확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

요약

여기, 우리는 확산 계수, 형광 현미경 검사 법에 의해 감지 하는 단일 입자의 모션 및 클러스터 크기의 종류의 정량적 인 평가 허용 하는 이미지 분석을 추적 하는 단일 입자에 대 한 프로토콜을 제시.

초록

비디오 시퀀스에 그들의 궤도의 후부 분석 추적 입자 요즘 많은 생물학 연구에서 일반적인 작업입니다. 모델 클러스터 세포 막 수용 체의 분석을 사용 하 여, 피지 (ImageJ) 및 Matlab 루틴을 사용 하 여이 이미지 분석 작업에 대 한 자세한 프로토콜 소개: 1) 관심 영역을 정의 하 고 마스크;이 지역에 맞게 디자인 2) 형광 현미경 동영상; 입자 추적 3) 선택 된 트랙의 확산 및 강도 특성 분석. 확산 계수의 정량 분석, 모션, 및 클러스터 크기의 유형 형광 현미경으로 얻은 이미지 처리 하며 객관적으로 입자 역학과 수정 결과 확인 하는 유용한 도구 환경 조건입니다. 이 문서에서는 이러한 기능 분석에 대 한 상세한 프로토콜 선물이. 설명 하는 방법을 여기 뿐만 아니라 단일 분자 추적 탐지를 허용 하지만 측면 확산 세포 막에서 매개 변수 추정 자동화, 궤적의 유형을 분류 하 고 따라서 극복 하는 완전 한 분석을 수는 세포 막에서 그것의 전체 궤도에 자리 크기 측정에 어려움

서문

막 단백질 지질 bilayer에 포함 된 열 확산으로 지속적인 운동에 있습니다. Intermolecular 상호 작용 올리고 단위체에서 크기에서 변화 하 고 신호 복합물의 안정성에 영향을 단지의 형성으로 그들의 역학 세포 응답 통제에 필수적입니다. 단백질 역학을 제어 하는 메커니즘을 elucidating 따라서 세포 생물학, 신호 전달 경로 이해 하 고 예기치 않은 셀 기능을 식별 하는 데 필요한 새로운 도전 이다.

일부 광 방법은 개발 되었다¹셀 생활에 이러한 상호 작용을 공부 하. 이러한 가운데, 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 검사 법, 1980 년대 초에 개발 또는 세포 막²근처 매우 분자 상호 작용의 연구를 수 있습니다. 공부 하 고 살아있는 세포에 TIRF 데이터에서 가져온 막 단백질 궤적의 동적 매개 변수, 단일 입자 추적 방법 (SPT)가 필요 합니다. 여러 알고리즘이 사용할 수 있습니다, 있지만 우리 현재 Jaqaman 외.³ 는 입자 결과 트랙을 연결 하려면 연속 프레임 사이 연결 하 여 입자 모션이 조밀한 입자 필드에 의해 그 사용 완전 한 궤도 (임시 입자 실종)에 세그먼트. 소프트웨어를 병합 하 고 그 결과 집계 및 분리 이벤트³에서 분할 입자를 캡처합니다. 이 소프트웨어의 출력 데이터 중 하나는 각 프레임에서 그들의 X 및 Y 위치를 정의 하 여 전체 궤적에 따라 입자의 탐지 이다.

일단 입자 감지, 우리 짧은 timelag 확산 계수 (D_1-4)^,45를 확인 하려면 다른 알고리즘을 적용 합니다. 순간 확장 스펙트럼 (MSS)^6,,78 분석을 적용 하거나 조정 곡선⁹제곱 변위 (MSD)의 '알파' 값을 피팅, 우리도에 따라 입자 분류 궤도의 유형입니다.

형광 이미지 자리 강도 분석 필드^10,11에 과학자에 대 한 공유 목표 이다. 사용 되는 가장 일반적인 알고리즘은 소위 수와 밝기. 이 메서드는 그럼에도 불구 하 고 모바일 분수에서 입자에 올바른 프레임으로 프레임 강도 감지를 허용 하지 않습니다. 따라서, 이러한 입자 농도-의해-프레임을 평가 하 고 그들의 집계 상태를 결정 하는 새로운 알고리즘을 생성, 되었습니다. 각 입자의 좌표 U-Track2 소프트웨어³를 사용 하 여 감지, 일단 정의 강도 각 프레임에 완전 한 궤도 통해 각 프레임에서 셀 배경은 고려도 합니다. 이 소프트웨어 자리 강도 및 셀 배경 결정 하는 다른 가능성을 제공 하 고, 입자 감지 (클러스터 크기)에 있는 단백질의 대략적인 수를 계산 합니다 참조로 알려진된 단위체와 dimeric 단백질을 사용 하 여.

이 문서에서는 이러한 세 단계를 수행 하는 주의 가이드 설명: 1) 검색 및 U-트랙;를 사용 하 여 형광 현미경의 비디오에 따라 단일 입자 추적 2) MSS; 여 긴 궤적을 가진 입자의 움직임 (밀폐, 무료, 또는 감독)의 유형과 그 입자의 즉석 확산 계수 (D_1-4) 분석 3) 각 장소에 대 한 예상된 배경 형광에 의해 수정 비디오 따라 자리 강도 측정 하는. 클러스터 크기 추정 및 photobleaching 단계 식별 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용 하는 전문된 기술을 요구 하지 않는다 세포 배양으로 어떤 실험실에서 수행할 수 있습니다, 그리고 flow cytometry 및 현미경 검사 법. 프로토콜은 ImageJ 또는 피지 (ImageJ¹²배포), U-트랙³및 일부 ad hoc 만든 루틴 (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip)를 사용합니다. U-트랙 및 ad hoc 루틴 모든 호환 컴퓨터에 설치할 수 있는 Matlab을 통해 실행 합니다.

프로토콜

1입니다. 생물 샘플의 준비

1. 10 %fcs 보충 RPMI 1640 매체에 Jurkat 세포 성장 NaPyr 및 L-글루타민 (완전 한 RPMI). Electroporate Jurkat 세포 (20 x 10⁶ 셀/400 µ L 10% fcs RPMI 1640의) 단위체 GFP 표시 chemokine 수용 체 벡터 (CXCR4-AcGFP, 20 μ g) 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 그것의 탐지를 허용 하도록.
   참고: 그것은 mCherry, mScarlet, 등 등과 같은 다른 단위체 형광 단백질을 사용 하 여 수 있습니다.
2. transfection 후 24 h 셀 교류 cytometer 세포 생존 능력 및 CXCR4 AcGFP 식 결정을 분석.
3. 같이 transfected 수용 체의 낮은 식 TIRFM 실험에 개별 추적에 대 한 단일 입자 추적을 보장 하는 데 필요한 세포 GFP^낮은 긍정적인 세포 (그림 1)의 분류에 의해 CXCR4 AcGFP 저급을 표현 하는 셀을 선택 궤적⁹.
4. 세포 표면에 있는 수용 체의 수를 수량화 합니다.
   참고: 예제¹³셀/8500 ~ 22000 AcGFP 표시 된 수용 체로 2 ~ 4.5 입자/μ m²에 해당 합니다.
5. Resuspend 완전 한 RPMI 셀을 정렬 하 고 37 ° C, 5% CO₂에서 적어도 2 시간에 대 한 품 어. 셀 (300 x g, 5 분), 원심 및 TIRF 버퍼 (HBSS, 25mm HEPES, 2 %FCS, pH 7.3)에 그들을 resuspended.
   1. 플레이트 35 m m 유리 바닥 microwell 요리 (2-3 10⁵ 셀/접시 배)에 적절 한 리간드 (즉, CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C)의 유무에서 fibronectin (20 μ g/mL, 1 h, 37 ° C)와 코팅. 이미지 수집 전에 셀 (37 ° C, 5% CO₂에서 20 분)를 품 어.
6. EM-CCD 카메라, 기름 침수 목표 x 100 갖춘 TIRF 현미경을 사용 하 여 실험을 수행 (HCX PL apo는 100 x 1.46 / 없음) 및 488 nm 다이오드 레이저. 현미경에는 온도 제어 및 CO₂보육 수 있습니다. 찾아서 초점을 조 악 하 고 정밀한 초점 손잡이, photobleaching 효과 최소화 하기 위해 밝은 필드를 사용 하 여 셀. TIRF 모드에서 미세 초점 조정에 대 한 낮은 레이저 강도, 단일 입자 탐지 또는 photobleaching 효과 (5% 레이저 전원, 28 μW) 유도에 부족을 사용 합니다.
7. 약 50의 영화 (이미지 시퀀스) 취득 프레임 사이의 시간 간격을 최소화 하는 s. 사라져 필드의 침투 깊이의 70-90 nm 이어야 한다. ".Lif" (video.lif)로 각 실험 조건에 대 한 인수 영화를 저장 합니다.
   참고: 영화 설명된 예제에서 레이저 전력에서 49% 인수 했다 (2 mW) 90 ms의 노출 시간과 49 98 ms의 시간 간격 s (500 프레임). 선택한 사라져 웨이브의 보급률은 90 nm.

2. 다양 한 이미지와 마스크의 창조

1. 각 실험 조건 (video.lif)에 대 한 모든 시리즈에 대 한 다른 폴더를 포함 해야 하는 새 폴더 (VideoName)를 만듭니다. 각 폴더는 비디오 이미지에 대 한 "videoSeq" 폴더와 분석의 결과 대 한 "결과" 폴더에 포함 됩니다. 이 순간 파일 구조는 다음 있는지 확인 합니다.
   VideoName/video.lif
   VideoName/계열1/videoSeq
   VideoName/계열1/결과
   참고: 현미경에서 다른.lif 파일 (FN, FN + 자위대) 모든 치료 상태에 대 한 몇 가지 동영상을 얻을 수 있습니다. "video.lif" input.lif 비디오 파일을 모든 TIRF 영화 취득 (시리즈) 현미경에서 수행에 해당 합니다. "videoSeq" 폴더는 우리가 분석 하는 영화의 500 프레임 포함 됩니다. "결과" 폴더 분석 수행에서 발생 하는 모든 파일이 포함 됩니다. 정확한 명칭 및 다른 폴더의 지역화는 알고리즘의 올바른 기능을 위해 필수적입니다. 대담한에 있는 이름은 위의 목록에 고정 됩니다 (즉, 그들은 스크립트에 의해 자행 하는 이름은 때문에이 방법으로 호출할 수 있다). 이름에 대담한 실험 수행에 맞게 변경할 수 있습니다.
2. 끌어서 피지 메뉴 모음 및 클릭 확인 lif 파일을 BioFormats (보충 그림 1)를 사용 하 여 파일을 삭제 하 여 피지와 ImageJ TIRFM 비디오 (.lif 파일)를 엽니다.
3. 처리 하 고 클릭 확인 (추가 그림 2A) 시리즈를 선택 합니다. 이 비디오의 분석에 대 한 마스크를 디자인 하려면 가져오기 또한 다른 chromophores와 멀티 채널 이미지 (예제에서는 시리즈 1은 다중 채널 이미지와 해당 비디오 시리즈 2). ImageJ 스택으로 비디오 (및 멀티 채널 이미지)를 열어야 합니다. (보충 그림 2B) 예제, 이미지는 왼쪽에 고 동영상은 오른쪽에.
   참고: 비디오에 대 한 마스크의 창조, 필요 하지 않은 경우 단계 2.5로 이동 합니다.
4. 마스크를 만듭니다. 마스크의 디자인에 대 한 유용한 채널 단일 이미지를 만듭니다. 이 경우에, 재미 있는 채널 들에서 빨강, 녹색 및 회색.
   1. (보충 그림 3A) 다중 채널 이미지에서 채널 분할: 막대에서 이미지 를 선택 메뉴 및 클릭 색상 | 채널 분할. 다른 채널은 별도 이미지 (보충 그림 3B)으로 표시 됩니다.
   2. 병합 단일 이미지 (보충 그림 4A)에서 다시 3 채널: 막대에서 이미지 를 선택 메뉴 및 선택 색상 | 채널 병합. 적절 한 채널을 선택 하 고 확인 (추가 그림 4B)를 누릅니다. 새로운 비 스택 이미지를 있을 것입니다 (추가 그림 4C) 생성.
   3. 동기화 윈도우 도구 (보충 그림 5A)를 사용 하 여 두 개의 창을 동기화: 막대에서 분석 을 선택 메뉴 | 도구 | Windows 동기화. 동기화 이미지 가능성과 새로운 창 (보충 그림 5B) 표시 됩니다.
   4. 두 개의 창으로 동기화 (만 비디오 멀티 채널 이미지가 관련 된 경우), 두 창에 동일한 지역이 잘립니다 수 있습니다. ImageJ 부동 메뉴의 사각형 선택 도구와 관심 영역을 그립니다. 막대에서 이미지 를 선택 메뉴 및 선택 자르기 (보충 그림 6A). 2 자른된 이미지를 개별적으로 표시 됩니다 (보충 그림 6B).
   5. Windows 동기화 관리자에서 모든 Unsynchronize 버튼을 누르면 두 창 (보충 그림 6B) unsynchronize.
5. 마스크 단계 2.4에서 만들지 않은, ImageJ 부동 메뉴의 사각형 선택 도구와 관심 영역을 그립니다.
6. 된 이미지 시퀀스 해당 비디오 디렉토리 (보충 그림 7A) 디렉터리 videoSeq 에 비디오를 저장: 막대에서 파일 선택 메뉴 및 클릭 로 저장 | 이미지 시퀀스... video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (보충 그림 7B)으로 비디오 시퀀스에 대 한 레이블 이름을: 이름 상자에 비디오 로 이름을 변경 하 고 확인을 클릭 합니다. 시퀀스는 성공적으로 U-트랙에 의해 사용 되는 디렉터리에 혼자 있어야 합니다.
   참고: 그렇지 않으면 단계 2.8로 이동 비디오에 대 한 마스크를 설계.
7. 마스크 디자인. 다중 채널 이미지를 선택 하 고 엽니다 세분화 편집기 플러그인 (추가 그림 8A): 바에서 플러그인을 선택 메뉴 및 선택 세분화 | 세그먼트화 편집기입니다. 추가 하 고 세그먼트화 편집기 (보충 그림 8B, C)의 레이블을 마우스 오른쪽 클릭 하 여 필요에 따라 세분화의 레이블 이름을 바꿉니다.
   1. ImageJ 부동 메뉴에서 적절 한 선택 도구를 선택 (여기에서는 자유형) 레이블 (녹색)을 선택 하 고 디자인 먼저 바깥쪽 마스크 (보충 그림 9A). 일단 설계, 복합 창의 선택 옵션에 선택한 마스크 버튼을 누르면 + 뷰어 (보충 그림 9A)에 표시 됩니다. 다음 레이블 (인테리어, 빨간색에서)이이 단계를 반복 (보충 그림 9B).
      참고: 녹색 및 인테리어 레이블에 대 한 마스크를 설계, 후 외관 마스크는 이미지의 나머지 부분을 차지할 것입니다.
   2. 마스크 영역 0, 1, 2,으로 이미지에서 코딩... RGB에서 레이블 순서에 따라 창을 레이블합니다. 모든 마스크 대 한 다른 레이블 설계는 저장할 때 마스크 비디오, 이름 mask.tif (보충 그림 9C)와 같은 파일 이름으로: 바에서 파일 선택 메뉴 및 선택 로 저장 | Tiff....
      참고: 선택한 마스크의 확산 계수 계산 및 궤적 (단계 4.2 참조)의 분류에 채택 될 것입니다.
8. 이 순간 파일 구조는 다음을 확인 하십시오.
   VideoName/video.lif
   VideoName/계열 1/mask.tif
   VideoName/계열 1/ videoSeq / video0000.tif
   VideoName/계열 1/ videoSeq / video0001.tif
   ...
   VideoName/계열 1/ videoSeq / video0499.tif
   VideoName/계열 1/결과
   참고: 단계 2.4와 2.7 설계는 mask.tif 마스크 이미지입니다. video*.tiff 단계 2.6에서 저장 비디오입니다. 위와 같이,에서 이름에 굵게 위의 목록, 즉 고정, 그들은 스크립트에 의해 자행 하는 이름은 때문에이 방법으로 호출할 수 있다. 이름에 대담한 실험 수행에 맞게 변경할 수 있습니다.

3. 추적 입자

1. U-트랙을 사용 하 여 선택한 비디오에서 본 모든 입자를 추적 합니다.
2. Matlab을 열고 설정 경로 사용 하 여 U-트랙 디렉터리 경로를 추가 | 추가 하위 폴더 옵션 메뉴에서. 미래에 실행 Matlab U-트랙의 경로에 경로 저장 합니다. 이 경로 설정을 한 번만 수행 해야 합니다.
3. 분석 하는 시리즈를 포함 하는 디렉터리를 작업 디렉터리를 변경 합니다. 콘솔 (보충 그림 10) movieSelectorGUI 에 입력 하 여 U-트랙을 호출 하 고 enter 키를 누릅니다. 영화 선택 창이 있을 것입니다 열 (보충 그림 11A).
4. 새 영화 버튼 누르고 영화 판 창 (보충 그림 11B) 나타납니다.
5. 추가 채널 (VideoName/계열 1/비디오) 비디오 디렉토리를 선택 하 고 영화 정보 매개 변수를 입력을 누릅니다. 결과 (videoName/계열 1/결과)를 U-트랙의 결과 대 한 출력 디렉터리를 설정 합니다.
   참고: 현미경 및 인수 조건에서 영화 정보 매개 변수를 얻을 수 있습니다.
6. 고급 채널 설정 을 누르고 인수에 관련 된 매개 변수를 입력 합니다. 예제 (보충 그림 11C)에서 매개 변수 값을 찾습니다.
7. 고급 채널 설정 창에 저장 하 고 영화 판 창에서 저장 을 누릅니다. 프로그램 결과 디렉터리에 movieData.mat 라는 파일을 쓰기의 확인에 대 한 물어볼 것입니다. 확인 합니다.
8. 영화를 만든 후 영화 선택 창에서 계속을 누릅니다. U-트랙 분석할 개체의 형식에 대 한 물어볼 것입니다. 단일 입자 (보충 그림 12)를 선택 합니다. 컨트롤 패널 창 (보충 그림 13A) 나타납니다.
   1. 첫 번째 단계를 선택 1 단계: 검색 설정에 키를 누릅니다. 설정 가우스 혼합 모델 피팅 창 (보충 그림 13B) 표시 됩니다. 예제에서는 "지역 배경 가진 비교에 대 한 알파 값" 3 (보충 그림 13B) 0.001과 "롤링 창 시간 평균"로 설정 됩니다.
   2. 설정 가우스 혼합 모델 피팅 창에 적용 및 제어판에서 실행 을 누릅니다. 보충 그림 13에서 구성 검색 단계에만 실행 됩니다. 이 단계는 몇 가지 (2-5) 분을 걸립니다. 1 단계 (감지, 보충 그림 14)의 결과 버튼을 눌러 결과 확인 합니다.
      참고: 위와 같이, 영화 검색 된 입자에 빨간색 동그라미를 보여줍니다. 없는 빨간색 원이 표시 되 면 다음이 단계는 일 하지 제대로.
9. 즉, 여러 프레임에 걸쳐 있는 트랙으로 이전 단계에서 발견 하는 입자를 병합 트랙의 식별을 수행 합니다. 이 2 단계: 추적 U-트랙 설정을 추가 그림 15A-C와 같이 정의할 수 있다. 예제에서 2 단계 비용 함수 설정 프레임 연결 및 간격 닫기, 병합 및 분할 에 대 한 보충 그림 15B와 C, 각각 표시 됩니다.
10. 2 단계에 대 한 매개 변수를 설정한 후 실행 제어판 에서 누르고만 2 단계 실행 (보충 그림 16).
11. 트랙 분석, 3 단계를 수행 합니다. 추가 그림 17 (오른쪽 창)에 표시 된 대로 설정을 정의 합니다. 그런 다음, 설정-모션 분석 및 실행 에서 컨트롤 패널-U-트랙의 패널에 적용 을 누릅니다. 이 단계는 몇 초 걸립니다.
12. 프로세스는 올바르게 모든 트랙 확인 단계 3의 결과 버튼으로 확인 합니다. 이렇게, 쇼 트랙 번호 동영상 옵션 창에 클릭 하 고 각 트랙 되었습니다 프레임별으로 올바르게 식별 (보충 그림 18) 확인. 수동으로 그 입자는 진정한 입자를 주석을.
    참고: 이 수동 선택 되지 않았다면 약한 자동 선택 수행할 수 있습니다 나중 확산 계수 (4 단계 참조)을 계산할 때.

4. 확산 계수 및 궤도의 분류의 계산

1. 모든 스크립트 (예, VideoName/Serie1)에서 분석 되는 비디오의 디렉터리에서 호출 해야 합니다.
2. 확산 계수는 Matlab에서 실행 하 여 명령 콘솔을 계산 하기 위해 모든 궤도 읽기: trajectories=readTrajectories(0.1), 0.1 초 두 연속 프레임 패널 영화 에서처럼 (시간 간격 사이에서 시간을 이다 정보, 보충 그림 11B).
3. 잘못 식별 된 관광 명소/궤도에 대응 하는 궤도 제외 합니다. 제외에 관광 명소의 목록을 줄. 관광 명소 4, 5, 28를 제외 하려면 예를 들어, 입력: 궤도 = readTrajectories (0.1 [4, 5, 28]).
4. 이 셀의 트랙 중 하나에 대 한 즉각적인 확산 계수를 계산 합니다. 이 경우에, 시간 지연에 대 한 확산 계수를 계산 = 4, D_1-4라는. 이렇게, Matlab 콘솔에서 명령을 실행 합니다: D calculateDiffusion = (궤도, 113.88e-3, 0.0015, '알파') 궤도 단계 3, 113.88e에서에서 얻은 궤도 있는-3 미크론에서 획득된 한 이미지의 픽셀 크기는, 0.0015는 아래 설명 된 대로 µ m²/s, 및 '알파'에서 측정 하는 움직이기 힘 드는 입자의 확산 계수에 대 한 상한 장착된 모델입니다.
   참고: 빠른 카메라와 필요를 사용 하는 경우 확산 매개 변수를 계산 하는 더 많은 프레임 증가, 예를 들어 20, 여 D = calculateDiffusion (궤도, 113.88e-3, 0.0015, '알파', ', 20). 20 위, 예에서 전에 문자열 매개 변수 ', 출력 파일에 추가 하는 접미사입니다. 이 접미사는 다른 분석을 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다.
5. 다시 다른 피팅 모드 ('수감', '자유', 또는 '감독')와 함께 calculateDiffusion 함수를 호출 하 여 다른 기능을 가진 MSD를 맞습니다. 이 예제에서 '수감': D = calculateDiffusion (궤도, 113.88e-3, '감 금' 0.0015).
6. 추가 그림 20과 같이 지시 모델 피팅 결과 얻을.
7. 짧고 긴 궤적에는 궤적을 분해. 명령을 사용 하 여: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) 50은 오래 (예제)에서 고려해 야 할 궤적의 프레임에 최소 길이.
8. 4.3 단계에에서 설명 된 동일한 피팅 절차를 사용 하 여 짧은 궤도 연구: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, '지시', '짧은'). 명령으로 짧고 변칙 궤적 분석: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, '알파', '짧은').
9. 그들의 순간 확장 스펙트럼 (MSS)⁷운동의 유형 분류 하 긴 궤적을 분석 합니다. 명령: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, '긴') 화면에 분석을 표시 하 고 trajectoryClassification < 접미사 >.txt 라는 파일을 생성 합니다 디렉터리 results\TrackingPackage\tracks

5. 입자 밀도 통해 클러스터 Ssize의 계산

참고: 모든 스크립트 (예, VideoName/Serie1)에서 분석 되는 비디오의 디렉터리에서 호출 해야 합니다.

1. 그들의 궤적을 따라 각 입자의 농도 분석 합니다. 이렇게, Matlab 콘솔에 입력 하 여 스크립트를 호출: analyzeSpotIntensities로 입력 U-트랙 첫 번째 섹션에 의해 계산 하는 궤도. 가장 기본적인 형태로, 단순히 되 고 분석 (예, VideoName/계열 1) 비디오의 디렉터리에서 모든 인수 없이 스크립트를 호출 analyzeSpotIntensities(). 와 같이 스크립트에 인수를 제공 하 여 여러 가지 방법으로이 기본 동작을 구성: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, Value1, ' Arg2´, Value2,...). 해당 변수 값으로 유효한 인수 ('ArgN´, ValueN) 나열 됩니다.
   1. ('spotRadius´, 1)
      크기 3 x 3 자리 ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)) 중심으로의 패치에 해당 하는 (기본적으로) 1 픽셀의 spotRadius를 사용 하 여 형광 강도 분석.
      참고: 가운데 자리에 5 x 5의 패치는 spotRadius 선택 2, 등등.
   2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      이 인수 (true, 1의 값)을 지정 하는 경우 비디오의 첫 번째 프레임에서 시작 하는 궤도을 분석 합니다. (기본적으로 0, false) 제어 이미지 분석에 유용 합니다.
   3. ('trackTrajectory´, 0)
      이 인수는 0 (false)으로 설정 되어, 경우 (유용 움직이지 관광 명소에 대 한) 모든 프레임에 대 한 첫 번째 프레임에 자리의 좌표를 계속 다음. (기본적으로 1, true) 인수는 1로 설정 하는 경우 다음 자리는 추적 비디오 다음 좌표 계산 따라 U-트랙으로.
   4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      (예제에서 4, 5, 28) 단계 4.3에서 제외 하는 그 궤도의 궤도 수를 포함 합니다.
   5. ('extendTrajectory ´, 1)
      이 인수를 1 (true)로 설정 하는 경우 다음 (궤적 중지 하더라도 이전) 비디오의 끝에 패치에서 강도 분석. 좌표는 궤적 (경우 trackTrajectory)에서 마지막 좌표 또는 궤적에 처음 좌표 (해당 되는 경우 trackTrajectory은 false)입니다. 이 인수는 false (0) 기본적으로.
   6. ('subtractBackground´, 1)
      이 매개 변수를 설정 하는 경우 다음 정확한 원시 형광 측정 각 자리에 그 자리 (아래 참조)에 대 한 배경 형광의 견적. 이 인수는 기본적으로 true (1).
   7. ('meanLength´, 프레임 번호)
      이 매개 변수를 설정 하는 경우 평균 강도 자리 표시 된 길이에서 측정 됩니다. 'MeanLength', 20 20 프레임에서 평균 자리 강도 측정을 설정 합니다. 인수가 설정 되어 있지 않으면 다음 자리 강도 계산 됩니다 전체 궤적 (기본적으로 전체 길이).
   8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      그들의 배경 뿐 아니라 서로 다른 프레임에 따라 강도 프로필을 (기본적으로 0, false), 1이 매개 변수 설정.
      참고: 이 플롯은 보충 그림 21에서 같이 photobleaching를 식별 하기 위해 매우 유용 합니다. 모든 경로 대 한 루틴을 photobleaching 되었습니다 가능한 경우 자동으로 분석 합니다. 이 경로 따라 첫 번째 및 마지막 N 프레임에서 학생의 t와 함께 강도 값을 비교 하 여 이루어집니다. 기본적으로 N은 10, 하지만 인수를 통해이 값을 수정할 수 있는 ' Nbleach´.
   9. ('backgroundMethod´, 값)
      각 명소의 배경을 확인 하려면이 매개 변수를 설정 합니다. 이 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다 및 사용 하 여 어느 선택된 변경 "값" 수 있습니다:
      1. ('backgroundMethod´, 0)
         이 값을 사용 하 여 수동으로 식별 전체 비디오에 대 한 배경. 비디오의 첫 번째 프레임에 있는 8 포인트를 선택할 수 있습니다. 이러한 점 주위 패치 전체 비디오 따라 분석 하 고 이러한 모든 농도의 95% 논집 모든 관광 명소에 대 한 배경 강도로 선택 된다.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
         이 값을 사용 하 여 수동으로 식별 각 프레임에 대 한 배경. 모든 장소와 모든 프레임에 대 한 8 포인트를 선택 합니다. 이것은 시간이 걸리는 작업을 하지만 그것은 사용자에 게 컨트롤을 많이 준다. 이러한 패치 농도의 95% 논집이이 프레임에이 자리에 대 한 배경 강도로 선택 된다.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
         이 값을 계산 하는 각 명소의 배경 8 포인트 인수에 의해 제어 되는 반경 원 자리 주위에 위치에서 추정 하는 사용 ' backgroundRadius´ (기본적으로, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
         먼저 셀 비디오에 찾아서 다음 각 프레임 (보충 그림 22)에 셀의 농도 분석 하 여 각 프레임에 대 한 백그라운드를 계산 하기 위해이 값을 사용 합니다.
         참고: 배경이이 배포판의 주어진된 논집에 회색 값으로 선택 됩니다 (기본적으로 0.5 (= 50%),이 매개 변수는 인수를 통해 제어할 수 있지만 ' backgroundPercentile´,이 값을 설정할 수 있습니다, 예를 들어, 0.9 (= 90%) 경우 원하는 배경으로 고려 될 셀의 대부분. 셀의 식별에 도움이 인수를 사용 하 여 프레임을 따라 예상 최대 배경 값 표시 ' (예를 들어, 모든에서 분석 된 비디오, 배경 값 보통 6000를 넘어) maxBackground´¹³. 기본적으로이 옵션은이 도움말 기본적으로 사용 되지 않습니다 의미 하는 0으로 설정 됩니다. 셀 검출 및 인수를 설정 하 여 배경 추정을 위한 선택 영역 참조 ' showImages´ (언제 든 지 CTRL-C를 눌러 실행 중지) 1.
2. 모든 궤도 각각, 단계 4에 5.1, gatherDiffusion.AndIntensity ()를 사용 하 여 계산에 대 한 확산 및 강도 정보를 수집 합니다. 만 짧은 궤도 대 한 확산 및 강도 정보를 수집 합니다. 이렇게, 단계 4.7 및 형식에서 사용 하는 접미사를 사용 하 여: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) 어디 ' Short´ 단계 4.7에서 사용 하는 접미사입니다.
3. 수집 하는 순간 스펙트럼 확장 및 강도 informationby 입력: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') 어디 '긴'은 접미사 사용 단계 4.7에서. 이 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 모든 파일의 요약 그림 2에 표시 됩니다.

결과

이 프로토콜을 사용 하는 형광 현미경 영화와 그들의 동적 특성의 분석에서 발견 하는 입자의 자동화 된 추적을 허용 한다. 처음, 셀 추적 붙일 결합 단백질으로 페는. SPT 셀 (그림 1)을 정렬 하 여 얻을 수 있는 세포 표면에 수용 체의 적절 한 수준을 제공 합니다. 선택한 셀이이 프로토콜 (보충 비디오 1)에 설명 된 도구로 공부 될 수 있는 ...

토론

설명된 방법을 Matlab 함께 어떤 이전 경험을 필요 없이 수행 하기 쉽습니다. 그러나, Matlab 루틴 매우 다른 명령의 명칭 및 프로그램에 의해 고용 된 다른 폴더의 지역화와 정확성이 필요 합니다. 추적에서 분석 루틴 (3 단계), 여러 개의 매개 변수를 수정할 수 있습니다. "설정 가우스 혼합 모델 피팅" 창 (단계 3.8) U-트랙 비디오에 단일 입자 감지 방법을 제어 합니다. 이 피팅 가우스 혼합 모델

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Jurkat cells	ATCC	CRL-10915	Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator	BioRad		We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands.
Cytomics FC 500 flow cytometer	Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter	Beckman Coulter		Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Recombinant human CXCL12	PeproTech	300928A
Inverted Leica AM TIRF	Leica
EM-CCD camera	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software	Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software			Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism	GraphPad software