JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים את הדור, יישום של קבוצת הטרנסגניים תודרנית לבנה קווי המאפשרת ביטוי inducible, רקמות ספציפיות את meristems הראשי שלוש, את meristem apical לירות, meristem apical את שורש ו את cambium.

Abstract

הביטוי inducible, רקמות ספציפיות הוא כלי חשוב ורב עוצמה כדי ללמוד את הדינמיקה-עתיים של ההפרעות גנטיות. שילוב של GreenGate גמיש ויעיל שכפול מערכת במערכת מוכחות, benchmarked LhGR (הנקרא כאן GR-LhG4) עבור הביטוי inducible, יש לנו שנוצר הטרנסגניים קווים תודרנית שיכולים להביא את הביטוי אפקטור קלטות במגוון של סוגי תאים מסוים ב- meristems שלוש המפעל הראשי. למטרה זו, בחרנו את המערכת GR-LhG4 בעבר מפותח בהתבסס על פקטור שעתוק chimeric מקדם cognate פופ-סוג להבטיח שליטה הדוקה על מגוון רחב של רמות הביטוי. בנוסף, כדי להמחיש את התחום ביטוי איפה הפעיל הפקטור שעתוק סינתטי, כתב פלורסנט מותאמת לשפות אחרות ER mTurquoise2 תחת שליטה של האמרגן pOp4 או pOp6 מקודד בקווים הנהג. כאן, אנו מתארים את השלבים הנחוצים ליצור קו הנהג או אפקטור ומדגימים איך ביטוי ספציפי של סוג התא יכול להיות המושרה ועקבתי meristem apical את הצילומים, meristem apical את השורש, את cambium של תודרנית. באמצעות מספר או כל מנהל קווים, ההשפעה הספציפית בהקשר לביטוי אחד או גורמים רבים (effectors) תחת שליטה של האמרגן סינתטי פופ יכול להיות מוערך במהירות, לדוגמה בצמחים F1 של הכלאה בין אפקטור אחד מרובה מנהל ההתקן של קווים. גישה זו היא דוגמה לביטוי חוץ רחמי של VND7, גורם שעתוק NAC מסוגל גרימת התצהיר קיר חוץ רחמי משני תאים באופן אוטונומיים תא.

Introduction

מגבלה משמעותית בביולוגיה בעידן postgenomic הוא לפענח את התפקיד בהקשר ספציפי של גורם מסוים או ההפרעות גנטיות. מכוננת לפליטת גנטיות כגון אובדן-של-פונקציה ופונקציה רווח-של גישות אפשר לעתים קרובות רק מובילים ניתוח של תהליכי הסתגלות חיים ארוך, טשטוש ההבחנה בין אפקטים ראשיים ומשניים. בנוסף, פונקציות ספציפיות בהקשר יכול להיות רעולי פנים או מדולל על ידי תופעות בקנה מידה גדול ברקמות מרוחק או במהלך בשלבים אחרים של פיתוח. יתר על כן, במקרים קיצוניים, lethality יכול למנוע כל תובנה מכניסטית. באופן אידיאלי, כדי לעקוף בעיות אלה, אחד יכול לנתח את השפעת ההפרעות גנטיות חריפה בתוך הקשר מסוים כגון סוג תא מסוים באופן זמן לפתור. כדי להשיג זאת, כלים גנטיים לביטוי ייחודיים לסוג התא inducible, הם נדרשים1. כדי לספק משאב להערכה מהירה של תגובה אפקטור נתון הדינמיקות ייתכן, שילבנו להקל על שיבוט שמספק את מערכת GreenGate2 עם יעילות מוכחת של מערכת GR-LhG43, 45,,6. יש לנו שנוצר קווים לבטא את הפקטור שעתוק chimeric ש-lhg4 התמזגו איגוד ליגנד לתחום של עכברוש corticoid קולטן (גר)7 תחת השליטה של התא מאופיין היטב סוג ספציפי היזמים8. ב נח תנאים, הגורם שעתוק נשאר מחוץ לגרעין, כמו התחום GR נמדד על ידי HSP90 cytosolic. עם התוספת של דקסאמתאזון ליגנד סינתטי (דקס), רוברטסונית גרעיני מושרה ולסיים LhG4 תמלול קלטות ביטוי תחת שליטה של מקדם cognate סינתטי מסוג pOp , כגון כתב mTurquoise2 כולל הקווים הנהג כדי להמחיש את התחום ביטוי לאחר אינדוקציה.  לפיכך, הקווים הנהג טכנית מכילים גם של קלטת אפקטור. המעבר של הנהג קווים עם שורת נושא של קסטה אפקטור עם, למשל, גן עניין תחת שליטה של האמרגן מסוג pOp אותו ובכך מאפשר את ההערכה המהירה ההשלכות חריפה או לטווח ארוך של הביטוי אפקטור במגוון רחב של סוגי תאים.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול המתאר את ההליכים הדרושים כדי ליצור את השורות הנהג ואפקטור ומדגימים איך ביטוי ספציפי של סוג התא יכול להיות המושרה ועקבתי meristem apical את הצילומים, meristem apical את השורש, את cambium של תודרנית. כדי להמחיש את המיומנות וספציפיות של גישה זו, אנו מנצלים את הגורם תמלול ידועה VND7 המסוגל נהיגה thickenings קיר דמוי עצה משנית תא ectopically9. בטיפול F1 מן הכלאה בין את pSCR10,11 הנהג ובין pOp6:VND7 אפקטור הקו שמוביל היווצרות של תאים כמו עצה חוץ רחמי נדן עמילן בתאים של תודרנית גזע.

כדי להקל על הדור של מכלולים דנ א גדולים הנדרשים לבניית פלסמידים ביטוי אפקטור ונהג, השתמשנו GreenGate מהירה ויעילה שיבוט שיטה2. שיבוט של GreenGate בהתבסס על סוג II S אנזימי הגבלה כגון לסביבה31I או isoschizomer שלו, Bsaאני2. אנזימים אלה לחתוך במורד הזרם של אתרי זיהוי אסימטרי שלהם בהפקת המסוכך עם משתנה הרכב הבסיס. על ידי שילוב לסביבה31I /Bsaאני הגבלת אתרי oligonucleotides, הקצאת רצפי הסככה ספציפי לרכיבי ה-DNA, שיבוט מודולרי מושגת, להקל על הדור של מכלולים גדולים. במסגרת GreenGate, מודולי ה-DNA נחלקים קטגוריות ש-a-F המבוססת על רצף הסככה לשמש מתאמי, הם התאספו לפי הסדר הזה. לכן, צבעי יסוד שנועד להגביר את המוצר הרצוי צריך להיות בהתאם המודול שנבחר2 (איור 1 א'). אם יש פנימיים לסביבה31I /Bsaאני באתר ואת הרצף אינה תואמת מודולי כניסה והיעד של GreenGate, תמשיך ללא mutagenizing, אבל עם יעילות נמוכה יותר. לחלופין, השתמש מוטגנזה להסרת לסביבה31I /Bsaאני אתרי הגבלת מטפל לא לשינוי חומצות אמינו במוצרים ג'ין.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ניתן להשיג וקטורים ומודולים מהמאגר ללא כוונת רווח, Addgene (https://www.addgene.org).

1. שכפול באמצעות GreenGate

  1. עיצוב תחל באמצעות המסוכך על המפורטים בטבלה1 החלפת 'NNNN' עם מודול ספציפי סוג מתאם רצפי המפורטים להלן: קדימה: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 3´ רצף מסוים, הפוך: 5´AACA-GGTCTC-A-NNNN (n) + הפוך המשלים של רצף מסוים 3´. הוסף הבסיסים המסומן בקו תחתון כדי להבטיח תחזוקה של מסגרת הקריאה.
    מודול המסוכך:
    הערה: בתוך המסגרת GreenGate ברירת המחדל, שישה מודולים, A-F, מתלכדות עם שדרה וקטור של טרנספורמציה צמח ביטוי אחד פלסמיד (איור 1C). בדרך כלל, נחזיק מודול A יזם רצפים, B-מודול N-מסוף תג או "דמה" רצף6, C-מודול תקליטורים, תג D-מודול C-מסוף או דמה, E-מודול של סיים, F-מודול של קלטת ההתנגדות עבור מבחר הטרנסגניים צמחים. מתאם עבור צימוד עם יחידות אחרות preassembled זמינים לשימוש במקום מודול F2.
  2. PCR-הגברה
    1. להגביר את הרצף של עניין עם תחל תוכנן על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
    2. הפרד את המוצר PCR ג'ל agarose. בלו ועמודה לטהר את המקטע הנכונה בעזרת פרסומת קיט (ראה טבלה של חומרים) לפי הוראות היצרן.
  3. יצירת מודול כניסה
    1. בנפרד לעכל את הווקטור מודול, השבר PCR (שלב 1.2.) (איור 1 א', ב') עם אקו31I/Bsaאני משתמש 100-500 ננוגרם של DNA (וקטור או שבר), µL 3 10 x עיכול מאגר ו 5-10 U לסביבה31I צינור ולהביא את אמצעי האחסון µL 30 עם ddH2O.
    2. מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, ספין למטה בקצרה ב x 1000 g. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס על גוש חום למשך 15 דקות (או בעקבות ההמלצה זמן של האנזים הגבלת רכש).
    3. לאחר העיכול, עמודה לטהר כל דגימה באמצעות פרסומת קיט (ראה טבלה של חומרים) ולכמת את ה-DNA שהושג על-ידי קביעת הצפיפות האופטית ב-260 nm (OD260) באמצעות ספקטרופוטומטרים.
    4. לערבב ng 30 – 100 insert ו- 10 – 50 ng מתעכל וקטור על-ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים מתעכל דגירה עם 1 µL T4 ליגאז (U 5/µL, ו µL 3 10 x T4 מאגר מצדו של הנפח הכולל של 30 µL בטמפרטורת החדר עבור h 1 (בעקבות המלצות של הספק ליגאז T4) (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: לחישוב הווקטור מודול: היעד ערך יחס טוחנת הרצוי (למשל, 3:1) מצדו בהתאם ריכוז ואורך השרוול מודול כניסה.
    5. כדי להגביר את היעילות של טרנספורמציה, חום להשבית את ליגאז T4 מאת המקננת התגובה ב 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    6. שימוש במוצר מצדו להפוך המוסמכת e. coli תאים על פי פרוטוקולים מעבדה סטנדרטיים התפשטות החיידק על פלטות אגר בתוספת אמפיצילין (100 µg/mL)
    7. דגירה לצלחת עם חיידקים ב 37 מעלות צלזיוס נלון.
    8. מסך עבור מושבות עם מודול הרצויה על-ידי המושבה PCR שימוש תחל 86A1 (יונקות-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3′), 86A2 (יונקות-GTTTTCCCAGTCACGACG-3′) ו- PCR תנאים סטנדרטיים.
      הערה: שילוב פריימר זה תקף עבור כל המודולים ערך כפי תחל לאגד עמוד השדרה של וקטור כניסה.
    9. בחר אחת המושבות על הבידוד פלסמיד. 2 מ ל LB תרבית נוזלית בתוספת אמפיצילין (100 µg/mL) ולהשתמש דגירה בין לילה ב שייקר 37 º C.
    10. פלסמידים ולבודד מתרבות נוזלי לילה עם ערכת הכנה מיני או החילוץ הרצוי פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים).
    11. כדי לזהות פלסמידים עם תותב נכונה, לבצע ניתוח אנזים הגבלה, לדוגמה על-ידי בחירת שני אנזימים חותכים באופן ייחודי תוך הוספה שלך על ידי ערבוב 200 ng של פלסמיד, 2 µL 10 x עיכול מאגר, 5-10 U של נבחרת אנזימי הגבלה ו- ddH2 O כדי 20 µL.
    12. רצף של פלסמידים שנבחר באמצעות תחל 86A1 86A2 (ראה שלב 1.3.9.).
  4. יצירת מודול היעד:
    הערה: פלסמיד יעד לשימוש את היעד הרצויה מודול pGGZ001, pGGZ002 או pGGZ0032 (איור 1C).
    1. צינור מוסיפים ומערבבים 50 – 150 ng היעד ריק וקטור (pGGZ003, לדוגמה), 50-300 ng של כל אחד מילא כניסה מודול, 2 µL 10 x מאגר מאגר עיכול, µL 1.5 10 מ מ ATP, 1 µL T4 ליגאז (30 U/µL), 5-10 U µL Eco31I ו- dH2O כדי הנפח הכולל של 20 µl.
      הערה: לחשב יחס טוחנת הרצוי כניסה מודול: היעד וקטור (למשל 3:1) עבור מצדו בהתאם ריכוז ואורך השרוול מודול כניסה.
    2. לערבב ולבצע את התגובה GreenGate2 באמצעות thermocycler של ה-PCR לסירוגין 30 פעמים בין 37 º C למשך 5 דקות ו- 16 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו צעדים חד של 5 דקות ב 50 מעלות צלזיוס ו 5 דקות ב- 80 מעלות צלזיוס.
    3. כדי להגביר את היעילות, להוסיף 1 µL T4 ליגאז (U 30/µL) ו- 1.5 µL 10 מ מ ATP כדי התגובה דגירה לשעה בטמפרטורת החדר, ואחריו חום-איון של T4 DNA ליגאז ב 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    4. השתמש התגובה מצדו כדי להפוך המוסמכת e. coli ו להפיץ את החיידקים על פלטות אגר בתוספת את spectinomycin המתאים הסוכן סלקטיבית (50 µg/mL).
    5. דגירה של טרנספורמציה e. coli על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס נלון.
    6. כדי לאשר את השינוי, מחדש בעירום כל אחת המושבות בודד שנבחר על spectinomycin (µg 50/mL), אמפיצילין (100 µg/mL) המכיל לוחות, בהתאמה. השתמש רק מושבות לגדול על spectinomycin אך לא על צלחות אמפיצילין.
    7. דגירה המושבות e. coli בן לילה ב 37 º C.
    8. בחר אחת המושבות לבידוד פלסמיד. 2 מ ל LB תרבית נוזלית עם spectinomycin (µg 50/mL) ולהשתמש דגירה בין לילה-מטרף 37 º C.
    9. לבודד את פלסמידים המתאימה בעזרת ערכת הכנה מיני (ראה טבלה של חומרים).
    10. בדוק על-ידי אנזים הגבלה ניתוח (ראה 1.3.12.) ונבחר רצף חיובית בונה באמצעות תחל 88C 3 (יונקות-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3′), 88C 4 (יונקות-CCTTTTTACGGTTCCTG-3′). אם תותב לא יכול להיות וסודרו באופן מלא עם צבעי יסוד אלה, עיצוב פנימי צבעי יסוד רצף.
      הערה: כדי לזהות שיבוטים עם המספר הנכון של פופ חוזרים רצפים (ראה דיון), את תחל pOp6 (pOp6_F, יונקות-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3′; pOp6_R, יונקות-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3′) לאגד ב בקיצור איגוף רצפים יכול לשמש עבור הגברה PCR ואלקטרופורזה בג'ל עוקבות להפלות לפי גודל.
  5. יצירת supermodule ביניים
    1. כדי לשלב שתי קבוצות עצמאית של מודולי כניסה, כנדרש ליצירת GR-LhG4 נהג הקווים עם קלטת כתב משולב-אפקטור, הראשון לבנות שני ביניים פלסמידים, נקרא supermodules2, לפני הרכבת הביטוי האחרון פלסמיד pGGZ001 או pGGZ003.
    2. הקפד להוסיף מתאם F-H בסוף של supermodule הראשון ו- H-A מתאם בתחילת supermodule השני (אלה משמשים חיבורים בין שני המבנים) כפי שמתואר2.
      הערה: רק את המודול ביניים pGGN000 נושאת את הקלטת ההתנגדות. כדי להפיק את פלסמיד ביטוי, לבצע את התגובה GreenGate עם וקטור היעד, את pGGN000 ואת pGGM000 supermodules ביניים. לחלופין, מערבבים היעד וקטור pGGN000 supermodule ביניים, המודולים הנותרים יחיד כדי לבצע את התגובה של GreenGate2. השיטה השנייה היא פחות יעילה מאשר לשעבר אבל יכול להיות מהיר יותר.
    3. כדי ליצור supermodule pGGM000/pGGN000, לערבב 1.5 µL (100-300 ng/µL) של כל אחד מודולי כניסה עם 1 µL (30 ng/µL) ריק ביניים וקטור (pGGM000 או pGGN000), מאגר של מערכת העיכול 10 x µL 2, 1.5 µL 10 מ מ ATP, 1 µL T4 ליגאז (U 30/µL) , ו- 5-10 U לסביבה31I ב הנפח הכולל של 20 µL.
      הערה: לחישוב הווקטור מודול: היעד ערך יחס טוחנת הרצוי (למשל, 3:1) מצדו בהתאם ריכוז ואורך השרוול מודול כניסה
    4. לערבב ולבצע את התגובה GreenGate כמו שלב 1.4.2
    5. כדי להגביר את היעילות, להוסיף 1 µL ליגאז T4 ו- µL 1.5 ATP (10 מ מ), דגירה לשעה בטמפרטורת החדר, ואחריו חום-איון-65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    6. השתמש µL 10 התגובה מצדו כדי להפוך המוסמכת e. coli ו פס על צלחות המכיל kanamycin (50 µg/mL).
    7. מבצע לילה דגירה של טרנספורמציה e. coli על הצלחת ב 37 º C.
    8. מחדש בעירום כל המושבות בודד שנבחר על kanamycin (50 µg/mL), אמפיצילין (100 µg/mL) המכיל לוחות, בהתאמה.
    9. מבצע לילה דגירה של המושבות e. coli על הצלחת ב 37 º C.
    10. בחר אחת המושבות לגדול רק על kanamycin אך לא על אמפיצילין לבידוד פלסמיד. 2 מ ל LB תרבית נוזלית בתוספת kanamycin (50 µg/mL) ולהשתמש דגירה בין לילה ב שייקר 37 º C.
    11. בידוד פלסמידים המתאימים באמצעות הכנה המצומצמת של קיט (ראה טבלה של חומרים).
    12. בדוק את פלסמידים על-ידי אנזים הגבלה ניתוח (ראה 1.3.12). ואשר על ידי רצף באמצעות תחל 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) ו- 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) חישול לשדרת pGGM000/pGGN000. אם תותב לא יכול להיות וסודרו באופן מלא עם צבעי יסוד אלה, עיצוב פנימי צבעי יסוד רצף.
      הערה: אם שיבוט לתוך הווקטורים pGGM000 או pGGN000 אינה מצליחה, פתרון אפשרי אחד הוא כדי לעכל את pGGM000 או pGGN000 עם אקו31I, לרוץ על ג'ל לטהר מן הג'ל השבר של pGGM000 או pGGN000 עמוד השדרה (כ 2000 bp) בלי קלטת ccdB (בערך 1400 bp). לאחר מכן המשך בדרך כלל עם התגובה מצדו.
  6. להפוך זן pSOUP+ tumefaciens א (למשל ASE), כמו המקור pSa של שכפול (טאם אורי א.) ב- הווקטורים היעד דורשים את הנוכחות של המסייע פלסמיד pSOUP12. פס החוצה חיידקים על צלחות LB המכיל כלורמפניקול (34 µg/mL), kanamycin (50 µg/mL), spectinomycin (µg 50/mL), טטרציקלין (12.5 µg/mL). דגירה של טרנספורמציה tumefaciens א על הצלחת ב חממה 28 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים.

2. דור של הצמחים הטרנסגניים תודרנית

  1. טרנספורמציה של תודרנית לבנה.
    הערה: להפוך לבנה א צמחים לפי ג'אנג ואח ', 200613.
  2. מבחר של קווים מהונדס.
    1. כדי לבחור את הצמחים טרנספורמציה, להשתמש בערכה הבחירה להשתמש גבי-קט14 להתנגדות sulfadiazine15.
    2. כדי לבחור שורות יציב עם אירוע אפשרי שילוב יחיד, בחר באלה דור T2, המציגים את היחס של 3:1 סגרגציה ב דה מרקר ההתנגדות. הפץ שורות אלו לדור T3 ובחר את הצמחים homozygous עבור הגן ההתנגדות. לחלופין, לבצע ניתוח כתם הדרומי או תקן כמותי בזמן אמת PCR (SA-qPCR)16 כדי לבחור שורות ההכנסה יחיד.

3. אינדוקציה של טרנס-הפעלת בקווים הנהג תודרנית

  1. שורש
    1. כדי לבדוק ביטוי הכתב בשורות הנהג לבנה א שנוצר דרך שלבים 1 ו- 2, לעקר את הזרעים כמפורט להלן.
      1. להוסיף 0.5-1.0 מ"ל של 70% אתנול + ניקוי ללא יונית 0.01% כ-100 זרעים (20 מ ג) שפופרת התגובה 1.5 מ ל ו ' היפוך ' הצינור, כמה פעמים. ספין למטה ב- 1000 g x 15 s, לשאוב תגובת שיקוע.
      2. להוסיף 0.5-1.0 מ"ל אתנול מוחלטת. היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים, ספין למטה עבור 1,000 x g עבור 15 s ו להשליך תגובת שיקוע.
      3. להוסיף 0.5-1.0 מ"ל אתנול מוחלטת, ' היפוך ' ה-t tube מספר פעמים, ואז לסובב למטה ב 1,000 x g עבור 15 s ו להשליך תגובת שיקוע.
      4. לאפשר זרעים להתייבש בתוך המנוע. אם זרעים הולכים להיות מרובדת צינורות המשך לשלב 3.1.1.6.
      5. להוסיף 0.5-1.0 מ"ל ' היפוך ' הצינור והמים סטרילי, כמה פעמים. ספין למטה ב x 1000 g עבור 15 s ו להשליך תגובת שיקוע.
      6. להוסיף 0.5-1.0 מ"ל של מים סטריליים ' היפוך ' ברכבת התחתית מספר פעמים. ספין למטה ב x 1000 g עבור 15 s ו להשליך תגובת שיקוע.
      7. להוסיף 0.5-1.0 מ ל מים סטריליים.
    2. להכין בחצי כוח Murashige ו- Skoog בינוני, חומציות 5.8 ולהוסיף 0.9% צמח אגר ו 1% סוכרוז. לאחר autoclaving יוסיפו דקסמתזון (דקס), מומס דימתיל סולפוקסיד, כדי ריכוז סופי של 10-30 מיקרומטר, כדי לוחות השראה וכמות זהה של דימתיל סולפוקסיד ללוחות בקרה, בהתאמה.
    3. לשים זרעים עבור שורש הדמיה על צלחות, stratify אותם במשך 48 שעות החשיכה, קר (4 ° C).
    4. שים צלחות בצורה מאונכת ב חממה הצמח (יום ארוך (16/8 ח) 22 ° C, לחות, 65%) לגדל אותם למשך חמישה ימים.
    5. חמישה ימים לאחר נביטה (dag), תמונה את השתילים באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי.
  2. גזע
    1. לעקר את הזרעים כפי שמתואר 2.1.1. והניח זרעים על ½ MS, אגר צמח 0.9%, 1% סוכרוז צלחות. Stratify במשך 48 שעות החשיכה, קר (4 ° C).
    2. 6-7 ימים לאחר נביטה, להעביר את השתילים אדמה, כל צמח בתוך סיר יחיד (יום ארוך (16/8 ח) 22 ° C, לחות, 65%).
    3. זירוז הטרנס-הפעלת ב נובעת השקיה עם דקס או פתרון מדומה, או על ידי טבילה הצמחים דקס או פתרונות מעושה, בהתאמה.
    4. השקיה, השתמש מיקרומטר 25 דקס פתרון במים שהוכנו מלאי של 25 מ מ דקס מומס באתנול. מים כל 2-3 ימים עד הזמן המבוקש האינדוקציה.
    5. לטבילה, להכין את גביע 1 ליטר, 750 מ של מים המכילים silwet 0.02% L-77 עם מיקרומטר 25 דקס או כמות שוות ערך של דימתיל סולפוקסיד דקס ולטיפול מעושה, בהתאמה. טובלים צמחים יחיד עבור 30 s אינדוקציה או בכל פתרון מדומה. חזור על כל 2-3 ימים עד למועד הרצוי של הדמיה.
      הערה: לאחר טבילה, הצמחים לשמור על לחות למשך שעה אחת.
  3. לירות Apical Meristem (SAM)
    1. לעקר את הזרעים כפי שמתואר 2.1.1. הכנת לוחות עם ½ MS, אגר צמח 0.9%, 1% סוכרוז בינונית ולשים זרעים על צלחות. אחסן את הצלחות במשך יומיים החושך והקור של ריבוד.
    2. שים צלחות בצורה מאונכת ב חממה הצמח. 6-7 ימים לאחר נביטה, להעביר את השתילים האדמה, כל צמח בתוך סיר יחיד (יום ארוך (16/8 ח) 22 ° C, לחות, 65%).
    3. כאשר הגבעול הוא בסביבות 1 ס"מ (25-30 dag), לרסס התפרחת סם עם 10-50 מיקרומטר דקס H20 לובש מסיכת פנים. אינדוקציה, הדמיה בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות, זירוז סאמס של גבעולים ארוכים או יורה בצד.
      הערה: סאמס ניתן גם שנגזרות paintbrushing הפתרון דקס כדי למנוע ריסוס טיפות. להשתמש במסיכה כאשר דקס מוחל על ידי התזת שתן.
    4. h 24-48 לאחר אינדוקציה, לנתח סאמס והמשך הדמיה (ראה 4.3).
      הערה: רק האו ם המושרה צמחים שימשו עבור הפצת כדי להקטין את ההסתברות של ג'ין להחרשת. צמחים ב- T2/T3 שימשו עבור הדמיה.

4. הדמיה של הכתב ביטוי בקווים הנהג תודרנית .

  1. שורש
    1. להעביר שתילים צלחת פתרון יודיד (PI) propidium 10 µg/mL, נגד תכתים אותם במשך 5 דקות.
    2. למקם את השורשים מיקרוסקופ הדמיה קאמרית (1-ובכן תרביות רקמה קאמרית על מכסה הזכוכית II, ראה טבלה של חומרים) התמונה אותם באמצעות לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ עם 63 x המטרה טבילה במים סורק (ראה טבלה של חומרים).
    3. כדי להמחיש PI פלורסצנטיות, להשתמש של גל עירור של פליטה 488 ננומטר ולאסוף בין 590, 660 ננומטר. עבור mTurquoise2 קרינה פלואורסצנטית להשתמש עירור nm 458 ולאסוף פליטה בין השנים 460 ו 615 ננומטר.
  2. גזע
    1. לבצע ביד אופקי מקטעי גבעולים צמח עם סכין גילוח, excising קטע של 3 ס מ. לתקן את הגבעול עם האצבע בצד השני של המקטע הרצוי כדי לחתוך. לבצע מספר חתכים בסדר ברצף אך שים לב כי יש להשוות רק קטעים מתוך עמדה דומה בגזע.
    2. לאחר כל חתך, לטבול את מוריס בצלוחית המכילה מי ברז ולאסוף את הסעיפים גזע. כתם מקטעים בשלב זה או הר ישירות על שקופיות מיקרוסקופ.
    3. עבור צביעת, להכין של 1 מ"ל של µg/mL 250 של PI פתרון של מים בצלוחית קטנה (ראה טבלה של חומרים). לטבול את המקטעים עבור 5 דקות ולשטוף אותם במים. מעבירים שקופיות מיקרוסקופ עם מלקחיים בסדר או מברשת צבע יפה. לטפל כדי לא לסחוט את הדגימות עם coverslip.
    4. תמונה דגימות באמצעות לייזר קונפוקלי עם 25 x טובלים במים טבילה עדשה מיקרוסקופ סורק (ראה טבלה של חומרים). השתמש 561 ננומטר לייזר באור כדי לרגש PI פלורסצנטיות לאסוף מ- 570 620 ננומטר. שימוש 405 ננומטר לגרות את mTurquoise2 fluorophore אפקטור מקודד על ידי מנהל ההתקן קו בונה ולאסוף פליטה של 425 כדי 475 ננומטר.
  3. לירות Apical Meristem
    1. חותכים את הגבעול 2 ס מ מתחת לירות עם מלקחיים. החזיקו את הגבעול ביד אחת ולהשתמש מלקחיים בסדר כדי להסיר את ניצני פרחים גדולים primordia. כדי להסיר את primordia צעיר, לתקן את סאם בתנוחה זקופה לתוך צלחת פטרי המכיל 3% agarose. השתמש משקפת ומלקחיים כדי להסיר primordia הצעיר קרוב סאם. לחלופין, להשתמש בצינורית הזרקה של (ראה טבלה של חומרים) לחתוך את primordia האלה.
    2. מכתים את סאם ביתור בפתרון µg 250-מ/ל PI במשך 5-10 דקות לבצע צביעת ישירות על-ידי pipetting כמה טיפות של צביעת פתרון על גבי סאם מוכן או להעביר את הדגימה צינור מלא מכתים פתרון. שמור סאם שקוע לחלוטין במהלך ההליך מוכתמים.
    3. למקם את סאם מוכתם לתוך צלחת פטרי קטן (ראה טבלה של חומרים) עם 3% agarose בינונית ולכסות סם עם ddH2O.
    4. התמונה גזור סאמס באמצעות לייזר קונפוקלי מצויד של 25 x טובלים במים טבילה עדשה מיקרוסקופ סורק (ראה טבלה של חומרים).
    5. השתמש 561 ננומטר לייזר באור כדי לרגש PI פלורסצנטיות לאסוף מ- 570 620 ננומטר. שימוש 405 ננומטר לגרות את mTurquoise2 fluorophore ולאסוף הפליטה של 425 כדי 475 ננומטר.
      לתעד את אוספי תמונות פורש 50 מיקרומטר בכיוון z עם גודל צעד של 0.5 מיקרומטר.
      הערה: סאם הדמיה כפי שמתואר כאן דורשת סריקת מיקרוסקופ ו עדשה (כאן, מים טובלים עדשה) עם זמן ומרחק עבודה לייזר קונפוקלי זקוף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הדור של הנהג וקווים אפקטור באמצעות שיבוט GreenGate

GreenGate שכפול מערכת מבוססת על GoldenGate שיבוט ושימוש endonuclease ההגבלה IIS מסוג Bsaאני או isoschizomer שלו לסביבה31I. האנזים מייצר המסוכך על רחוק מאתר אסימטרי זיהוי שלו, הרכב המסוכך בסיס יכול להיות חופשי, שהיא הבסיס הנבחר טופס המ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, אנו מתארים את השלבים הנחוצים ליצור ולהחיל ערכת כלים מגוונים ומקיפים inducible, תא סוג ספציפי הטרנס-הפעלה. חציית קווים נושאת אפקטור קלטות תחת שליטה של האמרגן פופ עם הנהג קווים מאפשר ללמוד את ההשפעות ביטוי שגויה בדור F1, המאפשר להערכת ההפרעות גנטיות במגוון רחב של סוגי תאים מהירה. לח?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה במעבדות שלנו נתמך על ידי קרן מחקר גרמני (DFG) מענקים WO 1660/6-1 (לונדון), GR 2104/4-1 (ל. ת. ג), SFB1101 (לת. ג ו- J.U.L), על ידי המועצה האירופית מחקר הממזגת נכסי הענק (PLANTSTEMS 647148) לת. ג  ייגמר בתיקו נתמכת באמצעות אמי נתר אחוות DFG דרך גרנט WO 1660/2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinCarl Roth GmbH + Co. KGK029.1
ATPSigma-AldrichA9187
ChloramphenicolSigma-AldrichC1919
Column purificationQiagenQIAquick PCR Purification Kit (250)
Culture chamber for imagingSarstedt AG & Co. KG1-well tissue culture chamber, on cover glass II
DexamethasoneSigma-AldrichD4903
DMSOFisher Scientific, UKD139-1
Eco31IThermo Fisher ScientificFD0294
injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)Sterican, Braun
KanamycinCarl Roth GmbH + Co. KGT832.2
Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectivLeica, Wetzlar, Germany
MS mediumDuchefa, Haarlem, NetherlandsM0221.0050
Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x  1.1 NA water immersion objectiveNikon, Minato, Tokyo, Japan
Petri dish 35/10 mmGreiner Bio-One GmbH, Germany627102
Petri dish 60/150 mmGreiner Bio-One GmbH, Germany628102
Petri dish 120/120/17Greiner Bio-One GmbH, Germany688102
Plant agarDuchefa, Haarlem, NetherlandsP1001
Plasmid extractionQiagenQIAprep Spin Miniprep Kit
Propidium iodide (PI)Sigma-AldrichP4170
RazorbladeClassic, Wilkinson Sword GmbH7005115E
Reaction tubesSarstedt AG & Co. KG72.690.001
Silwet L-77Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany
SpectinomycinAppliChem GmbH3834.001
SpectrophotometerThermo Fisher ScientificNanoDrop 2000c
SucroseCarl Roth GmbH + Co. KG4621.1
SulfadiazineSigma-AldrichS6387
TetracyclineAppliChem GmbH2228.0025
T4 Ligase 5 U/µlThermo Fisher ScientificEL0011
T4 Ligase 30 U/µlThermo Fisher ScientificEL0013

References

  1. Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
  2. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043(2013).
  3. Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
  4. Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
  5. Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
  6. Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
  7. Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
  8. Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
  9. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
  10. Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
  11. Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
  12. Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
  13. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
  14. Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
  15. GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. , Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018).
  16. Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489(2013).
  17. Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
  18. Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
  19. Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
  20. Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
  21. Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9(2005).
  22. Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
  23. Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

146inducible

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved