Identificando os produtores de aminoácidos com marcadores ricos em Codon raros

Resumo

Este estudo apresenta uma estratégia alternativa para o método convencional de base analógica tóxica na identificação de superprodutores de aminoácidos usando marcadores raros-Codon-ricos para alcançar precisão, sensibilidade e alta taxa de transferência simultaneamente.

Resumo

Para satisfazer o mercado cada vez maior de aminoácidos, são necessárias cepas de produção de alto desempenho. Os produtores de aminoácidos são identificados convencionalmente, aproveitando as competições entre os aminoácidos e seus análogos. Entretanto, este método analógico-baseado é da baixa exatidão, e os análogos apropriados para ácidos aminados específicos são limitados. Aqui, apresentamos uma estratégia alternativa que possibilita uma triagem precisa, sensível e de alta produtividade de produtores de aminoácidos que usam marcadores raros e ricos em Codon. Esta estratégia é inspirada pelo fenômeno do viés de uso de Codon na tradução de proteínas, para o qual os códons são categorizados em comum ou raros com base em suas freqüências de ocorrência no DNA de codificação. A tradução de raros códons depende de suas RNAs de transferência raras correspondentes (tRNAs), que não podem ser totalmente carregadas pelos aminoácidos cognatos a fome. Teoricamente, os raros tRNAs podem ser cobrados se houver um excedente dos aminoácidos após o carregamento dos isoaceptores comuns sinônimos. Conseqüentemente, as traduções causadas por códons raros podiam ser restauradas alimentando ou superproduçoes intracelular dos aminoácidos correspondentes. esta suposição, um sistema de seleção ou triagem para a identificação de superprodutores de aminoácidos é estabelecido através da substituição dos códons comuns dos aminoácidos alvo com suas alternativas raras sinônimos nos genes de resistência a antibióticos ou os genes codificando proteínas fluorescentes ou cromogênicas. Nós mostramos que as expressões da proteína podem extremamente ser impedidas pela incorporação de códons raros e que os níveis de proteínas correlacionam positivamente com as concentrações do ácido aminado. Usando este sistema, superprodutores de múltiplos aminoácidos podem ser prontamente selecionados a partir de bibliotecas de mutação. Esta estratégia rara-baseada em Codon exige somente um único gene modificado, e o anfitrião é menos provável escapar da seleção do que em outros métodos. Ele oferece uma abordagem alternativa para a obtenção de superprodutores de aminoácidos.

Introdução

A produção atual de aminoácidos depende muito da fermentação. No entanto, os títulos e rendimentos para a maioria das cepas de produção de aminoácidos estão abaixo das demandas crescentes do mercado global de aminoácidos que vale bilhões de dólares^1,2. A obtenção de superprodutores de aminoácidos de alto desempenho é fundamental para a atualização da indústria de aminoácidos.

Estratégia tradicional para identificar produtores de aminoácidos explora as competições entre os aminoácidos e seus análogos na síntese protéica^3,4. Estes análogos são capazes de carregar os tRNAs que reconhecem os aminoácidos correspondentes e, assim, inibir os alongamentos das cadeias peptídicas, levando ao crescimento preso ou morte celular⁵. Uma maneira de resistir às tensões analógicas é aumentar as concentrações de aminoácidos intracelulares. Os aminoácidos enriquecidos irão superar os análogos para os tRNAs finitos e garantir a correta síntese de proteínas funcionais. Conseqüentemente, as tensões que sobrevivem aos análogos podem ser selecionadas e são prováveis os overprodutores dos aminoácidos correspondentes.

Embora tenha sido bem sucedido na seleção de superprodutores de aminoácidos como L-leucina⁶, a estratégia baseada em analógico sofre de inconvenientes graves. Uma grande preocupação é a resistência analógica originada do processo de mutagenese ou através de mutações espontâneas. As cepas com resistência podem escapar da seleção bloqueando, exportando ou degradando os análogos⁵. Outra preocupação é os efeitos colaterais tóxicos dos análogos em outros processos celulares⁷. Como consequência, as cepas que sobrevivem à seleção analógica podem não ser os superprodutores de aminoácidos, enquanto os superprodutores desejados podem ser falsamente exterminados devido aos efeitos colaterais negativos.

Aqui, uma nova estratégia baseada na lei do viés de Codon é apresentada a fim de obter identificações precisas e rápidas de produtores de aminoácidos. A maioria de ácidos aminados são codificados por mais de um Triplet do nucleotide que seja favorecido diferentemente pelos organismos do anfitrião^8,9. Alguns códons raramente são usados nas sequências de codificação e são referidos como os raros códons. Suas traduções em aminoácidos dependem dos tRNAs cognatos que carregam os aminoácidos correspondentes. Entretanto, os tRNAs que reconhecem os códons raros têm geralmente muito mais baixas abundâncias do que os tRNAs dos códons comuns^10,11. Conseqüentemente, estes tRNAs raros são menos prováveis capturar os ácidos aminados livres nas competições com outros isoacceptors, e as traduções das seqüências raro-Codon-ricas começam a desacelerar ou mesmo são terminadas quando as quantidades de ácidos aminados são limitadas ¹⁰. as traduções poderiam, teoricamente, ser restauradas se houver um excedente de aminoácidos após o carregamento dos sinónimo comuns de tRNAs devido a superproduções ou a alimentações extras dos aminoácidos correspondentes¹². Se o gene raro-Codon-rico codifica um marcador de seleção ou de triagem, as cepas que exibem os fenótipos correspondentes podem ser prontamente identificadas e são prováveis os superprodutores dos aminoácidos alvo.

A estratégia acima é aplicada para estabelecer uma seleção e um sistema de triagem para a identificação de superprodutores de aminoácidos. O sistema de seleção usa genes de resistência a antibióticos (por exemplo, Kan^R) como marcadores enquanto o sistema de triagem usa os genes que codificam as proteínas fluorescentes (por exemplo, proteína verde fluorescente [GFP]) ou cromogênica (por exemplo, prancerpurple). Os genes do marcador em ambos os sistemas são modificados substituindo números definidos dos códons comuns para o aminoácido alvejado com sua alternativa rara sinônimo. As tensões na biblioteca da mutação que abrigam o gene raro-Codon-rico do marcador são selecionadas ou examinadas circunstâncias apropriadas, e os overprodutores dos aminoácidos alvejados podem prontamente ser identificados. O fluxo de trabalho começa com a construção do raro-Codon-rico sistema de genes marcador, seguido pela otimização das condições de trabalho, e, em seguida, a identificação e verificação do aminoácido superprodutores. Esta estratégia analógico-independente é baseada no dogma na tradução da proteína e foi verificada praticamente para permitir identificações exatas e rápidas de overprodutores do ácido aminado. Teoricamente, poderia ser diretamente empregado para aminoácidos com códons raros e para todos os microrganismos. Ao todo, a estratégia rara-baseada em Codon servirá como uma alternativa eficiente à abordagem analógica convencional, quando análogos adequados para aminoácidos específicos não estão disponíveis, ou quando uma alta taxa de falsos positivos é a maior preocupação. O protocolo abaixo usa o Codon raro da leucina para demonstrar esta estratégia em identificar os superprodutores de Escherichia coli L-leucina.

Protocolo

1. construção dos plasmís expressando os genes raros-Codon-ricos do marcador

1. Selecione um gene de marcador que contenha um número apropriado de códons comuns para o aminoácido alvo.
   Nota: para a L-leucina, o gene de resistência à kanamicina Kan^R, que contém 29 códons de leucina, dos quais 27 são códons comuns, é utilizado para a construção do sistema de seleção¹³. O gene GFP , que contém 17 códons comuns de 19 códons de leucina, ou o gene prancerpurple (PPG), que abriga 14 codões comuns de leucina, é utilizado para o sistema de triagem (tabela complementar 1 ).
2. Substitua os códons comuns nos genes do marcador com o Codon raro do sinônimo. Para L-leucina, substitua seus códons em Kan^r, GFP, ou PPG com o Codon CTA raro, gerando Kan^r-RCS, GFP-RCou PPG-RC, respectivamente¹³ ( Tabela complementar 1).
   Nota: a frequência do Codon raro nos genes do marcador afetará a rigor da seleção ou do sistema de triagem. Em geral, aumentar o número de códons raros aumentará a stringência do sistema de seleção ou triagem. Para alcançar a seleção adequada ou a força de triagem, projetar uma série de genes marcador que abrigam diferentes números de códons raros e comparar seus efeitos.
3. Gere blocos de construção dos genes marcadores raros-Codon-ricos usando ferramentas tais como GeneDesign¹⁴ (http://54.235.254.95/gd/) para a síntese do gene. Alternativamente, ordem os genes do marcador dos serviços comerciais da síntese de Gene.
   1. Na página GeneDesign, escolha design do bloco de construção (sobreposição de comprimento constante).
   2. Cole as sequências dos genes de marcadores raros-Codon-ricos na caixa de sequência .
   3. Definir o comprimento de sobreposição entre os oligos de montagem; tenha em mente que o padrão 40 BP funciona bem para a maioria das seqüências.
      Nota: consulte o manual online para obter mais instruções sobre as definições dos outros parâmetros.
   4. Clique no botão criar blocos de construção e encomende os oligonucleotídeos listados na página.
4. Sintetizar os genes raros-Codon-modificados pela reacção em cadeia da polimerase (PCR)-baseou a síntese exata¹⁵.
5. Ligate o raro-Codon-rico Kan^R-RC para Vector pET-28A, GFP-RC para pSB1C3, e ppg-RC para CPB-37-441¹⁶.
   Nota: os mapas plasmídeo pET-28A e pSB1C3 estão disponíveis na base de dados de plasmídeo online da SnapGene (tabela complementar 1); o mapa plasmídeo CPB-37-441 está disponível no site da proteína cromogênica do ATUM.
   1. No gelo, adicione o vetor e os fragmentos do marcador em uma relação molar de 1:1 a 7,5 μL de mistura de montagem (ver tabela de materiais) a um volume total de 10 μL. Incubar a amostra a 50 ° c por 1 h.
   2. Transforme 5 μL do produto de montagem em 50 μL de células competentes (ver a tabela de materiais) a 42 ° c por 30 s.
   3. Recupere as células em meio SOC (caldo super ótimo com repressão de Católica) a 37 ° c por 1 h, coloque-as em meio de agar lb (caldo de lisogenia) e incubar-as a 37 ° c durante a noite.
   4. Inocular a colônia em meio LB e incubar a 37 ° c por 8 h.
   5. Isole o plasmídeo usando um kit comercial preferencial.

2. otimizando as condições de seleção

1. Faça a tensão do pai usada para a mutagenese em pilhas competentes¹⁷.
2. Transformar 50 μL das células competentes com 1 μL de plasmídeo que transporta o Wild-Type Kan^r, e transformar outro conjunto de células competentes com o plasmídeo contendo Kan^r-RC29 com todo o Codon de leucina substituído pela rara Codon CTA.
3. Adicionar 950 μL de meio SOC e incubar a amostra num agitador a 250 rpm a 37 ° c durante 1 h.
4. Placa 100 μL da cultura celular para o meio de agar LB contendo 50 μg · mL^-1 de canamicina, e incubar-o a 37 ° c por aproximadamente 8 h até que as colônias apareçam.
5. Escolha as colônias que abrigam o selvagem-tipo Kan^r e a leucina rara-Codon-rico Kan^r-RC29 e use cada um para inocular 5 ml de meio de lb diluído com quíntuplo (0,2 x lb) contendo 50 μg · ml^{-1 de} canamicina. Incubar as amostras numa coqueteleira a 250 rpm a 37 ° c.
   Nota: o meio é crucial para o sistema de seleção. Deve conter apenas bastante carbono e nitrogênio para permitir a expressão da proteína da resistência antibiótica do gene do selvagem-tipo um pouco do que dos derivados raro-Codon-modificados. Neste caso, a concentração de L-leucina em 1x LB médio é muito alta para inibir completamente a expressão protéica do raro-Codon-rico Kan^R. Assim, um meio de LB diluído com um fator de diluição como 5 é usado para gerar uma diferença clara nas expressões protéicas do tipo selvagem e dos genes ricos em Codon raros.
6. Transferir 200 μL de cada uma das culturas de células para uma placa de 96 poços em triplicado em pontos de tempo definidos (por exemplo, 8 h, 16 h e 24 h). Meça o OD₆₀₀ (densidade ótica em 600 nanômetro) usando um leitor da placa.
   Nota: se uma diminuição na pilha OD₆₀₀ não pode ser detectada para as tensões que abrigando os genes raros-Codon-ricos do marcador em comparação com o OD₆₀₀ da tensão que abrigando os genes do selvagem-tipo marcador, tentativa para aumentar a quantidade de Codon raro no genes de marcadores ou utilizar um meio mais diluído.
7. Realize o ensaio de alimentação de aminoácidos para testar se as expressões dos genes de marcadores raros-Codon-ricos (por exemplo, Kan^R-RC29) podem ser restauradas aumentando a concentração dos aminoácidos direcionados.
   Nota: para a selecção de sobreprodutores de L-leucina, a L-leucina é utilizada para a alimentação.
   1. Inocular as estirpes que abriam o gene Kan^R-RC29 Marker em 5 ml de 0,2 x lb (contendo 50 μg · ml^-1 de canamicina) com ou sem o fornecimento de 1 g · L^-1 l-leucina. Inocular outro 5 mL do 0.2 x LB com cepas que abrigam o selvagem-tipo Kan^R como controle. Incubar as amostras numa coqueteleira a 250 rpm a 37 ° c.
   2. Meça o OD₆₀₀ para cada cultura em pontos de tempo definidos (por exemplo, 15 h, 17 h, 19 h, e 22 h).

3. otimizando as condições de triagem

1. Transforme 50 μL da cepa-mãe utilizada para mutagenese com 1 μL de plasmídeo (~ 50 ng · μL^-1) que transporta o GFP do tipo selvagem ou o PPGdo tipo selvagem. Também, transforme a tensão do pai com os derivados raro-Codon-ricos dos genes do marcador.
2. Adicionar 950 μL de meio SOC e incubar a amostra num agitador a 250 rpm a 37 ° c durante 1 h.
3. Placa 100 μL da cultura celular para o meio de agar LB contendo os antibióticos apropriados (25 μg · mL^-1 de cloranfenicol para o plasmídeo GFP carregando um marcador cm^R , ou 50 μg · ml^-1 de canamicina para o PPG plasmídeo carregando um marcador Kan^R ) e incubar durante a noite a 37 ° c.
4. Escolha uma colônia que abriga o Wild-Type GFP ou PPG e uma colônia que abriga o derivado raro Codon-rico correspondente, e transferi-los para 5 ml do meio lb devidamente diluído individualmente. Incubar as amostras numa coqueteleira a 250 rpm a 37 ° c.
   Nota: para cepas de E. coli abrigando a leucina rara-Codon-Rich GFP-RC ou PPG-RC, o meio lb não diluído (1x lb) pode ser usado para criar diferenças significativas nas expressões do Wild-Type e do marcador raro-Codon-rico Genes. Além disso, promotores induzível são usados para conduzir as expressões dos genes marcador de triagem. Comece a indução quando as células entram na fase exponencial para alcançar melhores discriminações.
5. Para marcadores de fluorescência, transfira 200 μL de cada uma das culturas celulares para uma placa preta de fundo transparente de 96 poços em triplicado em pontos de tempo definidos (por exemplo, 2 h, 4 h e 6 h). Meça o OD₆₀₀ e a fluorescência e calcule a intensidade da fluorescência (a relação da fluorescência a OD₆₀₀). Para marcadores cromogênicos, medir o desenvolvimento de cores das culturas de células.
   Nota: se não for possível detectar intensidades de fluorescência inferiores para as estirpes que abriam o GFP-RC em comparação com as estirpes que abriam o GFPdo tipo selvagem, ou se não for possível detectar uma cor mais clara para as células que expressam a proteína roxa do PPG-RC do que do gene do selvagem-tipo, tentativa para aumentar o número de Codon raro nos genes do marcador ou para usar um meio mais diluído.
6. Realize o ensaio de alimentação (ver passos 2.7.1 e 2.7.2). Meça a intensidade da fluorescência ou o desenvolvimento da cor em pontos de tempo definidos (por exemplo, 12 h, 18 h, e 24 h).

4. identificação dos produtores de aminoácidos

1. Inocular 100 μL da cultura dos mutantes em 5 mL de meio LB (2% v/v) e incubar-o num agitador a 250 rpm a 37 ° c até que os valores de OD₆₀₀ alcancem 0,4.
2. Torne os mutantes em células competentes¹⁷.
3. Transforme 50 μL das células mutantes com 1 μL do plasmídeo (~ 50 ng · μL^-1) carregando o marcador de seleção Kan^R-RC29 ou os marcadores de triagem GFP-RC ou PPG-RC. Adicionar 950 μL de meio SOC e rodar a amostra num agitador de 37 ° c durante 1 h.
4. Selecione superprodutores de aminoácidos.
   1. Centrifugue a cultura da pilha em 4.000 x g por 5 minutos, descarte o sobrenadante e adicione 5 ml de meio de 0.2 x LB contendo 50 μg · ml^-1 de kanamycin. Incubar a amostra num agitador de 37 ° c durante a noite.
   2. Placa de cultura durante a noite (por exemplo, 100 μL, depende da densidade celular da cultura) para 0,2 x LB meio agar contendo 50 μg · mL^-1 canamicina e incubar a 37 ° c por 12 h.
      Nota: as colônias desenvolvidas são os candidatos dos produtores de aminoácidos alvejados e, neste caso, os superprodutores de L-leucina.
5. Tela dos produtores de aminoácidos.
   1. Placa o número adequado de células (por exemplo, 100 μL) que abrigando o marcador de triagem (conforme descrito na etapa 4,3) no meio de agar LB contendo o antibiótico apropriado (25 μg · mL^-1 de cloranfenicol para triagem com GFP-RC e 50 μg · ml ^-1 canamicina para triagem com PPG-RC) e incubar a 37 ° c por 8 h.
   2. Inocular o meio LB contendo o antibiótico apropriado (ver passo 4.5.1) com cada colônia única da placa. Incubar as amostras numa coqueteleira a 250 rpm a 37 ° c.
   3. Meça o OD₆₀₀ e a fluorescência e calcule a intensidade da fluorescência se GFP-RC é usado. Meça o desenvolvimento da cor das culturas da pilha se o PPG-RC é usado. Note-se que as estirpes que exibem uma maior intensidade de fluorescência ou uma cor mais profunda do que a estirpe dos pais são os produtores de aminoácidos candidatos e, neste caso, os superprodutores de L-leucina.
      Nota: a triagem de células ativadas por fluorescência também é adequada para identificar os produtores de uma única célula quando os genes de proteínas fluorescentes ricas em Codon são usados para triagem.
6. Verifique as produtividades do aminoácido das cepas candidatas.
   1. Inocular 5 mL de meio LB com cada uma das cepas candidatas e deixar as células crescerem durante a noite em uma coqueteleira a 250 rpm a 37 ° c.
   2. Colher as células a partir de 1 mL da cultura celular por centrifugação em 4.000 x g por 2 min. descarte o sobrenadante e ressuscitem o pellet com 1 ml de água estéril.
   3. Inocular 20 mL de meio M9 contendo 4% de glicose com 200 μL de suspensão celular e incubar num agitador de 250 mL a 250 rpm a 37 ° c durante 24 h.
   4. Centrifugue 1 mL do meio de cultura a 4.000 x g durante 5 min. Transfira 200 μl do sobrenadante para um tubo de 1,5 ml limpo. Preparar soluções de L-leucina (HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência) de 0, 1, 0, 5, 0,1, 0,5 e 1 g · L^-1 como padrões.
   5. Adicionar 100 μL de trietilamina de 1 mM e 100 μL de isotiocianato de 1 M de fenilo ao sobrenadante e os padrões, misture-os suavemente e incubar-os à temperatura ambiente durante 1 h¹⁸.
      Cuidado: a trietilamina e o isotiocianato de fenilo podem causar queimaduras cutâneas graves e danos oculares e são prejudiciais se inalados. Use luvas e uma máscara e, se possível, realize esta etapa em uma capa de fumaça.
   6. Adicionar 400 μL de n-hexano ao mesmo tubo e vórtice para 10 s. filtre a fase inferior contendo os derivados de aminoácidos através de uma membrana de politetrafluoroetileno de 0,2 μm.
      PRECAUÇÃO: n-hexano pode provocar irritação cutânea. Use luvas e roupas protetoras. Se vier em contacto com a pele, enxague a pele com muita água.
   7. Prepare a fase móvel a misturando o acetato do sódio de 0,1 M (pH 6,5) e o acetonitrila em uma relação 99.3:0.7 volumétrica. Prepare o acetonitrila (80% v/v) como a fase móvel B. filtre todas as fases móveis através das membranas do politetrafluoretileno de 0,2 μm.
      Cuidado: o acetonitrila é prejudicial se inalado e pode causar irritações da pele e do olho. Use luvas e roupas protetoras e realize esta etapa em uma capa de fumaça.
   8. Execute 1 μL da amostra em uma ultra-HPLC equipada com uma coluna C18 de acordo com o programa da eluição na tabela 1 com uma taxa de fluxo de 0,42 ml · min^-1 e uma temperatura da coluna de 40 ° c. Detecte os aminoácidos direcionados em 254 nm com um detector de matriz de diodos e Calcule suas concentrações mapeando as áreas de pico para a curva padrão.

Tempo (min)	Fase móvel A (%)	Fase móvel B (%)
0	98	2
3,5	70	30
7	43	57
7,1	0	100
11	98	2

Tabela 1: programa de eluição para quantificação de aminoácidos.

Resultados

Para o sistema de seleção, uma diminuição acentuada no OD₆₀₀ para cepas que abrigando o gene de resistência a antibióticos raro-Codon-rico deve ser observada em comparação com a cepa que abrigando o gene de resistência a antibióticos do tipo selvagem quando cultivado em um adequado médio (Figura 1a). Nas mesmas condições, a diminuição da célula OD₆₀₀ torna-se mais evidente, pois o número de raros códons no gene da resis...

Discussão

O número de códons raros nos genes do marcador e o meio de seleção ou de triagem são críticos para inibir as expressões protéicas dos genes marcadores raros-Codon-modificados. Se não for detectada diferença significativa entre as expressões protéicas dos genes marcadores do tipo selvagem e seus derivados, aumentar o número de códons raros ou usar um meio limitado de nutrientes pode amplificar as diferenças. No entanto, se o efeito de inibição é muito forte, as expressões de proteínas não podem ser re...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Thermo	51101
EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit	Transgen	EM111-01
EasyPure Quick Gel Extraction Kit	Transgen	EG101-01
Gibson assembly master mix	NEB	E2611S
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Solarbio	I8070
L-leucine	Sigma	L8000
Microplate reader	Biotek	Synergy 2
n-hexane	Thermo	H3061
Phenyl isothiocyanate	Sigma	P1034
PrancerPurple CPB-37-441	ATUM	CPB-37-441
TransStar FastPfu Fly DNA polymerase	Transgen	AP231-01
Triethylamine	Sigma	T0886
Ultra-high performance liquid chromatography	Agilent	1290 Infinity II
Wild type C. glutamicum	ATCC	13032
XL10-Gold E. coli competent cell	Agilent	200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column	Agilent	959759-902K