JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מציג אסטרטגיה חלופית לשיטה הקונבנציונלית הרעילה האנטי-אנלוגית בזיהוי מפיקי מיתר של חומצות אמינו באמצעות סמנים נדירים-מאוד עשירים להשגת דיוק, רגישות ותפוקה גבוהה בו זמנית.

Abstract

כדי לספק את השוק הצומח אי פעם עבור חומצות אמינו, זנים הייצור ביצועים גבוהים נחוצים. חומצות אמינו מפיקים מאוד מזוהים על ידי רתימת התחרויות בין חומצות אמינו לבין האנלוגיות שלהם. עם זאת, שיטה מבוססת-אנלוגי זו היא בדיוק נמוכה, והאנלוגי המתאים לחומצות אמינו ספציפיות מוגבל. כאן, אנו מציגים אסטרטגיה חלופית המאפשרת הקרנת מדויק, רגיש, תפוקה גבוהה של יצרני מיתר חומצות אמינו באמצעות סמנים נדירים-העשירים. אסטרטגיה זו היא בהשראת התופעה של הטיית השימוש של קודון בתרגום חלבונים, אשר מסווגים ביניהם לבין הנפוצים או נדירים מבוסס על התדרים שלהם של התרחשות ה-DNA קידוד. התרגום של מגנטים נדירים תלוי ב-rnas המקביל (trnas) נדיר שלהם, אשר לא ניתן לטעון במלואה על ידי חומצות אמינו קנצוני מתחת לרעב. באופן תיאורטי, tRNAs נדיר יכול להיות מחויב אם יש עודף של חומצות אמינו לאחר הטעינה של איזומקובלים משותפים נרדף. לכן, תרגומים מפגרים הנגרמים על ידי הקודונים נדירים יכולים להיות משוחזרים על ידי האכלה או הפקות יתר של חומצות האמינו המתאימות. תחת הנחה זו, מערכת בחירה או סינון לזיהוי מפיקי חומצות אמינו מוקמת על ידי החלפת הפחם המשותף של חומצות אמינו ממוקדות עם חלופות נדירות שלהם נרדף גנים עמידות לאנטיביוטיקה או את הגנים הצפנה או חלבונים כרומוגניים. אנו מראים כי ביטויי החלבון יכולים להיות מאוד מפריע בשילוב של הידרודונים נדירים וכי רמות החלבונים לתאם באופן חיובי עם ריכוזי חומצת אמינו. באמצעות מערכת זו, יצרני יתר של חומצות אמינו מרובות יכול להיות מוקרן בקלות מספריות מוטציה. האסטרטגיה הנדירה המבוססת על המחשב מחייבת רק גן אחד שהשתנה, והמארח פחות סביר להימלט מהבחירה מאשר בשיטות אחרות. הוא מציע גישה חלופית להשגת מפיקי יתר של חומצות אמינו.

Introduction

הייצור הנוכחי של חומצות אמינו מסתמך בכבדות על תסיסה. עם זאת, מגדל ותשואות עבור רוב חומצות אמינו זנים הייצור הם מתחת הדרישות העולות של שוק חומצות אמינו גלובלי כי הוא שווה מיליארדי דולרים1,2. קבלת ביצועים גבוהים חומצת אמינו מפיקי הם קריטיים לשדרוג תעשיית חומצת האמינו.

אסטרטגיה מסורתית לזיהוי מפיקי חומצת אמינו מנצלת את התחרויות בין חומצות אמינו לבין האנלוגיות שלהם בסינתזה החלבונים3,4. אנלוגיות אלה מסוגלים לחייב את tRNAs כי להכיר את חומצות אמינו המקביל ובכך לעכב את elongations של רשתות פפטיד, המוביל הצמיחה נעצר או מוות התאים5. דרך אחת להתנגד הלחצים האנלוגיים היא להגביר את ריכוזי חומצות אמינו תאיים. חומצות האמינו המועשרת יתחרו את האנלוגיות עבור tRNAs הסופיים ויבטיחו את הסינתזה הנכונה של חלבונים פונקציונליים. לכן, זנים השורדים את האנלוגיות ניתן לבחור ונוטים להיות מפיקי היתר של חומצות האמינו המתאימות.

למרות שהוא הצליח להצליח בבחירת יצרני מיתר עבור חומצות אמינו כגון L-leucine6, האסטרטגיה מבוסס אנלוגי סובל מחסרונות חמורים. דאגה אחת גדולה היא ההתנגדות האנלוגית מקורו בתהליך של מוטגנזה או באמצעות מוטציות ספונטניות. זנים עם התנגדות יכול להימלט מהבחירה על ידי חסימת, ייצוא, או משפיל את האנלוגיות5. דאגה נוספת היא תופעות הלוואי הרעילות של האנלוגיות על תהליכים סלולריים אחרים7. כתוצאה מכך, זנים השורדים את הבחירה האנלוגית לא יכול להיות חומצות אמינו overproducers, בעוד מפיקי יתר הרצוי יכול להיות מושמד בטעות בשל תופעות לוואי שליליות.

כאן, אסטרטגיה הרומן המבוססת על החוק של קודון הטיה מוצגת על מנת להשיג זהויות מדויקות ומהירה של מפיקים יתר של חומצות אמינו. חומצות אמינו רוב מקודדים על ידי יותר מאשר שלישיה נוקלאוטיד אחד כי הוא המועדף באופן שונה על ידי אורגניזמים המארחים8,9. מספר משתמשים מסוימים משמשים לעתים רחוקות ברצפי הקידוד ומכונים הקודונים נדירים. התרגומים שלהם לתוך חומצות אמינו מסתמכים על trnas קנצוני לשאת את חומצות האמינו המתאימות. עם זאת, tRNAs המכירים בקודונים נדירים יש בדרך כלל הרבה יותר מחולות מאשר tRNAs של הקודונים המשותפים10,11. כתוצאה מכך, tRNAs נדירים אלה פחות סביר ללכוד את חומצות האמינו חינם בתחרויות עם איזוזמינים אחרים, ותרגומים של הרצפים נדיר-codon-עשיר מתחילים להאט או אפילו מסתיימים כאשר כמויות של חומצות אמינו מוגבלות 10. התרגומים יכולים, תיאורטית, להיות משוחזר אם יש עודף חומצת אמינו לאחר הטענת tRNAs משותף נרדף בשל הפקות יתר או ההאכלה נוספת של חומצות אמינו המקביל12. אם הגנטי נדיר-codon-עשיר מקודד בחירה או סמן ההקרנה, זנים המציגות פנוטיפים המתאימים יכול להיות מזוהה בקלות וכנראה המפיקים יתר של חומצות אמינו ממוקדות.

האסטרטגיה הנ ל מיושמת על מנת ליצור מבחר ומערכת הקרנה לזיהוי מפיקי יתר של חומצות אמינו. מערכת הבחירה משתמשת גנים עמידות לאנטיביוטיקה (g., KanR) כמו סמנים בעוד מערכת ההקרנה משתמשת הגנים הקידוד פלורסנט (למשל, חלבון פלורסנט ירוק [gfp]) או כרומוגניים (למשל, פראנצרסגול) חלבונים. הגנים סמן בשתי המערכות משתנים על ידי החלפת מספרים מוגדרים של הקודונים המשותפים עבור חומצת האמינו הממוקדת עם חלופה נדירה נרדפת. זנים בספריית מוטציה כי הנמל הגן נדיר-codon-עשיר סמן בחרו או הוקרן בתנאים הנכונים, ואת מפיקי היתר של חומצות אמינו ממוקדות ניתן לזהות בקלות. זרימת העבודה מתחילה עם בניית מערכת גנטית נדיר codon-עשיר סמן, ואחריו אופטימיזציה של תנאי עבודה, ולאחר מכן זיהוי ואימות של חומצות אמינו מפיקים יתר. זו אסטרטגיה בלתי תלויה אנלוגי מבוסס על הדוגמה בתרגום חלבונים ומאומת למעשה כדי לאפשר זהויות מדויקות ומהירה של מפיקי חומצות אמינו. תיאורטית, זה יכול להיות מועסק ישירות עם חומצות אמינו עם מיקרודונים נדירים ועל כל המיקרואורגניזמים. בסך הכל, האסטרטגיה נדירה-codon מבוסס ישמש חלופה יעילה לגישה המקובלת מבוססי אנלוגי כאשר אנלוגי הנכון עבור חומצות אמינו ספציפיות אינן זמינות, או כאשר שיעור חיובי שווא גבוה הוא הדאגה העיקרית. הפרוטוקול שלהלן משתמש לאוצין נדיר קודון להפגין את האסטרטגיה הזאת בזיהוי es, coli קולי L-לאוצין מפיקי.

Protocol

1. הקמת הפלמידים המבטאים את הגנים הנדירים של הסמן

  1. בחרו גן סימון המכיל מספר מתאים של הקודונים המשותפים לחומצת האמינו הממוקדת.
    הערה: עבור L-לאוצין, הקנאמיצין התנגדות גן , אשר מכיל 29 לוקיונים, שמהם 27 הם משמשים משותפים, משמש לבניית מערכת הבחירה13. הגן gfp , אשר מכיל 17 הגנודונים משותפים מתוך 19 לאוצין לוקיונים, או סגול חלבון קידוד הגנים פראנצרסגול (ppg), אשר הנמלים 14 לאוצין משותף, משמש עבור מערכת ההקרנה (טבלה משלימה 1 ).
  2. החלף את הקודונים המשותפים בגנים הסמן עם הקודון הנדיר הנרדף. עבור L-leucine, להחליף את הקשר שלה ב- kan, gfp, או ppg עם codons נדיר cta, יצירת קןr-rcs, gfp-rc, או ppg-rc, בהתאמה13 ( טבלה משלימה 1).
    הערה: תדירות הקודון הנדירה בגנים הסמן תשפיע על הצפיפות של מערכת הבחירה או ההקרנה. באופן כללי, הגדלת מספר הקודונים הנדירים תגדיל את הדרך של מערכת הבחירה או ההקרנה. כדי להשיג את הבחירה המתאימה או חוזק ההקרנה, לעצב סדרה של גנים סמן כי הנמל מספרים שונים של הקוטדונים נדירים להשוות את ההשפעות שלהם.
  3. ליצור אבני בניין של גנים נדירים-codon עשיר סמן באמצעות כלים כגון גנדיזיין14 (http://54.235.254.95/gd/) עבור סינתזה גנטית. לחלופין, להזמין את הגנים סמן מסחרי שירותי סינתזה הגנים.
    1. בדף ' עיצוב גננט ', בחר באפשרות ' עיצוב אבני בניין ' (חפיפה באורך קבוע).
    2. הדבק את רצפי הגנים הנדירים של הסמן בתיבת הרצף .
    3. הגדירו את אורך החפיפה בין ההרכבה. זכור כי ברירת המחדל 40 bp עובד בסדר עבור רוב רצפים.
      הערה: עיין במדריך המקוון לקבלת הוראות נוספות לגבי ההגדרות של הפרמטרים האחרים.
    4. לחץ על הלחצן אבני בניין עיצוב ולהזמין את האוליונואודים המפורטים בדף.
  4. לסנתז את הגנים נדירים-codon-שונה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוססי סינתזה מדויקת15.
  5. Ligate הנדיר-codon-עשיר קאןR-rc לחיות מחמד וקטור-28a, Gfp-rc ל pSB1C3, ו -ppg-rc ל cpb-37-44116.
    הערה: מפות pET-28a ו-pSB1C3 הינם זמינים במסד הנתונים המקוון SnapGene (טבלה משלימה 1); מפת ה-CPB-37-441 פלאמיד הינה זמינה באתר האינטרנט של החלבון כרומוגניים.
    1. על הקרח, להוסיף את הווקטור ואת שברי סמן ביחס טוחנת של 1:1 כדי 7.5 μL של ערבוב ההרכבה (ראה טבלת חומרים) לנפח כולל של 10 μl. מודאת הדגימה ב50. מעלות צלזיוס לשעה אחת
    2. המרה 5 μL של מוצר ההרכבה לתוך 50 μL של תאים מוכשרים (ראה את הטבלה של חומרים) ב 42 ° c עבור 30 s.
    3. לשחזר את התאים SOC (ציר מיטבי במיוחד עם דיכוי catabolite) בינוני ב 37 ° צ' עבור 1 h, צלחת אותם ב-LB (ציר לילה) אגר בינוני, ו הדגירה אותם ב 37 ° c ללילה.
    4. איחסן את המושבה לתוך מדיום LB ו-דגירה ב 37 ° c עבור 8 h.
    5. בודד את הפלביניים באמצעות ערכת מסחרית מועדפת.

2. מיטוב תנאי הבחירה

  1. הפוך את זן האב המשמש עבור מוטגנזה לתאים מוכשרים17.
  2. לשנות את 50 μl של התאים המוסמכים עם 1 μl של פלאבין כי נושאת את הסוג הפראי קאןr, ולהפוך קבוצה נוספת של התאים המוסמכים עם הפלס1 המכיל את קןr-RC29 עם כל האוצין קודון הוחלף על ידי נדיר .
  3. הוסף 950 μL של SOC בינונית ו-דגירה את המדגם ב שייקר ב 250 rpm ב 37 ° צ' עבור 1 h.
  4. צלחת 100 μL של התרבות התא על LB אגר בינונית המכיל 50 μg · mL-1 kanamycin, ו מודקת אותו ב 37 ° צ' עבור כ 8 h עד המושבות מופיעות.
  5. לבחור את המושבות כי הנמל הפראי סוג של קן ולאוצין נדיר-Codon-עשיר kanR-RC29 ולהשתמש בכל החיסונים 5 מ ל של חמישה מדולל בינונית LB (0.2 x Lb) המכיל 50 μg · mL-1 kanamycin. מודאת דגימות בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c.
    הערה: המדיום הינו חיוני עבור מערכת הבחירה. זה צריך להכיל רק פחמן מספיק חנקן כדי לאפשר ביטוי של חלבון עמידות לאנטיביוטיקה מן הגנים מסוג פראי ולא מן הנגזרים נדירים השתנה-codon. במקרה זה, הריכוז L-leucine ב-1x ליברות בינונית הוא גבוה מדי כדי לעכב לחלוטין את ביטוי החלבון מן הנדיר-codon-עשיר-האור. לפיכך, מדיום LB מדולל עם גורם דילול כגון 5 משמש כדי ליצור הבדל ברור ביטויי חלבון מסוג פראי ואת נדיר codon-עשיר גנים.
  6. העברת 200 μL של כל אחת מתרבויות התא לצלחת 96-באר בטריליטה בנקודות זמן מוגדרות (למשל, 8 h, 16 h, ו 24 שעות). למדוד את OD600 (צפיפות אופטית ב 600 nm) באמצעות קורא צלחת.
    הערה: אם ירידה בתא OD600 לא ניתן לזהות עבור זנים מחסה את הגנים נדירים-קודון-עשיר סמן בהשוואה ל-OD600 של המתח מחסה גנים סמן בסוג פראי, לנסות להגדיל את כמות קודון נדיר ב סמן גנים או להשתמש בינוני מדולל יותר.
  7. לבצע את שיטת האכלה חומצות אמינו כדי לבדוק אם הביטויים של הגנים נדיר-codon עשיר סמן (g., KanR-RC29) ניתן לשחזר על ידי הגברת הריכוז של חומצות אמינו ממוקדות.
    הערה: לבחירת מפיקי היתר של L-leucine, L-leucine משמש להזנה.
    1. איחסן את הזנים מחסה לג R-RC29 סמן גן לתוך 5 מ ל של 0.2 x LB (המכיל 50 μg · mL-1 kanamycin) עם או בלי האספקה של 1 גרם · . א-ל-לאוצין האיחסן אחר 5 מ ל של 0.2 x LB עם זנים כי הנמל הפראי בסוג קןR כמו בקרה. מודאת דגימות בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c.
    2. למדוד את OD600 עבור כל תרבות בנקודות זמן מוגדרות (למשל, 15 h, 17 h, 19 h, ו -22 שעות).

3. מיטוב תנאי ההקרנה

  1. המרה 50 μL של זן האב משמש עבור מוטזיס עם 1 μL של פלאבין (~ 50 ng מסוג · μL-1) שנושאת את הסוג הפראי של gfp או את הפראי- ppg. כמו כן, לשנות את המתח ההורה עם הנגזרים נדירים העשירים של הגנים סמן.
  2. הוסף 950 μL של SOC בינונית ו-דגירה את המדגם ב שייקר ב 250 rpm ב 37 ° צ' עבור 1 h.
  3. צלחת 100 μL של תרבות התא על ליברות אגר בינונית המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה (25 μg · mL-1 כלוראמניול עבור gfp בעלי מרקר בגובה cmR , או 50 μg · ml-1 kanamycin עבור ppg פלסמיד לשאת את הסמן KanR ) ו הדגירה לילה ב 37 ° c.
  4. בחר מושבה אחת כי הנמלים מסוג פראי gfp או ppg ומושבה אחת כי הנמלים המקבילה המקביל נדיר codon-עשיר, ולהעביר אותם 5 מ ל של מדיום מדולל כראוי LB בנפרד. מודאת דגימות בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c.
    הערה: עבור ה-E. coli זנים מחסה לאוצין נדיר-codon-עשיר gfp-rc או ppg-rc, בינונית ליברות הולות דולל (1x lb) ניתן להשתמש כדי ליצור הבדלים משמעותיים בביטויים של סוג פראי ו-נדיר codon-עשיר סמן גנים. גם, inducible יזמים משמשים לכונן את הביטויים של גנים סמן ההקרנה. התחילו בגיוס כאשר התאים מזינים את השלב האקספוננציאלי כדי להשיג מבדיל טוב יותר.
  5. עבור סמנים פלואורסצנט, העבר 200 μl של כל אחת מתרבויות התא לתוך 96-באר שחור התחתית ברורה בטריפליכאט בנקודות זמן מוגדרות (למשל, 2 h, 4 h, ו 6 h). למדוד את OD600 ואת הזריחה ולחשב את עוצמת הקרינה (היחס של הזריחה כדי OD600). לסמני כרומוגניים, מדדו את פיתוח הצבע של תרביות התא.
    הערה: אם עוצמות נמוכות יותר של כוונות זריחה לא ניתן לזהות עבור זנים מחסה gfp-RC בהשוואה לזה של זנים מחסה gfpמסוג פראי, או אם צבע בהיר לא ניתן לזהות עבור תאים המבטאים את החלבון הסגול מ -ppg-RC מאשר מהגן פראי סוג, לנסות להגדיל את מספר קודון נדיר על הגנים סמן או להשתמש בינוני מדולל יותר.
  6. בצע את שיטת ההזנה (ראה שלבים 2.7.1 ו-2.7.2). למדוד את עוצמת הקרינה או את התפתחות הצבע בנקודות זמן מוגדרות (למשל, 12 h, 18 h, ו 24 h).

4. זיהוי מפיקי היתר של חומצת אמינו

  1. איחסן 100 μL של התרבות של המוטציות לתוך 5 מ ל ליברות (2% v/v) ו-דגירה אותו שייקר ב 250 rpm ב 37 ° צ' עד הערכים של OD600 להגיע 0.4.
  2. להפוך את המוטציות. לתאים מוכשרים17
  3. שינוי 50 μL של תאים מוטציה עם 1 μL של הפלבאמצע (~ 50 ng · μL-1) נושאת את סמן בחירה kanR-RC29 או סמנים ההקרנה gfp-rc או ppg-rc. הוסף 950 μL של SOC בינוני וסובב את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס שייקר עבור 1 h.
  4. בחר מפיקי יתר של חומצות אמינו.
    1. צנטריפוגה את תרבות התא ב 4,000 x g עבור 5 דקות, למחוק את supernatant ולהוסיף 5 מ ל של 0.2 x ליברות בינונית המכילה 50 μg · mL-1 kanamycin. מודטה את המדגם ב 37 ° c שייקר לילה.
    2. צלחת התרבות לילה (למשל, 100 μL, תלוי בצפיפות התא של התרבות) על 0.2 x LB אגר בינונית המכילה 50 μg · mL-1 kanamycin ו מארג ב 37 ° צ' עבור 12 h.
      הערה: המושבות שפותחו הן המועמדים של מפיקי חומצת אמינו ממוקדות ובמקרה זה, מפיקי היתר של L-leucine.
  5. . להקרין את מפיקי חומצת האמינו
    1. צלחת את המספר המתאים של תאים (למשל, 100 μL) מחסה את סמן ההקרנה (כמתואר בשלב 4.3) אל ליברות אגר בינונית המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה (25 μg · mL-1 כלוראמניול עבור הקרנה עם GFP-RC ו 50 μg · ml -1 kanamycin עבור הקרנה עם ppg-RC) ו-הדגירה ב 37 ° c עבור 8 h.
    2. איחסן את המדיום LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (ראה שלב 4.5.1) עם כל מושבה אחת מן הצלחת. מודאת דגימות בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c.
    3. למדוד את OD600 ואת הזריחה ולחשב את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית אם GFP-RC משמש. מדדו את פיתוח הצבע של תרביות התא אם נעשה שימוש ב -ppg-RC . שימו לב כי זנים המציגות את עוצמת הזריחה גבוהה יותר או צבע עמוק יותר מאשר זה של זן האב הם חומצות אמינו המועמד מפיקים יתר, במקרה זה, מפיקי היתר L-leucine.
      הערה: מיון התא המופעל על-ידי הקרינה הפלואורסצנטית מתאים גם לזיהוי מפיקים בעלי תא בודד, כאשר הגנים של חלבון הפלורסנט הנדירים משמשים להקרנה.
  6. ודאו שחומצות האמינו מיצרניות. את הזנים של המועמדים
    1. האיחסן 5 מ ל של LB בינונית עם כל אחד מזני המועמדים ולתת לתאים לצמוח לילה בשייקר ב 250 סל ד ב 37 ° c.
    2. לקצור את התאים מ-1 מ ל של תרבות התא על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 2 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה עם 1 מ ל של מים סטריליים.
    3. האיחסן 20 מ ל של M9 בינונית המכילה 4% גלוקוז עם 200 μL של ההשעיה התא ו דגירה ב 250 mL שייקר ב 250 rpm ב 37 ° צ' עבור 24 h.
    4. צנטריפוגה 1 מ ל של מדיום התרבות ב 4,000 x g עבור 5 דקות. העברה 200 μl של סופרנטנט לצינור 1.5 נקי ממדי. הכנת פתרונות L-leucine (כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים) של 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 ו-1 g · . אני-1 כסטנדרט
    5. הוסף 100 μL של 1 מ"מ triethylamine ו 100 μL של 1 מ ' פניקסיל isothiocyanate אל supernatant ואת הסטנדרטים, לערבב אותם בעדינות, ו מקרין אותם בטמפרטורת החדר עבור 1 h18.
      התראה: Triethyine ו פנאיל isothiocyanate יכול לגרום כוויות עור חמורות נזק העין והוא מזיק אם שאפה. לבש כפפות ומסכה, ואם אפשר, בצע את השלב הזה בתוך מכסה המנוע.
    6. הוסף 400 μl של n-הקסאן לאותה צינורית ומערבולת אותו עבור 10 s. לסנן את השלב התחתון המכיל את נגזרות חומצות אמינו באמצעות קרום 0.2 יקרומטר polyטטראואתילן.
      התראה: n-הקסאן יכול לגרום לגירוי בעור. לבש כפפות וביגוד מגן. אם זה בא במגע עם העור, לשטוף את העור עם הרבה מים.
    7. הכנת השלב הנייד A על ידי ערבוב 0.1 M נתרן אצטט (pH 6.5) ו acetonitrile ב 99.3:0.7 יחס נפחי. הכינו את הצ (80% v/v) כשלב נייד B. מסנן את כל השלבים הניידים באמצעות ממברנות הפוליציטיאואתילן של 0.2 יקרומטר.
      התראה: Acetonitrile מזיק אם השאיפה והוא יכול לגרום גירויים בעור ובעיניים. לבש כפפות וביגוד מגן ובצע את הצעד הזה בתוך מכסה המנוע.
    8. הפעל 1 μL של המדגם על בדיקת אולטרה מצויד בעמודה סי18 בהתאם לתוכנית להתחמק בטבלה 1 עם קצב הזרימה של 0.42 mL · min-1 וטמפרטורת עמודה של 40 ° c. לזהות את חומצות אמינו ממוקדות ב 254 ננומטר עם גלאי מערך דיודה ולחשב ריכוזים שלהם על ידי מיפוי אזורי שיא לעיקול רגיל.
זמן (מזערי)שלב נייד A (%)שלב נייד B (%)
0982
3.57030
74357
7.10100
11982

שולחן 1: תוכנית הימנעות עבור כימות של חומצות אמינו.

תוצאות

עבור מערכת הבחירה, ירידה חדה ב-OD600 עבור זנים מעניקה נדיר-codon-עשיר עמידות לאנטיביוטיקה הגן צריך להיות נצפתה בהשוואה למתח מחסה את הגן מסוג פראי התנגדות לאנטיביוטיקה כאשר תרבותי בצורה מתאימה בינונית (איור 1a). תחת אותם התנאים, הירידה בתא OD600 הופך לה?...

Discussion

מספר המקורות הנדירים בגנים הסמן והבחירה או הסינון הם קריטיים לעכב את ביטויי החלבון מהגנים הנדירים של הסמן השונה-codons. אם לא ניתן לזהות הבדל משמעותי בין ביטויי חלבון מן הגנים סמן פראי ונגזרות שלהם, הגדלת מספר החומרים הנדירים או שימוש במדיום מוגבלת מזינים עשוי להגביר את ההבדלים. עם זאת, אם אפ?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

העבודה היתה נתמכת במשותף על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט no. 21676026), המפתח הלאומי R & D תוכנית של סין (להעניק no. 2017YFD0201400), ואת הקרן פוסט דוקטורט בסין (להעניק no. 2017M620643). עבודות במכון לקידום באוניברסיטת UCLA (סאזהאו) תמכו על ידי מענקים פנימיים מפרובינצית ג'יאנגסו ופארק התעשייה סאזהאו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileThermo51101
EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep KitTransgenEM111-01
EasyPure Quick Gel Extraction KitTransgenEG101-01
Gibson assembly master mixNEBE2611S
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideSolarbioI8070
L-leucineSigmaL8000
Microplate readerBiotekSynergy 2
n-hexaneThermoH3061
Phenyl isothiocyanateSigmaP1034
PrancerPurple CPB-37-441ATUMCPB-37-441
TransStar FastPfu Fly DNA polymeraseTransgenAP231-01
TriethylamineSigmaT0886
Ultra-high performance liquid chromatographyAgilent1290 Infinity II
Wild type C. glutamicumATCC13032
XL10-Gold E. coli competent cellAgilent200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 columnAgilent959759-902K

References

  1. Tatsumi, N., Inui, M. . Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).
  2. Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).
  3. Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. . DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).
  4. Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
  5. Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
  6. Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
  7. Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
  8. Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
  9. Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
  10. Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
  11. Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
  12. Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
  13. Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
  14. Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
  15. Xiong, A. -. S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
  16. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
  18. Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
  19. Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
  20. Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
  21. Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
  22. Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
  23. Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
  24. Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
  25. Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
  26. Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
  27. Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
  28. Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
  29. Huo, Y. -. X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148codontRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved