JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Cette étude présente une stratégie alternative à la méthode analogique toxique conventionnelle en identifiant les surproducteurs d'acides aminés en utilisant des marqueurs rares-codon-riches pour atteindre la précision, la sensibilité, et le haut débit simultanément.

Résumé

Pour satisfaire le marché toujours croissant des acides aminés, des souches de production de haute performance sont nécessaires. Les surproducteurs d'acides aminés sont identifiés de façon conventionnelle en exploitant les compétitions entre les acides aminés et leurs analogues. Cependant, cette méthode à base analogique est de faible précision, et les analogues appropriés pour les acides aminés spécifiques sont limités. Ici, nous présentons une stratégie alternative qui permet un criblage précis, sensible, et à haut débit des surproducteurs d'acide aminé utilisant des marqueurs rares-codon-riches. Cette stratégie s'inspire du phénomène du biais d'utilisation du codon dans la traduction des protéines, pour lequel les codons sont classés en codons communs ou rares en fonction de leurs fréquences d'occurrence dans l'ADN codant. La traduction des codons rares dépend de leur ARN de transfert rare correspondant (TRNAs), qui ne peuvent pas être entièrement chargés par les acides aminés cognés sous la famine. Théoriquement, les ARNt rares peuvent être facturés s'il y a un surplus des acides aminés après avoir chargé les isoaccepteurs communs synonymes. Par conséquent, les traductions retardées causées par des codons rares pourraient être restaurées par l'alimentation ou la surproduction intracellulaire des acides aminés correspondants. Selon cette hypothèse, un système de sélection ou de dépistage pour identifier les surproducteurs d'acides aminés est établi en remplaçant les codons communs des acides aminés ciblés par leurs alternatives rares synonymes dans les gènes de résistance aux antibiotiques ou les gènes codage des protéines fluorescentes ou chromogéniques. Nous montrons que les expressions protéiques peuvent être grandement entravées par l'incorporation de codons rares et que les niveaux de protéines sont en corrélation positive avec les concentrations d'acides aminés. Grâce à ce système, les surproducteurs d'acides aminés multiples peuvent être facilement éliminés des bibliothèques de mutation. Cette stratégie à base de codon rare ne nécessite qu'un seul gène modifié, et l'hôte est moins susceptible d'échapper à la sélection que dans d'autres méthodes. Il offre une approche alternative pour obtenir des surproducteurs d'acides aminés.

Introduction

La production actuelle d'acides aminés repose fortement sur la fermentation. Cependant, les titers et les rendements de la plupart des souches de production d'acides aminés sont inférieurs à la demande croissante du marché mondial des acides aminés qui vaut des milliards de dollars1,2. L'obtention de surproducteurs d'acides aminés de haute performance est essentielle à la mise à niveau de l'industrie des acides aminés.

La stratégie traditionnelle pour identifier les surproducteurs d'acides aminés exploite les compétitions entre les acides aminés et leurs analogues dans la synthèse des protéines3,4. Ces analogues sont capables de charger les ARNt qui reconnaissent les acides aminés correspondants et inhibent ainsi les allongements des chaînes peptidiques, conduisant à la croissance arrêtée ou la mort cellulaire5. Une façon de résister aux contraintes analogiques est d'augmenter les concentrations d'acides aminés intracellulaires. Les acides aminés enrichis surpasseront les analogues pour les tARN finis et assureront la synthèse correcte des protéines fonctionnelles. Par conséquent, les souches qui survivent aux analogues peuvent être sélectionnées et sont probablement les surproducteurs des acides aminés correspondants.

Bien qu'elle ait réussi à sélectionner des surproducteurs pour des acides aminés tels que l'alucine6, la stratégie analogique souffre de graves inconvénients. Une préoccupation majeure est la résistance analogique provenant du processus de mutagénèse ou par des mutations spontanées. Les souches avec résistance peuvent échapper à la sélection en bloquant, en exportant ou en dégradant les analogues5. Une autre préoccupation est les effets secondaires toxiques des analogues sur d'autres processus cellulaires7. En conséquence, les souches qui survivent à la sélection analogique peuvent ne pas être les surproducteurs d'acides aminés, tandis que les surproducteurs désirés pourraient être faussement exterminés en raison des effets secondaires négatifs.

Ici, une nouvelle stratégie basée sur la loi du biais de codon est présentée afin d'obtenir des identifications précises et rapides des surproducteurs d'acides aminés. La plupart des acides aminés sont codés par plus d'un triplet nucléotide qui est favorisé différemment par les organismes hôtes8,9. Certains codons sont rarement utilisés dans les séquences de codage et sont appelés les codons rares. Leurs traductions en acides aminés s'appuient sur les tARN cognate qui portent les acides aminés correspondants. Cependant, les ARTN qui reconnaissent les codons rares ont généralement des abondances beaucoup plus faibles que les ARNt des codons communs10,11. Par conséquent, ces ARN rares sont moins susceptibles de capturer les acides aminés libres dans les compétitions avec d'autres isoacceptateurs, et les traductions des séquences rares-codon-riches commencent à décélérer ou même sont terminées lorsque les quantités d'acides aminés sont limitées 10. Les traductions pourraient, théoriquement, être restaurées s'il y a un excédent d'acide aminé après avoir chargé les ARTN communes synonymes en raison de surproductions ou d'alimentations supplémentaires des acides aminés correspondants12. Si le gène rare-codon-riche code un marqueur de sélection ou de criblage, les souches présentant les phénotypes correspondants peuvent alors être facilement identifiées et sont probablement les surproducteurs des acides aminés visés.

La stratégie ci-dessus est appliquée pour établir une sélection et un système de dépistage pour l'identification des surproducteurs d'acides aminés. Le système de sélection utilise des gènes de résistance aux antibiotiques (p. ex., kanR) comme marqueurs tandis que le système de dépistage utilise les gènes codant les protéines fluorescentes vertes (p. ex. protéines fluorescentes vertes [GFP]) ou chromogéniques (p. ex., PrancerPurple). Les gènes marqueurs dans les deux systèmes sont modifiés en remplaçant les nombres définis des codons communs pour l'acide aminé ciblé avec son alternative rare synonyme. Les souches de la bibliothèque de mutation qui abritent le gène marqueur rare-codon-riche sont sélectionnées ou examinées dans des conditions appropriées, et les surproducteurs des acides aminés ciblés peuvent être facilement identifiés. Le flux de travail commence par la construction du système génétique marqueur rare-codon-riche, suivi par l'optimisation des conditions de travail, puis l'identification et la vérification des surproducteurs d'acide aminé. Cette stratégie analogue-indépendante est basée sur le dogme dans la traduction de protéine et a été pratiquement vérifiée pour permettre l'identification précise et rapide des surproducteurs d'acide aminé. Théoriquement, il pourrait être directement utilisé pour les acides aminés avec des codons rares et à tous les micro-organismes. Dans l'ensemble, la stratégie basée sur le codon rare servira de solution de rechange efficace à l'approche analogique conventionnelle lorsque les analogues appropriés pour des acides aminés spécifiques ne sont pas disponibles, ou lorsqu'un taux de faux positifs élevé est la principale préoccupation. Le protocole ci-dessous utilise le codon rare de leucine pour démontrer cette stratégie en identifiant les surproducteurs de L-leucine d'Escherichia coli.

Protocole

1. Construction des plasmides exprimant les gènes marqueurs rares-codon-riches

  1. Sélectionnez un gène marqueur qui contient un nombre approprié de codons communs pour l'acide aminé ciblé.
    REMARQUE: Pour l'élucine, le gène de résistance à la kanamycine kanR, qui contient 29 codons de leucine, dont 27 sont des codons communs, est utilisé pour la construction du système de sélection13. Le gène gfp, qui contient 17 codons communs sur 19 codons de leucine, ou le gène pourpre codant en protéines prancerpurple (ppg), qui abrite 14 codons communs de leucine, est utilisé pour le système de criblage (tableausupplémentaire 1 ).
  2. Remplacez les codons communs dans les gènes marqueurs par le codon rare synonyme. Pour L-leucine, remplacer ses codons en kanR, gfp, ou ppg avec le codon rare CTA, générant kanR-Rcs, gfp-RC, ou ppg-RC, respectivement13 ( Tableau supplémentaire 1).
    REMARQUE : La fréquence du codon rare dans les gènes marqueurs affectera la rigueur du système de sélection ou de dépistage. En général, l'augmentation du nombre de codons rares augmentera la rigueur du système de sélection ou de dépistage. Pour atteindre la force de sélection ou de criblage appropriée, concevez une série de gènes marqueurs qui hébergent différents nombres de codons rares et comparez leurs effets.
  3. Générer des blocs de construction des gènes marqueurs rares-codon-riches utilisant des outils tels que GeneDesign14 (http://54.235.254.95/gd/) pour la synthèse de gène. Vous pouvez également commander les gènes marqueurs des services commerciaux de synthèse génétique.
    1. Sur la page GeneDesign, choisissez la conception du bloc de construction (chevauchement de longueur constante).
    2. Coller les séquences des gènes marqueurs rares-codon-riches dans la boîte de séquence.
    3. Définir la longueur de chevauchement entre les oligos d'assemblage; gardez à l'esprit que le par défaut 40 bp fonctionne très bien pour la plupart des séquences.
      REMARQUE: Voir le manuel en ligne pour plus d'instructions sur les paramètres des autres paramètres.
    4. Cliquez sur le bouton Blocs de construction Design et commandez les oligonucléotides répertoriés sur la page.
  4. Synthétiser les gènes modifiés par polyminase par réaction en chaîne polymérase (PCR) à base de synthèse précise15.
  5. Ligate le rare-codon-riche kanR-RC à vector pET-28a, gfp-RC à pSB1C3, et ppg-RC à CPB-37-44116.
    REMARQUE : Les cartes plasmides pET-28a et pSB1C3 sont disponibles sur la base de données SnapGene en ligne sur le plasmide (tableausupplémentaire1); la carte du plasmide CPB-37-441 est disponible sur le site Web des protéines chromogéniques ATUM.
    1. Sur la glace, ajouter le vecteur et les fragments de marqueur dans un rapport molaire de 1:1 à 7,5 L de mélange d'assemblage (voir Tableau des matériaux)à un volume total de 10 l. Incuber l'échantillon à 50 oC pendant 1 h.
    2. Transformer 5 ll du produit d'assemblage en 50 l de cellules compétentes (voir la Table des Matériaux) à 42 oC pour 30 s.
    3. Récupérer les cellules dans soC (super bouillon optimal avec répression catabolite) moyen à 37 oC pendant 1 h, les plaquer sur LB (bouillon de lysogénie) milieu d'agar, et les incuber à 37 oC pendant la nuit.
    4. Inoculer la colonie en LB moyen et incuber à 37 oC pendant 8 h.
    5. Isolez le plasmide à l'aide d'un kit commercial préféré.

2. Optimiser les conditions de sélection

  1. Faire de la souche parente utilisée pour la mutagénèse en cellules compétentes17.
  2. Transformez 50 L des cellules compétentes avec 1 l de plasmide qui porte le kanRsauvage, et transformez un autre ensemble de cellules compétentes avec le plasmide contenant kanR-RC29 avec tout codon de leucine remplacé par le rare codon CTA.
  3. Ajouter 950 oL de SOC moyen et incuber l'échantillon dans un shaker à 250 tr/min à 37 oC pendant 1 h.
  4. Plaque 100 l de la culture cellulaire sur le milieu d'agar LB contenant 50 'g'mL-1 kanamycin, et l'incuber à 37 oC pendant environ 8 h jusqu'à ce que des colonies apparaissent.
  5. Choisissez les colonies qui abritent le kanR de type sauvage et le kan R-RC29, riche en codons rares, et utilisez chacune pour inoculer 5 ml de milieu LB dilué par cinq (0,2x LB) contenant 50 'g'mL-1 kanamycine. Incuber les échantillons dans un shaker à 250 tr/min à 37 oC.
    REMARQUE : Le support est crucial pour le système de sélection. Il devrait contenir juste assez de carbone et d'azote pour permettre l'expression de la protéine de résistance aux antibiotiques du gène de type sauvage plutôt que des dérivés modifiés par le codon rare. Dans ce cas, la concentration de L-leucine dans le milieu 1x LB est trop élevée pour inhiber complètement l'expression de protéine du kanRrare-codon-riche. Ainsi, un milieu LB dilué avec un facteur de dilution tel que 5 est utilisé pour générer une nette différence dans les expressions protéiques du type sauvage et les gènes rares-codon-riches.
  6. Transférer 200 l de chacune des cultures cellulaires dans une plaque de 96 puits en triplette à des moments définis (p. ex. 8 h, 16 h et 24 h). Mesurer l'OD600 (densité optique à 600 nm) à l'aide d'un lecteur de plaque.
    REMARQUE : Si une diminution de la cellule OD600 ne peut pas être détectée pour les souches hébergeant les gènes marqueurs rares-codon-riches en comparaison de l'OD600 de la souche hébergeant les gènes de marqueur sauvage-type, essayez d'augmenter la quantité de codon rare dans le gènes marqueurs ou utiliser un milieu plus dilué.
  7. Effectuer l'analyse d'alimentation en acides aminés pour tester si les expressions des gènes marqueurs rares-codon-riches (par exemple, kanR-RC29) peuvent être restaurées en augmentant la concentration des acides aminés ciblés.
    REMARQUE : Pour la sélection des surproducteurs de L-leucine, la L-leucine est utilisée pour l'alimentation.
    1. Inoculer les souches hébergeant le gène marqueur kan R-RC29 en 5 ml de la LB de 0,2x (contenant 50 'g'mL-1 kanamycine) avec ou sans l'approvisionnement de 1 g L-1 L-leucine. Inoculer un autre 5 ml de la LB 0,2x avec des souches qui abritent le kanR de type sauvage comme contrôle. Incuber les échantillons dans un shaker à 250 tr/min à 37 oC.
    2. Mesurer l'OD600 pour chaque culture à des moments définis (p. ex. 15 h, 17 h, 19 h et 22 h).

3. Optimiser les conditions de dépistage

  1. Transformez 50 L de la souche parente utilisée pour la mutagénèse avec 1 l de plasmide (50 ng-L-1) qui porte le gfp de type sauvage ou le ppgde type sauvage. En outre, transformer la souche parente avec les dérivés rares-codon-riches des gènes de marqueur.
  2. Ajouter 950 oL de SOC moyen et incuber l'échantillon dans un shaker à 250 tr/min à 37 oC pendant 1 h.
  3. Plaque 100 l de la culture cellulaire sur le milieu d'agar LB contenant les antibiotiques appropriés (25 chloramphenicolde gfp portant un marqueur Cm R, ou 50 'g'mL-1 kanamycin pour le ppg plasmide portant un marqueur KanR) et incuber toute la nuit à 37 oC.
  4. Choisissez une colonie qui abrite le gfp ou le ppg de type sauvage et une colonie qui abrite le dérivé correspondant riche en codon rare, et transférez-les à 5 ml du milieu LB correctement dilué individuellement. Incuber les échantillons dans un shaker à 250 tr/min à 37 oC.
    REMARQUE : Pour les souches de E. coli hébergeant la leucine gfp-RC ou ppg-RC,le milieu LB non dilué (1x LB) peut être utilisé pour créer des différences significatives dans les expressions du type sauvage et du marqueur rare-codon-riche Gènes. En outre, les promoteurs inductibles sont utilisés pour conduire les expressions des gènes marqueurs de dépistage. Commencer l'induction lorsque les cellules entrent dans la phase exponentielle pour obtenir de meilleures discriminations.
  5. Pour les marqueurs de fluorescence, transférez 200 l l de chacune des cultures cellulaires dans une plaque noire à fond clair de 96 puits en triplette à des moments définis (p. ex. 2 h, 4 h et 6 h). Mesurer l'OD600 et la fluorescence et calculer l'intensité de fluorescence (le rapport de fluorescence à OD600). Pour les marqueurs chromogéniques, mesurez le développement des couleurs des cultures cellulaires.
    REMARQUE : Si des intensités de fluorescence plus faibles ne peuvent pas être détectées pour les souches hébergeant le gfp-RC par rapport à celle des souches abritant le gfpsauvage, ou si une couleur plus claire ne peut pas être détectée pour les cellules exprimant la protéine pourpre du ppg-RC que du gène de type sauvage, essayez d'augmenter le nombre de codons rares sur les gènes marqueurs ou utilisez un milieu plus dilué.
  6. Effectuez le résultat d'alimentation (voir les étapes 2.7.1 et 2.7.2). Mesurer l'intensité de la fluorescence ou le développement des couleurs aux points de temps définis (p. ex., 12 h, 18 h et 24 h).

4. Identification des surproducteurs d'acides aminés

  1. Inoculer 100 oL de la culture des mutants en 5 ml de milieu LB (2 % v/v) et l'incuber dans un shaker à 250 tr/min à 37 oC jusqu'à ce que les valeurs de l'OD600 atteignent 0,4.
  2. Faire les mutants dans les cellules compétentes17.
  3. Transformez 50 L des cellules mutantes avec 1 l du plasmide (50 ng-L-1) portant le marqueur de sélection kanR-RC29 ou les marqueurs de dépistage gfp-RC ou ppg-RC. Ajouter 950 oL de soC moyen et faire pivoter l'échantillon dans un shaker de 37 oC pendant 1 h.
  4. Sélectionnez les surproducteurs d'acides aminés.
    1. Centrifuger la culture cellulaire à 4 000 x g pendant 5 min, jeter le supernatant et ajouter 5 ml de milieu LB de 0,2 x LB contenant 50 'g'mL-1 kanamycine. Incuber l'échantillon dans un shaker de 37 oC pendant la nuit.
    2. Plaquer la culture de la nuit (p. ex., 100 l, dépend de la densité cellulaire de la culture) sur un milieu d'agar LB de 0,2 x LB contenant 50 'g'mL-1 kanamycine et incuber à 37 oC pendant 12 h.
      REMARQUE : Les colonies développées sont les candidats des surproducteurs ciblés d'acide aminé et, dans ce cas, les surproducteurs de L-leucine.
  5. Filtrer les surproducteurs d'acides aminés.
    1. Plaquer le nombre approprié de cellules (p. ex., 100 l) hébergeant le marqueur de dépistage (tel que décrit à l'étape 4.3) sur le milieu d'agar LB contenant l'antibiotique approprié (25 'g-mL-1 chloramphenicol pour le criblage avec gfp-RC et 50 'g'mL -1 kanamycine pour le dépistage avec ppg-RC) et incuber à 37 oC pendant 8 h.
    2. Inoculer le milieu LB contenant l'antibiotique approprié (voir l'étape 4.5.1) avec chaque colonie de la plaque. Incuber les échantillons dans un shaker à 250 tr/min à 37 oC.
    3. Mesurez l'OD600 et la fluorescence et calculez l'intensité de fluorescence si le gfp-RC est utilisé. Mesurer le développement des couleurs des cultures cellulaires si ppg-RC est utilisé. Notez que les souches présentant une intensité de fluorescence plus élevée ou une couleur plus profonde que celle de la souche parente sont les surproducteurs d'acides aminés candidats et, dans ce cas, les surproducteurs de L-leucine.
      REMARQUE : Le tri cellulaire activé par la fluorescence convient également à l'identification des producteurs à haute cellule unique lorsque les gènes de protéines fluorescentes riches en codon rare sont utilisés pour le dépistage.
  6. Vérifier les produits d'acide aminé des souches candidates.
    1. Inoculer 5 ml de milieu LB avec chacune des souches candidates et laisser les cellules se développer pendant la nuit dans un shaker à 250 tr/min à 37 oC.
    2. Récolter les cellules à partir de 1 ml de la culture cellulaire par centrifugation à 4 000 x g pendant 2 min. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille avec 1 ml d'eau stérile.
    3. Inoculer 20 ml de milieu M9 contenant 4 % de glucose avec 200 l de la suspension cellulaire et couver dans un shaker de 250 ml à 250 tr/min à 37 oC pendant 24 h.
    4. Centrifugeuse 1 ml du milieu de culture à 4 000 x g pendant 5 min. Transférer 200 l du supernatant dans un tube propre de 1,5 mL. Préparer des solutions L-leucine (HPLC (chromatographie liquide haute performance) de 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 et 1 g L-1 comme normes.
    5. Ajouter 100 l de 1 mm de triéthylamine et 100 l d'isothiocyanate de phényl à l'isothiocyanate de phényl au supernatant et aux normes, mélangez-les doucement, et incubez-les à température ambiante pendant 1 h18.
      CAUTION: Triethylamine et l'isothiocyanate de phényl peuvent causer de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires et est nocif s'il est inhalé. Portez des gants et un masque et, si possible, effectuez cette étape dans une hotte de fumée.
    6. Ajouter 400 oL de n-hexane au même tube et le vortex pendant 10 s. Filtrer la phase inférieure contenant les dérivés de l'acide aminé à travers une membrane de polytétrafluoroéthylène de 0,2 m.
      CAUTION: n-hexane peut causer une irritation de la peau. Portez des gants et des vêtements de protection. S'il entre en contact avec la peau, rincez la peau avec beaucoup d'eau.
    7. Préparer la phase A mobile en mélangeant 0,1 M d'acétate de sodium (pH 6,5) et l'acétonitrile dans un rapport volumétrique de 99,3:0,7. Préparer l'acétonitrile (80 % v/v) en tant que phase B mobile. Filtrer toutes les phases mobiles à travers des membranes polytétrafluoroéthylène de 0,2 m.
      CAUTION: L'acétonitrile est nocif s'il est inhalé et peut causer des irritations de la peau et des yeux. Portez des gants et des vêtements de protection et effectuez cette étape dans une hotte de fumée.
    8. Exécuter 1 ll de l'échantillon sur une colonne ultra-HPLC équipée d'une colonne C18 selon le programme d'élution du tableau 1 avec un débit de 0,42 mL-min-1 et une température de colonne de 40 oC. Détecter les acides aminés ciblés à 254 nm avec un détecteur de tableau de diodes et calculer leurs concentrations en cartographiant les zones de pointe à la courbe standard.
Temps (min)Phase A mobile (%)Phase B mobile (%)
0 (en)98 Annonces2 (en)
3,5 Annonces70 Ans et plus30 Ans, états-unis (
7 Annonces43 Ans, états-unis (57 Annonces
7,1 Annonces0 (en)100 ans
11 Ans, états-unis (98 Annonces2 (en)

Tableau 1 : Programme d'élution pour la quantification des acides aminés.

Résultats

Pour le système de sélection, une forte diminution de l'OD600 pour les souches abritant le gène de résistance aux antibiotiques rare-codon-riche devrait être observée par rapport à la souche hébergeant le gène de résistance aux antibiotiques de type sauvage lorsqu'il est cultivé dans un approprié moyen (Figure 1a). Dans les mêmes conditions, la diminution de la cellule OD600 devient plus évidente à mesure que le nombre de ...

Discussion

Le nombre de codons rares dans les gènes marqueurs et le milieu de sélection ou de dépistage sont essentiels pour inhiber les expressions protéiques des gènes marqueurs modifiés par le codon rare. Si aucune différence significative ne peut être détectée entre les expressions protéiques des gènes marqueurs de type sauvage et leurs dérivés, l'augmentation du nombre de codons rares ou l'utilisation d'un milieu à teneur en nutriments peut amplifier les différences. Cependant, si l'effet d'inhibition est trop ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les travaux ont été soutenus conjointement par la National Natural Science Foundation of China (subvention no 21676026), le National Key R-D Program of China (grant no 2017YFD0201400) et la China Postdoctoral Science Foundation (subvention no 2017M620643). Les travaux de l'UCLA Institute of Advancement (Suzhou) ont été soutenus par les subventions internes de la province du Jiangsu et du parc industriel de Suzhou.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileThermo51101
EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep KitTransgenEM111-01
EasyPure Quick Gel Extraction KitTransgenEG101-01
Gibson assembly master mixNEBE2611S
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideSolarbioI8070
L-leucineSigmaL8000
Microplate readerBiotekSynergy 2
n-hexaneThermoH3061
Phenyl isothiocyanateSigmaP1034
PrancerPurple CPB-37-441ATUMCPB-37-441
TransStar FastPfu Fly DNA polymeraseTransgenAP231-01
TriethylamineSigmaT0886
Ultra-high performance liquid chromatographyAgilent1290 Infinity II
Wild type C. glutamicumATCC13032
XL10-Gold E. coli competent cellAgilent200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 columnAgilent959759-902K

Références

  1. Tatsumi, N., Inui, M. . Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).
  2. Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).
  3. Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. . DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).
  4. Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
  5. Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
  6. Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
  7. Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
  8. Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
  9. Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
  10. Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
  11. Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
  12. Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
  13. Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
  14. Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
  15. Xiong, A. -. S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
  16. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
  18. Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
  19. Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
  20. Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
  21. Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
  22. Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
  23. Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
  24. Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
  25. Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
  26. Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
  27. Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
  28. Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
  29. Huo, Y. -. X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

BiochimieNum ro 148acide aminsurproducteurcodon raretRNAtraductiond pistages lectionprot ines fluorescentesprot ines chromog niquesg ne de r sistance aux antibiotiques

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.