופיית פלורסצנטיות באמצעות U-track; 2) מנתח את מקדם דיפוזיה מיידי (ד_1-4) של החלקיקים כאלו וסוג התנועה (מוגבל, חינם או מכוונת) של חלקיקים עם מסלולים ארוכים על ידי MSS; 3) מדידת עוצמת ספוט לאורך הווידאו על-ידי קרינה פלואורסצנטית הרקע מוערך בכל מקום. כך מתאפשר הערכת גודל האשכול וזיהוי של השלבים photobleaching.

השימוש בפרוטוקול זה אינו דורש כישורים מיוחדים ניתן לבצע במעבדה כלשהי עם תרבית תאים, flow cytometry ומתקני מיקרוסקופ. הפרוטוקול משתמש ImageJ או פיג'י (הפצה של ImageJ¹²), U-track³והשגרה הוק עשה כמה לספירה (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track, אד הוק רוטינות לדרוס Matlab שניתן להתקין בכל מחשב תואם.

Protocol

1. הכנת דגימות ביולוגיות

1. לגדל תאים Jurkat בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% FCS, NaPyr וגלוטמין (RPMI מלאה). Electroporate Jurkat תאים (20 x 10⁶ תאים/400 µL של RPMI 1640 עם 10% FCS) עם וקטור קולטן כימוקין מתויג-GFP monomeric (CXCR4-AcGFP, 20 μg) כדי לאפשר זיהוי שלו באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
   הערה: זה אפשרי להשתמש בחלבונים פלורסנט monomeric אחרים כגון mCherry, mScarlet, וכו '.
2. 24 שעות לאחר תרביות תאים לנתח בתאים cytometer זרימה כדי לקבוע תא הכדאיות וביטוי CXCR4-AcGFP.
3. בחר את התאים לבטא רמות נמוכות CXCR4-AcGFP על-ידי התא מיון של GFP תאים חיובי^נמוך (איור 1), כפי נמוך לביטוי קולטן transfected נדרש TIRFM ניסויים על מנת להבטיח מעקב חלקיק יחיד לעקיבה בודדים מסלולים⁹.
4. לכמת את מספר הקולטנים על פני השטח של התא.
   הערה: כמו לדוגמה¹³, קולטנים התווית על-ידי AcGFP ~ 8,500-22,000/תא, מקבילים ~ 2-4.5 חלקיקים/μm².
5. Resuspend תאים ממוינים RPMI מלאה, תקופת דגירה של פחות 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. צנטריפוגה תאים (300 x g, 5 דקות), resuspended אותם במאגר TIRF (HBSS, 25 מ מ HEPES, FCS 2%, pH 7.3).
   1. צלחת על מנות תת microwell 35 מ מ (2-3 x 10⁵ תא/צלחת) מצופה fibronectin (20 μg/mL, 1 h, 37 מעלות צלזיוס), נוכחות או היעדרות של ליגנד המתאים (קרי, CXCL12, 100 ננומטר, 1 h, 37 ° C). דגירה תאים (20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) לפני ייבוא תמונות.
6. ביצוע ניסויים באמצעות מיקרוסקופ TIRF, מצוידים עם מצלמה EM-CCD, 100 x שמן-טבילה אובייקטיבי (HCX PL APO 100 x / 1.46 NA), 488 ננומטר דיודת לייזר. המיקרוסקופ מאפשר בקרת טמפרטורה הדגירה עם CO₂. לאתר ולהתמקד תאים עם השפם להתמקד בסדר וגסים, באמצעות שדה בהיר כדי למזער את ההשפעות photobleaching. כוונון פוקוס בסדר במצב TIRF להשתמש לייזר נמוך עוצמה, מספיקים לצורך זיהוי חד-חלקיקים או לגרום השפעות photobleaching (עוצמת הלייזר 5%, 28 μW).
7. לרכוש סרטים (רצפי תמונות) של 50 s למזער את מרווח הזמן בין מסגרות. חדירה של השדה evanescent צריך להיות 70-90 ננומטר של עומק. שמור לסרטים שנרכשו עבור כל תנאי ניסיוני בשם ".lif" (video.lif).
   הערה: סרטים בדוגמה המתוארת היו רכשה 49%-עוצמת הלייזר (2 mW) עם מועד החשיפה של 90 ms, מרווח זמן של 98 ms, עבור 49 s (מסגרות 500). חדירה של הגל evanescent שנבחר היה 90 ננומטר.

2. מבחר תמונות ויצירת מסיכות

1. כל ניסיוני תנאי (video.lif), צור תיקיה חדשה (VideoName) חייבים להכיל תיקיות שונות עבור כל סדרה. כל תיקיה תכיל תיקייה "videoSeq" עבור תמונות וידאו ותיקיה "תוצאות" עבור התוצאות של הניתוח. ודא מבנה הקבצים ברגע זה הפעולות הבאות:
   VideoName/video.lif
   VideoName/Series1/videoSeq
   VideoName/Series1/תוצאות
   הערה: תגלי את קבצי .lif שונים מתקבלים עם כמה קטעי וידאו עבור כל תנאי טיפול (כלומר FN, FN + דנה). "video.lif" מקבילה input.lif קובץ הווידאו עם TIRF כל סרטים רכישות (סדרות) ביצע על המיקרוסקופ. "videoSeq" תיקיה תכיל מסגרות 500 של הסרט בו אנו מנתחים. תיקיית "תוצאות" יכיל כל הקבצים המתבררת מניתוח שבוצעה. במינוח מדויק ולוקליזציה של התיקיות שונים הם חיוניים עבור הפונקציה הנכון של האלגוריתם. שמות המודגשות ברשימה שלעיל קבועים (קרי, הם חייבים להיות נקרא כך כי אלה שמות המבוקש על-ידי קבצי ה-script). שמות לא באותיות מודגשות ניתן לשנות כדי לשקף ביצע הניסוי.
2. פתח את הוידאו TIRFM (קובץ .lif) עם פיג'י או ImageJ על-ידי גרירה ושחרור של הקובץ על שורת התפריטים פיג'י, לחץ על בסדר כדי לייבא את הקובץ lif באמצעות BioFormats (משלים איור 1).
3. בחר את הסידרה כדי לעבד ולחץ על OK (איור משלים 2A). לעיצוב מסכה לניתוח של הוידאו, לייבא גם תמונה רב-ערוצית עם הן שונות (בדוגמה, סדרה 1 הוא רב-ערוצית סדרה 2 וידאו המקביל). הוידאו (וגם את רב-ערוצית) אמורה להיפתח כמו אוסף ImageJ. בדוגמה (איור משלים 2B), התמונה היא בצד השמאל ואת הוידאו הוא בצד הימין.
   הערה: אם יצירת מסיכה עבור הווידאו אינה דרושה, ללכת צעד 2.5.
4. ליצירת מסיכה. צור תמונה אחת עם הערוצים שימושי עבור העיצוב של המסכה. במקרה זה, ערוצים מעניינים הם אלה אדום, ירוק, אפור.
   1. לפצל את הערוצים מהתמונה רב-ערוצי (איור משלים 3A): בחרו תמונה בסרגל בתפריט ולחץ צבע | לפצל ערוצים. הערוצים השונים יראה כמו תמונות נפרדות (איור משלים 3B).
   2. למזג שוב את הערוצים שלוש בתמונה אחת (איור משלים 4A): בחרו תמונה בסרגל ובחר צבע | מיזוג ערוצים. בחר את הערוצים ולחץ OK (איור משלים 4B). תמונה חדשה לא מוערם יהיה שנוצר (4C איור משלים).
   3. לסנכרן את שני חלונות באמצעות הכלי Windows לסנכרן (איור משלים 5A): בחרו ' ניתוח ' בסרגל התפריט | כלים | סינכרון של Windows. חלון חדש עם אפשרויות סינכרון תמונות יוצגו (איור משלים 5B).
   4. עם שני החלונות מסונכרן (רק וידאו אם אין תמונה רב-ערוצית הקשורים), באותו האזור בחלונות שני יכול להיחתך. צייר האזור עניין בעזרת הכלי בחירה מלבנית של תפריט צף ImageJ. בחר תמונה בשורת התפריט, בחר חיתוך (איור משלים 6A). שתי תמונות החתוכה תציג בנפרד (איור משלים 6B).
   5. לא מסונכרן בשני חלונות (איור משלים 6B) על ידי לחיצה על לחצן ביטול סינכרון הכל מנהל הסינכרון של Windows .
5. אם מסכה לא נוצרה כמו שלב 2.4, לצייר האזור עניין בעזרת הכלי בחירה מלבנית של תפריט צף ImageJ.
6. שמירת הוידאו רצף תמונות ב מדריך videoSeq תחת ספריית וידאו המקביל (משלימה איור 7 א): בחר קובץ בשורת בתפריט ולחץ שמירת | התמונה רצף לשנות את התוויות עבור הרצף וידאו כמו video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif, (איור משלים 7 ב): בתיבת שם , שינוי שם כמו וידאו ולחץ על אישור. הרצף חייב להיות לבד בספריית שלה כדי לשמש בהצלחה על ידי U-track.
   הערה: אם לא בעיצוב מסיכה עבור הוידאו, ללכת צעד 2.8.
7. עיצוב מסכה. בחר בתמונה רב-ערוצי ולפתוח את התוסף פילוח עורך (איור משלים 8A): בחר תוספים בשורת התפריט, בחר באפשרות פילוח | פילוח של עורך. להוסיף ולשנות את התוויות של פילוח לפי הצורך על-ידי לחיצה ימנית על התוויות של העורך פילוח (איור משלים 8 ב', ג).
   1. בחרו בכלי הבחירה המתאימה בתפריט צף ImageJ (הנה, תשתמש ביד חופשית), בחר בתווית (ירוק) ועיצוב קודם המסכה החיצוני (איור משלים 9A). לאחר תוכנן, לחץ על + כפתור הבחירה באפשרות של חלון ללא הפרדות צבע , ואת המסכה שנבחרו יוצגו על הצופה (איור משלים 9A). חזור על שלב זה עם תוויות הבא (פנימי, באדום) (איור משלים 9B).
      הערה: לאחר עיצוב המסכה עבור התוויות פנים וירוק, המסכה החיצוני לכבוש את שאר התמונה.
   2. מסכות מוצפנים בתמונה כמו אזורים 0, 1, 2,... על-פי הסדר של המדבקות לחלון תוויות RGB. כאשר כל המסיכות עבור התוויות שונות מיועדות, לשמור את המסכה באותו שם כמו הוידאו, השם mask.tif (איור משלים 9C): בחר קובץ בשורת ובחר שמירת | Tiff..
      הערה: המסכות שנבחר המעולים חישוב מקדמי דיפוזיה, סיווג של מסלולים (ראה שלב 4.2).
8. בדוק מבנה הקבצים ברגע זה הפעולות הבאות:
   VideoName/video.lif
   VideoName/Series1/mask.tif
   VideoName/Series1/ videoSeq / video0000.tif
   VideoName/Series1/ videoSeq / video0001.tif
   ...
   VideoName/Series1/ videoSeq / video0499.tif
   VideoName/Series1/תוצאות
   הערה: Mask.tif היא תמונה עם המסכה כמתוכנן ב- 2.4 שלבים ו- 2.7. Video*.tiff הוא הווידאו כפי שנשמר ב- 2.6 שלב. לעיל, בעיצוב מודגש השמות ברשימה לעיל קבועים, כלומר, הם חייבים להיות נקרא כך כי אלה שמות המבוקש על-ידי קבצי ה-script. שמות לא באותיות מודגשות ניתן לשנות כדי לשקף ביצע הניסוי.

3. מעקב אחר החלקיקים

1. מעקב אחר כל החלקיקים ראו קטעי וידאו נבחרים באמצעות U-track.
2. פתח Matlab, הוסף מדריך U-track לנתיב באמצעות להגדיר נתיב | להוסיף עם תיקיות משנה אפשרות בתפריט. שמור את הנתיב כך בעתיד הוצאות להורג של Matlab U-track נמצאת בנתיב. הגדרת נתיב זה צריך להיעשות רק פעם אחת.
3. שינוי ספריית העבודה לספריה המכילה את הסדרה כדי להיות מנותח. הפעל U-track על-ידי הקלדת המסוף (משלימה איור 10) movieSelectorGUI ולחצו על enter. חלון בחירת הסרט יהיה פתח (איור משלים 11 א).
4. לחץ על לחצן הסרט החדש , חלון הסרט מהדורה יופיע (איור משלים 11B).
5. לחץ על הוסף ערוץ כדי לבחור את הספרייה עם הוידאו (VideoName/Series1/וידאו) ולמלא את הפרמטרים מידע של הסרט. הגדר את ספריית הפלט עבור התוצאות של U-track תוצאות (videoName Series1 תוצאות).
   הערה: ניתן להשיג את הפרמטרים מידע הסרט המיקרוסקופ ותנאי רכישה.
6. הקש על הגדרות מתקדמות הערוצים ולמלא את הפרמטרים הקשורים הרכישה. בדוק ערכי הפרמטרים של הדוגמה (11C איור משלים).
7. הקש על להציל בחלון הגדרות מתקדמות ערוץ , שמור על החלון סרט מהדורה . התוכנית יבקש אישור לכתוב את קובץ הנקרא movieData.mat על הספריה תוצאות . לאשר.
8. לאחר יצירת הסרט, הקש על המשך בחלון הבחירה סרט. U-track ישאל על סוג האובייקט כדי להיות מנותח. בחר יחיד-חלקיקים (משלימה איור 12). מהחלון לוח הבקרה יופיע (איור משלים 13A).
   1. בחר את הצעד הראשון שלב 1: זיהוי , לחץ על הגדרה. חלון הגדרת תערובת-דגם מתאים לפי עקומת גאוס יופיעו (איור משלים 13 ב'). בדוגמה, "ערך אלפא לשם השוואה עם רקע המקומי" מוגדרת 0.001 ו "רולינג-חלון זמן ממוצע של" 3 (איור משלים 13 ב').
   2. לחץ על החל בחלון הגדרות תערובת-דגם מתאים לפי עקומת גאוס , להפעיל לוח הבקרה. עם התצורה משלים באיור13, פועל רק השלב זיהוי . שלב זה לוקח כמה דקות (2-5). בדקו את התוצאות על-ידי לחיצה על לחצן תוצאה של שלב 1 (זיהוי, משלימה איור 14).
      הערה: כמתואר לעיל, הסרט מציג עיגולים אדומים על החלקיקים שזוהו. אם אין עיגול אדום מוצג, ואז צעד זה לא פעל כראוי.
9. לבצע את הזיהוי של רצועות, כלומר, מיזוג החלקיקים שאותרו בשלב הקודם לתוך רצועות המתפרסים על מסגרות מרובות. . זה שלב 2: מעקב אחר של U-track ההגדרות שלו חייבת להיות מוגדרת כמוצג באיור משלימה 15A-C. עלות שלב 2 פונקציה הגדרות עבור מסגרת-על קישור של סגירת הפער, מיזוג ופיצול בדוגמה מוצגים איור משלים 15 ב ו- Cבהתאמה.
10. לאחר הגדרת הפרמטרים עבור שלב 2, הקש הפעל לוח הבקרה ופועל רק בשלב 2 (16 איור משלים).
11. לבצע מעקב אחר ניתוח, שלב 3. להגדיר את ההגדרות כפי שמוצג משלימה איור 17 (לוח נכון). לאחר מכן, הקש החל הפאנל של הגדרה-Motion Analysis ולאחר לרוץ בתוך פקד לוח-U-המסלול. שלב זה לוקח כמה שניות.
12. ודא עם הלחצן תוצאה של שלב 3 כי התהליך זיהה כראוי כל המסלולים. לעשות זאת, לחץ על הצג מספר רצועה של החלון ' אפשרויות סרט ' ובדוק מסגרת על-ידי מסגרת כי כל מסלול כבר זיהו נכונה (משלימה איור 18). ידנית להוסיף החלקיקים כאלו שאינם חלקיקים אמיתי.
    הערה: אם זו בחירה ידנית לא נעשה, בחירה אוטומטית חלש יכול להתבצע מאוחר יותר בעת חישוב מקדם דיפוזיה (ראה שלב 4).

4. חישוב של סיווג של מסלולים והקבוע דיפוזיה

1. ודא כי כל התסריטים מופעלים מהספריה של הוידאו שעוברים ניתוח (בדוגמה, VideoName/Serie1).
2. לקרוא את כל מסלולי לחישוב מקדמי דיפוזיה באמצעות הנפקת ב- Matlab מסוף הפקודה: trajectories=readTrajectories(0.1), איפה 0.1 הזמן בשניות בין שתי מסגרות רצופים (מרווח זמן, שמוצג בחלונית סרט מידע, משלימה איור 11B).
3. הכללת מסלולים המתאימים כתמים/מסלולים שזוהתה באופן שגוי. תן רשימה של המקומות כדי לא לכלול. למשל, כדי לא לכלול נקודות 4, 5 ו- 28, הקלד: מסלולים = readTrajectories (0.1 [4, 5, 28]).
4. חישוב מקדמי דיפוזיה מיידי לכל אחד מהשירים של תא זה. במקרה זה, לחשב את מקדם דיפוזיה של פער-זמן = 4, שנקרא D_1-4. לעשות זאת, הפעל במסוף Matlab את הפקודה: D = calculateDiffusion (מסלולים, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha') איפה מסלולים מסלולים שהושג בשלב 3, 113.88e-3 הוא גודל פיקסל תמונות שנרכשו במיקרון, 0.0015 חסם עליון עבור דיפוזיה המקדמים של חלקיקים משותק נמדד /s²מיקרומטר, ו 'alpha' הוא המודל מצויד כמוסבר להלן.
   הערה: כאשר באמצעות מצלמה מהירה יותר צורך מסגרות נוספות כדי לחשב את הפרמטר דיפוזיה להגדיל אותו, למשל ל 20, מאת D = calculateDiffusion (מסלולים, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', ', 20). הפרמטר מחרוזת לפני 20, בדוגמה שלעיל, ', הוא הסיומת שיתווספו קבצי הפלט. סיומת זו עשוי לשמש כדי להבדיל ניתוחים שונים.
5. להתאים את MSD עם פונקציה שונה על-ידי קריאה הפונקציה calculateDiffusion שוב עם מצב התאמה שונים ('מוגבל', 'ללא' או 'ביים'). בדוגמה זו, 'מוגבל': D = calculateDiffusion (מסלולים, 113.88e-3, 0.0015, 'מוגבלת').
6. להשיג את תוצאות המדידה עבור המודל מכוונת, כפי שמוצג באיור20 משלימה.
7. לפרק את מסלולי לתוך מסלולים קצרים וארוכים. השתמש בפקודה: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) איפה 50 האורך המינימלי במסגרות של מסלול כדי להיחשב זמן (בדוגמה).
8. ללמוד מסלולים קצרים באמצעות ההליך הולם אותו המתוארים שלב 4.3: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'ביים', 'קצר'). ניתוח קצר, חריג מסלולים עם הפקודה: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', 'קצר').
9. לנתח מסלולים ארוכים כדי לסווג את הסוג של תנועה דרך שלהם רגע דרוג ספקטרום (MSS)⁷. הפקודה: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'זמן') מציג הניתוח במסך ויוצרת קובץ בשם trajectoryClassification > < סיומת. txt מדריך results\TrackingPackage\tracks.

5. חישוב של אשכול Ssize דרך צפיפות החלקיקים.

הערה: ודא כי כל התסריטים מופעלים מהספריה של הוידאו שעוברים ניתוח (בדוגמה המוצגת, VideoName/Serie1).

1. לנתח את האינטנסיביות של כל חלקיק לאורך מסלולם. לעשות זאת, הפעל את ה-script על-ידי הקלדת במסוף Matlab: analyzeSpotIntensities שלוקח כמו קלט את מסלולי מחושב על ידי U-track בסעיף הראשון. בצורתו הבסיסית ביותר, פשוט לקרוא את התסריט בלי שום ויכוח מהספריה של הוידאו שעוברים ניתוח (בדוגמה המוצגת, VideoName/Series1) analyzeSpotIntensities(). להגדיר התנהגות בסיסית זו בדרכים שונות על-ידי מתן ארגומנטים לקובץ ה-script כמו: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, Value1, ' Arg2´, Value2). טיעונים עם ערכי המשתנה המקביל שלהם ('ArgN´, ValueN) מפורטים.
   1. ('spotRadius´, 1)
      לנתח את עוצמת קרינה פלואורסצנטית באמצעות את spotRadius של 1 פיקסל (כברירת מחדל) המתאים מדבקה בגודל 3 x 3 מרוכז בנקודה ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      הערה: במשך תקופה של 5 x 5 מרוכז בנקודה, לבחור spotRadius 2, ועוד.
   2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      אם ארגומנט זה צוין (true, ערך של 1), לנתח רק את מסלולים שמתחילים המסגרת הראשונה של הוידאו. פעולה זו שימושית לנתח שליטה תמונות (כברירת מחדל 0, שווא).
   3. ('trackTrajectory´, 0)
      אם ארגומנט זה מוגדר כ- 0 (false), ואז שמור הקוארדינטה של המקום המסגרת הראשונה עבור כל המסגרות (זה שימושי עבור משותק כתמים). אם הארגומנט מוגדרת ל- 1 (כברירת מחדל 1, נכון), אז במקום מתבצע לאורך הבאות וידאו נקודות הציון מחושב באמצעות U-track.
   4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      כוללים את מסלול מספר מסלולים אלה נכללים 4.3 שלב (בדוגמה 4, 5, 28).
   5. ('extendTrajectory ´, 1)
      אם ארגומנט זה מוגדר כ- 1 (true), ואז לנתח את עוצמת במדבקה לסוף הווידאו (גם אם המסלול נעצר מוקדם יותר). הקואורדינטה של המקום הוא הקואורדינטה שעבר מסלול (אם trackTrajectory נכון) או הקואורדינטה הראשונה מסלול (אם trackTrajectory שווא). ארגומנט זה הוא false (0) כברירת מחדל.
   6. ('subtractBackground´, 1)
      אם פרמטר זה מוגדר, אז נכון ידי קרינה פלואורסצנטית raw נמדדת בנקודה כל ההערכה של זריחה רקע באותו מקום (ראו להלן). ארגומנט זה הוא true (1), כברירת מחדל.
   7. ('meanLength´, מספר מסגרת)
      אם פרמטר זה מוגדר, במקום בעוצמה אומר נמדד בהאורך שצוין. סט 'meanLength', 20 כדי למדוד את עוצמת ספוט רשע על המסגרות הראשון 20. אם הארגומנט אינו מוגדר, אז עוצמת ספוט מחושבת ב המסלול כולו (כברירת מחדל, באורך מלא).
   8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      הגדר פרמטר זה כ- 1 (כברירת מחדל 0, שווא), כדי להתוות את הפרופיל בעוצמה לאורך במסגרות שונות, כמו גם הרקע שלהם.
      הערה: חלקות אלה שימושיים מאוד לזהות photobleaching, כפי שמוצג באיור 21 משלימה. עבור כל נתיב, השגרה מנתחת באופן אוטומטי אם זה אפשרי כי היו photobleaching. פעולה זו מתבצעת על-ידי השוואת את ערכי העוצמה עם t של סטודנט במסגרות N הראשונה והאחרונה לאורך הנתיב. כברירת מחדל, N 10, אך ניתן לשנות ערך זה באמצעות הארגומנט ' Nbleach´.
   9. ('backgroundMethod´, ערך)
      הגדר פרמטר זה כדי לקבוע את הרקע של כל מקום. זה יכול להיעשות במספר דרכים, מי מהם להשתמש וניתן הנבחר "ערך המשתנה":
      1. ('backgroundMethod´, 0)
         השתמש בערך זה כדי לזהות באופן ידני את הרקע עבור הווידאו. אפשר לבחור 8 נקודות המסגרת הראשונה של הוידאו. ניתוח תיקון סביב נקודות אלה לאורך הווידאו, quantile 95% של כל עוצמות אלו נבחר כמו עוצמת רקע עבור כל נקודות.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
         השתמש בערך זה כדי לזהות באופן ידני את הרקע עבור כל מסגרת. לבחור 8 נקודות עבור כל נקודה של כל מסגרת. זוהי משימה זמן רב אבל זה נותן הרבה שליטה למשתמש. Quantile 95% של עוצמות בכתמים אלו נבחר כמו עוצמת רקע בשביל התפקיד במסגרת זו.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
         שימוש ערך זה כדי לחשב את הרקע של כל המקום המשוער של 8 נקודות ממוקם במעגל סביב הנקודה עם רדיוס נשלט על-ידי הארגומנט ' backgroundRadius´ (כברירת מחדל, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
         השתמש בערך זה כדי לחשב את הרקע עבור כל מסגרת תחילה באיתור התא וידאו ולאחר מכן ניתוח עוצמות של התא בכל מסגרת (משלימה איור 22).
         הערה: הרקע נבחר הערך אפור quantile נתון של התפלגות זו (כברירת מחדל 0.5 (= 50%), אף על פי פרמטר זה יכול להיות נשלט באמצעות הארגומנט ' backgroundPercentile´, ערך זה ניתן להגדיר גבוה יותר, למשל, 0.9 (= 90%) אם רוצים רוב התא כדי להיחשב כרקע. כדי לסייע בזיהוי של התא, מצביעים על אשר הוא הערך המרבי רקע צפוי לאורך בין המסגרות באמצעות הארגומנט ' maxBackground´ (למשל, אצל כל קטעי וידאו שנותחה, הערך רקע מעבר בדרך כלל לעולם 6000)¹³. כברירת מחדל, אפשרות זו מוגדרת ל- 0, כלומר עזרה זו לא משמש כברירת מחדל. רואים שזה הגילוי תא והאזור שבחרת עבור הערכת רקע על-ידי הגדרת הארגומנט ' showImages´ ל- 1 (לעצור ההוצאה להורג בכל עת על ידי לחיצה על CTRL-C).
2. לאסוף את המידע דיפוזיה ועוצמה עבור כל מסלולי מחושבת באופן של 4 שלבים ו- 5.1, בהתאמה, שימוש (gatherDiffusion.AndIntensity). לאסוף רק את המידע דיפוזיה ועוצמה עבור מסלולים קצרים. לעשות זאת, השתמש את הסיומות בשימוש שלב 4.7 וסוג: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) בו ' Short´ הוא הסיומת בשימוש שלב 4.7.
3. לאסוף ברגע ספקטרום קנה המידה והקלדה של עוצמת informationby: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') איפה 'זמן' הסיומת משמש שלב 4.7. סיכום של כל הקבצים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מוצג באיור2.

תוצאות

השימוש של פרוטוקול זה מאפשר את מעקב אוטומטי של חלקיקים זוהה סרטים מיקרוסקופ פלורסצנטיות, הניתוח של המאפיינים דינמי שלהם. בתחילה, התאים הם transfected עם החלבון מצמידים fluorescently לבצע אחריהם מעקב. הרמה המתאימה של קולטנים מציג על פני התא, המאפשר ש-SPT מתקבל על ידי התא מיון (

Discussion

השיטה המתוארת קל לבצע אפילו מבלי ניסיון עבודה עם Matlab. עם זאת, Matlab רוטינות לדרוש מאוד דיוק עם המינוח של פקודות שונות, הלוקליזציה של התיקיות שונות המועסקים על-ידי התוכנית. ב המעקב אחר ניתוח שגרתי (שלב 3), ניתן לשנות פרמטרים מרובים. חלון "הגדרה Gaussian-תערובת דגם נאוה" (שלב 3.8) קובעת איך U-track יזהה חלקי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Jurkat cells	ATCC	CRL-10915	Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator	BioRad		We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands.
Cytomics FC 500 flow cytometer	Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter	Beckman Coulter		Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Recombinant human CXCL12	PeproTech	300928A
Inverted Leica AM TIRF	Leica
EM-CCD camera	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software	Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software			Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism	GraphPad software